JPH11508564A

JPH11508564A - 合成ｎ−結合グリココンジュゲートを製造するための方法

Info

Publication number: JPH11508564A
Application number: JP9504667A
Authority: JP
Inventors: プラサド，エー，ブイ，クリシナ; シー．リチャーズ，ジェイムス
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-06-28
Publication date: 1999-07-27
Also published as: US5668272A; AU6184896A; WO1997002277A2; WO1997002277A3; EP0837869A2

Abstract

(57)【要約】 −NH₂又は−NHNH₂基を含む求核試薬とのグリコシル−１−アミンのアミノ基転移反応は、１−アミノ基の置換により広範囲のグリココンジュゲートを調製するために用いられる。その置換反応は、先行技術の還元的アミノ化反応のように糖の環構造に悪影響を与えない。適切な求核試薬は、発色団基、発蛍光団基、化学発光基、脂質、アミノ酸もしくはペプチド成分、ビオチン、薬剤及びリンカー／スペーサー基並びにアフィニティーラベルを有する求核試薬である。求核試薬に対するグリコシル−１−アミンの比は、重量で約１：１〜約１：２の範囲である。

Description

【発明の詳細な説明】合成Ｎ−結合グリココンジュゲートを製造するための方法発明の分野本発明は、合成Ｎ−結合グリココンジュゲートに、特に球核試薬とのグリコシル−１−アミンの反応によりＮ−結合グリココンジュゲートを合成するための方法に関する。発明の背景天然の糖タンパク質及び糖脂質中のタンパク質及び脂質に結合した炭水化物成分は、いくつかの生物活性、例えば細胞培養、微生物感染、受精、癌転移及び細胞内輸送において顕著な役割を演ずる。それゆえ、例えば糖の還元端における発色団、発蛍光団又は放射性同位体とのコンジュゲーションによりオリゴサッカリド誘導体を調製することにより、これらの炭水化物成分を研究することが役立つ。オリゴサッカリドの化学修飾により誘導されたグリココンジュゲートプローブは構造分析及び生物学的機能の解明のための強力な道具であるばかりでなく、コンジュゲートワクチンの開発、臨床診断及び治療にも役立ち得る。発色団及び蛍光グリココンジュゲートのための適用は例えばHPLC、キャピラリー電気泳動及びポリアクリルアミドゲルでの分解による、炭水化物分析、並びにグリコシルトランスフェラーゼ及び糖タンパク質処理酵素を用いる研究のための基質としての炭水化物分析を含む。ネオ糖脂質は、オリゴサッカリドを認識することが知られている精製されたレセプターでのTLCプレートのプロービングに並びに免疫調節剤としての糖脂質アナログ(G LAS)として役立つ。化学発光誘導体は、化学発光ベースのイムノアッセイに役立つ。グリココンジュゲートプローブは、固相システムにおける固定化された糖として、アビジンでの安定な多価複合体の形成のためのビオチンの誘導体として、ネオ糖ペプチド、ネオ糖タンパク質として、診断試薬における特異的に結合する分子として、そしてポリサッカリド−コンジュゲートワクチンとしても役立つ。グリココンジュゲートプローブのための多数の適用は、化学反応における重要な調査及びオリゴサッリドの修飾のためのカップリング方法を示唆している。グリココンジュゲートの合成のためのいくつかの周知の方法がある（Lee，Y．C.ら(Glycoconjugates: Composition Structure and Function H．J．Allen & E．C ．Kisaulis，eds; Dekker，New York; 121; 1992)）。例えば、還元的アミノ化、オリゴサッカリドの還元末端がタンパク質のアミノ基と反応してシッフアダクトを形成するグリココンジュゲートの調製のための広く用いられる技術である。次のそのシッフアダクトはナトリウムシアノボロヒドリドで還元されて糖のアルデヒド形態と第１アミンとの間に共有結合を形成する。還元的アミノ化は、ネオ糖タンパク質（Gray，G．R．Arch Biochem Biophys 1 63: 426; 1974)及び蛍光コンジュゲート（Hase，S.らJ ．Biochem 85: 995; 1979 ）の合成のために用いられている。しかしながら、還元的アミノ化は、生体内研究について炭水化物成分の生物活性又は免疫原性に悪影響を与え得るピラノース残基の開環のため、還元端モノサッカリドのデグラデーションを生ずる(Kamicker，B．S．らArch Biochem Biophy s 183: 393; 1977)。その反応時間は、その糖が非経済的で大量のサンプル洗浄手順を要求する極めて過剰量存在する場合でさえ、極めて遅く、典型的には多くの日数がかかる。更に、結果として生ずるこれらのコンジュゲートの第２アンモニウム結合及び非環式環は、不要な影響をもたらし得、それは高度に特異的な抗炭水化物抗体が要求されるオリゴサッカリドハプテンを含む免疫原を調製するためのこの方法の疑わしい使用となる(Danielson，S．JらGlycocon jugate J 3: 363; 1986)。グリカン残基の一体性が、グリココンジュゲートの調製を導くいずれかの修飾の間に、最小の摂動を被ることは生物学的研究につて重要であることが当業者に認められよう。合成のための他の方法は、還元糖が、強酸性条件下で２−アミノピリジンと直接縮合することにより、蛍光的に標識される、２−アミノピリジンでの直接的蛍光ラベリングによる（Her，G．R らJ Carb Chem 6: 129; 1987）。しかしながら、その収率は低く、その反応はゆっくりで酸性条件過剰な試薬及び高温を要求する。これらの条件は、褐変反応による炭水化物のデグラデーションのため、副産物の形成を促進する。 Risley，J．M．ら（WO88/04323，1988年６月16日）は、グリコシルアミンの１ −アミノ官能基の直接的誘導化のための方法を記載する。１−アミノ−１−デオキシオリゴサッカリドは、β−アスパラチルグリコシルアミンアミドヒドロラーゼを用いてグリコペプチド又はグリコプロテインから調製される。次に結果として生ずる１−アミノ−１−デオキシオリゴサッカリドはアルカリ性又は中性pHで酸塩化物又は酸無水物のような反応性アシル誘導体と反応させられる。その反応は、１−アミノ官能基においておこる。しかしながら、酸塩化物は極めて反応性の高い種であり、糖ヒドロキシル基のＯ−アシル化がおこり得る。 Manger，I．D．ら（カナダ特許出願番号2,023,339; 1991年２月17日発行及びカナダ特許出願番号2,080,502; 1993年４月16日発行）は、オリゴサッカリドのグリコシルアミン誘導体を中間体化合物としてハロアセチル化誘導体に転化することにより、オリゴサッカリドを誘導して合成Ｎ−結合グリココンジュゲートを形成する方法を開示する。次のクロロアセトアミド官能基のアンモノリシスは、Ｎ−結合グリココンジュゲートを合成するために用いられる対応する１−Ｎ−グリシル−β−誘導体を生成する。そのハロアセチル化反応は、過剰な典型的には５〜10倍の無水クロロ酢酸とのグリコシルアミンの反応により行われる。上述の方法は、還元端糖を分解する還元的アミノ化方法と違い、オリゴサッカリドの還元端糖のピラノース形態を保護する。しかしながら、両方の方法は、１ −アミノ基の乏しい求核性並びに二量化及び加水分解に向かうグリコシルアミンの傾向のため、制御することができず、制御が困難である過程である１−アミノ官能基の直接的官能化に関する。１−アミノ(_pＫ_a＝5.2)及び２−アミノ_pＫ_a＝7 .7)官能基の塩基性の比較は、求核試薬としての１−アミノ基の乏しい利用性を示唆する。無水酢酸及び無水クロロ酢酸のような小さな求電子試薬がより優れた様式で反応する場合でさえ、過剰な試薬、例えば10倍過剰なＮ−アセチル化試薬の使用がMangerらの方法において必要とされる。上述の先行技術の方法の主な欠点は、それらが過剰な試薬又は多重ステップの手順のいずれかの使用を要求することである。これらは、天然のグリココンジュゲートから小量の生物学的に重要なオリゴサッカリドを処理する場合に大きな欠点である。グリココンジュゲート誘導体のための多くの適用の点で、本発明の目的は、先行技術の欠点を克服するオリゴサッカリド誘導体を製造するための方法を提供することである。発明の概要本発明によれば、Ｎ−結合グリココンジュゲートを合成するための方法であって、１−アミノ官能基の置換により、求核置換を好む条件下で、求核試薬とグリコシル−１−アミンを反応させることを含む方法を提供する。図面の簡単な記載以下の図面は、本発明の実施形態を詳説する。図１，２及び３は、本発明の方法に従ういくつかの発色団及び発蛍光団標識と接合した合成Ｎ−結合グリココンジュゲートの調製を示す反応スキームである。図４は、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＮ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースの１−アミノ誘導体とのダンシルヒドラジン（HD）の反応から得られた合成Ｎ−結合グリココンジュゲートを含む混合物の逆相HPLC溶出プロフィールのクロマトグラムである（図１の反応生成物２及び３）。図５は、１−アミノ−１−デオキシ−マルトース及び１−アミノ−１−デオキシ−マルトオリゴサッリドからの、いくつかの発色団及び発蛍光団標識と接合した合成Ｎ−結合グリココンジュゲートの調製を示す反応スキームである。図６Ａは、オリゴヌクレオチド−１−アミンの出発材料混合物の対照標準負イオンエレクトロスプレーマススペクトルである。図６Ｂは、本発明による、図６Ａの出発材料からの、Ｎ−ダンシルヒドラジン（HD）と接合した合成Ｎ−結合グリココンジュゲートの調製を確認する負イオンエレクトロスプレーマススペクトルである。図６Ｃは、本発明による、図６Ａの出発材料からのヒドロクロライドとして観察された合成Ｎ−フタラジン−置換グルコシルヒドラジン（HP）の調製を確認する負イオンエレクトロスプレーマススペクトルである。図７は、ダンシルヒドラジンとのＧ₃−Ｇ₇マルトオリゴサッカリドの混合物のグリコシル−１−アミン誘導体の反応から生ずる生成物（20）の逆相キャピラリーHPLC（Ｃ₁₈）溶出プロフィールを示すグラフである。図８Ａ，８Ｂ，８Ｃ及び８Ｄは、各々トリサッカリド、テトラサッカリド、ペンタサッカリド及びヘキササッカリドについての１−アミノ−１−デオキシ−マルトオリゴサッカリドとのダンシルヒドラジン（HD）の反応混合物から得られたＮ−ダンシルヒドラジン結合オリゴサッカリドコンジュゲートのBIOGEL Ｐ−２^TM クロマトグラフィーの精製画分の負イオンエレクトロスプレーマススペクトルを示す。図９は、本発明による、化学発光標識及び糖脂質と接合した合成Ｎ−結合グリココンジュゲートの調製を示す反応スキームである。図10は、本発明による、ネオ糖脂質（30）の調製を確認する負イオンFABマススペクトルである。図11は、本発明による、各々リシンのε−アミノ基、ビオチンヒドラジド及び γ−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタールとのグリコシル−１−アミンの反応を示す反応スキームである。好ましい実施形態の詳細な記載上述のように、グリコシル−１−アミンは、直ちに加水分解し、非環式アンモニウム（immonium）イオン中間体を通しての“トランスアミノ化”による２分子の自己縮合により二量化する傾向がある（Isbell，H．SらJ ．Org．Chem．23: 13 09; 1958; Bolton，C．H．らBiochem J 101: 184; 1966）。従って、先行技術における求核試薬としての１−アミノ官能基の使用は、グリココンジュゲートの合成のために効果のない経路である。本発明者らは、炭水化物分析、ミクロン−ケンシング、イムノアッセイ及び生物認識研究に役立つ広範囲のグリココンジュゲートプローブを調製するためのグリコシル−１−アミンのこの不安定性を利用することができることを発見した。不安定なグリコシル−１−アミンの二量化過程が、求核置換反応を促進する条件下でグリコシル−１−アミン基より強力である求核試薬の存在下で抑制され得ることが本発明者らにより発見された。本発明によれば、グリコシル−１−アミンは、１−アミノ基の置換による糖のＣ₁における求核試薬との反応により調製される。１−アミノ基自体は、Risley 及びMangerの先の方法におけるものとして修飾されない。一般的反応スキームを以下に示す。（式中、ＸはOH又はNHAcを表す）本発明に用いられるグリコシル−１−アミンは、還元端を有するいずれかのモノサッカリド及び還元端モノサッカリドを有するいずれかのオリゴサッカリドを含む。そのオリゴサッカリドは、微生物、植物又は動物源から得られた糖タンパク質又は糖脂質から得ることができ、そして例えばＮ−グリカナーゼ、エンド− Ｆもしくはエンド−Ｈ酵素のようなエンドグリコシダーゼを用いる慣用的酵素技術により、又は例えばヒドラジノリシスによる当業者に周知である化学的技術により、遊離され得る。グリコシルアミンの合成について当業者に周知であるいくつかの方法がある。重炭酸アンモニウムとの遊離還元性モノサッカリドの直接的縮合によるアミノ糖β−グリコシルアミンの一段階合成が、Likhosherstov，L．M.ら(C arbohydr Res 146: c1; 1986)に記載される。グリコシルアジドを通してのβ− グリコシルアミンの合成は、いくつかのステップを含む（Spinola，MらJ ．Biol ．Chem 245: 4158; 1990; Cowley，D．E.らCarbohydr Res 19: 231; 1971; Dun stan，D．らCarbohydr Res 25: 246; 1970: Nakabayashi，SらCarbohydr Res 1 74: 279; 1988及びPaul，B.らCarbohydr Res 80: 99;1980）。Isbellら(J ．Org ．Chem. 23: 1309; 1958)は、アンモニア及び１級アミンとの遊離還元性モノサッカリドの反応を記載する。Asn-結合オリゴサッカリドを含む糖ペプチド又は糖タンパク質から１−アミノ−１−デオキシオリゴサッカリドを得るための酵素的手順がWO88/04323に記載される。安定な１−アミノ−デオキシ糖は、グルコース、マンノース、フコース、ガラクトース、セロビオース、ラクトース、Ｎ，Ｎ−ジアセチルキトビオース及びＮ −アセチルラクトサミンから得られる。本発明による合成グリココンジュゲートの調製に用いるための求核試薬の例は、発色団基、発蛍光団基、化学発光基、脂質、アミノ酸もしくはペプチド成分、リンカー／スペーサー基、ビオチン基、又はアフィニティーラベルを有する求核試薬である。好ましくは、求核試薬は−NH₂又は−NHNH₂基を有する。発色団又は発蛍光団基を有する求核試薬の例は、置換化脂肪族及び芳香族アミン、ヒドラジン及びベンジルアミン、例えばダンシルヒドラジン、１−ヒドラジノフタラジン、９−フルオレンアミン、イソニコチン酸ヒドラジン、２−ヒドラジンピリジン、及び４−アミノ−４′−ジメチルアミノアゾベンゼンである。化学発光基の例は、ルミノール及びそのアナログ、例えばＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノールである。適切な脂質求核基は、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジヘキサデシルグルセロホスホエタノールアミン、ｎ−テトラデシルアミン、ｎ−オクチルアミン及びシクロヘキシルアミンである。他の求核試薬は、リシン基を有するペプチド、例えばＬ−リシルリシン及びBo c-Lys-Ome、及びビオチンヒドラジンである。その求核試薬は、リンカー／スペーサー基、例えばγ−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール及び１−Ｎ− （９−フルオレノメトキシカルボニル）−６−ジアミノ−ヘキサンも供し得る。求核試薬は、イソニコチン酸ヒドラジン−サッカリドコンジュゲートを形成するためにイソニコチン酸ヒドラジドでもあり得る。上述の先行技術の方法と対照的に、求核置換を行うためにかなりの過剰量の試薬を供する必要はない。本発明によれば、求核試薬に対するグリコシルアミンの比が重量で約１：１〜約１：２の範囲である場合に優れた割合で反応が進行する。より多くの過剰量を用いることができるが、このような過剰量は非経済的であり、より多くの洗浄が必要とされる。その反応は、求核置換を好む温度で行われる。例えば、その反応は、約50℃の温度で行うことができる。その反応は、ピリジン、DMSO及びDMFのような非プロトン溶媒の存在下で行われる。本発明のアミノ基転移反応の平均収率は、典型的には、出発１−アミノ糖に基づいて約65〜75％の範囲である。本発明によれば、グリココンジュゲートは、グリコシル−１−アミン段階から１段階で調製される。これは、誘導体が３段階で調製されるMangerらの技術より優れた明らかな利点を示す。本発明の他の利点は実質的に過剰な試薬についての必要性が避けられることである。更に、還元端糖は、求核試薬でのラベリングの間に分解されない。 ¹Ｈ−NMR分析による本発明のアミノ基転移反応の生成物の分析は、その重要生成物がその平衡を支配する傾向にある糖の環式形態である。これは環式形態からのみ利用できるアノマープロトンを表す特徴的な化学シフト及びカップリング定数(β−Ｈについてδ＝4.3〜4.7 ppm，J＝8.0〜9.0Hz及びα−Ｈについてδ＝5. 2 ppm，Ｊ＝3.8)によって支持される。本発明のアミノ基転移反応を用いて広範囲のグリココンジュゲートプローブが合成される。その反応に高感度検出のための発色団及び発蛍光団基の結合、並びにLC，HPLC，LC-MS及びキャピラリー電気泳動を用いる炭水化物分析のためのオリゴサッカリドの混合物の精製及び定量を許容する。これは、異なるサイズのモデルサッカリドで上手くいくことが証明されている。脂質成分の結合は、ネオ糖脂質を作り出し、その潜在的な適用は、免疫調節剤、並びに炭水化物結合タンパク質のための抗原及びリガンドとして糖タンパク質及びプロテオグリカンから遊離される個々のＮ−及びＯ−結合オリゴサッカリド種を評価するためにオリゴヌクレオチドに結合することが知られている精製されたレセプターでのTLCプレートのプロービングを含む。本発明の反応によって形成されたネオ糖脂質は、マススペクトルにおける例外的なイオン化のため、及びそれらは遊離オリゴサッカリドより大きな感度で検出することができるため、ミクロシーケンシングとしても役立つ。発蛍光団基を含むグリココンジュゲートは、グリコシルトランスフェラーゼ活性アッセイのため、及び蛍光顕微鏡等による細胞表面炭水化物結合性高分子分析のための生物認識の適用における適用を有する。本発明により調製された合成Ｎ−結合グリココンジュゲートは、HPLC（逆相）、キヤピラリーHPLC及び質量分析（FAB及びエレクトロスプレー）によって直ちに検出される。化学発光標識で標識された炭水化物リガンドは、試断試薬のような適用の可能性があることが見い出され得る。本発明により作られた化学発光プローブは安定であり、イムノアッセイを改良するために及び生物学的に活性な特異活性標識が要求される他の生化学的及び組織学的適用のためにバルクにおいて形成され得る。他の適用には、タンパク質及び固相支持体を含む種々の群のコンジュゲーション、及び糖アミノ酸及び糖ペプチドの形成のためのリンカー／スペーサーの結合を含む。本発明のアミノ基転移反応の範囲は、還元末端糖残基を含むいずれかの炭水化物が広範囲のグリココンジュゲートプローブの形成のために官能化され得る一般的利用のものである。このルートは、安価な試薬並びに容易にアクセスできる装置及び分離手順を用いる通常天然のソースからの糖タンパク質及び他のグリココンジュゲートから得られる通常少量で利用できるオリゴサッカリドの迅速、有効かつセンシティブなカップリング、精製及びキャラクタリゼーションのための包括的かつ融通性あるストラテジを供する。その方法は、還元端モノサッカリド残基を有する他のオリゴサッカリドに広げることができる。この技術を用いて、治療的プロフィール又は吸収を改良するためにグリココンジュゲートを合成する点で、インヒビター（例えば抗生物質）のような生物学的に活性な炭水化物のグリコシドの酸素が窒素原子により置換されている糖類似化合物を合成することも可能である。以下の実施例は本発明を詳説する。実施例１発色団及び発蛍光団標識でのオリゴサッカリドの官能化本発明のアミノ基転移反応の実用性は、発色団及び発蛍光団基を有する一連の求核試薬、例えばダンシルヒドラジン、１−ヒドラジノフタラジン、９−フルオレンアミン、イソニコチン酸ヒドラジン及び２−ヒドラジノピリジンとの１−アミノ−２−アセトアミド−１，２−ジデオキシ−β−Ｄ−グルコピラノースの反応により証明した。グリコシルアミン及び重量で１〜２倍過剰な求核試薬を含む反応混合物を、50℃でピリジン下で一晩反応させた。その反応はTLC（CHCl₃：Me OH，１：１）によりモニターした。その溶媒を除去して、その反応混合物をBIOB EADS SM-２^TM（BioRed，Richmond，California）に通した。未反応の糖を必要に応じて、検出として254mmの吸光度を用いてBIOGEL−Ｐ２^TM（BioRed，Richmond ，California）のカラムを通すことにより分離した。その生成物をシリカゲルでのTLC，FAB又は質量分析及び¹Ｈ−NMR分析によりキャラクタライズした。アミノ基転移反応は、（未置換のグリコシル−１−アミンのアノマープロトンと関係する）δ＝4.1ppmからδ＝4.3〜4.7ppmへの共鳴のダウンフィールドシフトにより示された。後者の化学シフトは、合成グリココンジュゲートのβ−アノマーと関連する。実施例２発色団及び発蛍光団標識を含むグリココンジュゲートを、図１，２及び３に示されるグルコース、マンノース、フコース、ガラクトース、セロビオース、ラクトース、Ｎ，Ｎ−ジアセチルキトビオース及びＮ−アセチルラクトサミンから得た他の１−アミノ−１−デオキシ−糖から得た。それらのグリココンジュゲートは、実施例１に記載されるように調製した。グリココンジュゲートの純度は、SPHERISORB^TMＣ₁₈（５μｍ）カラム(I.D．30 0μｍ)(Alltech，Deerfield，Illinois)で確認した。逆相HPLCによる反応生成物２及び３（図１）の混合物の分離を示す代表的なクロマトグラムを、CH₃CNの20 ％水溶液中で図４に示す（無勾配モード）。実施例３その反応は、ダンシルヒドラジン、１−ヒドラジノフタラジン、及び２−ヒドラジノピリジンを含む発色団−及び発蛍光団−置換したヒドラジンとの、１〜８サッカリド残基を有する１−アミノ−１−デオキシ−マルトオリゴサッカリドの反応により示される図５に要約されるオリゴサッカリドコンジュゲートの合成のためにも適用できる。その反応は実施例１に記載されるように行った。合成Ｎ−結合グリココンジュゲートの調製を、エレクトロスプレ−質量分析により確認した。図６Ａ，６Ｂ及び６Ｃは、各々ダンシルヒドラジン（HD）及び１ −ヒドラジノフタラジンヒドロクロライド（HP）との、Ｇ₃＝28％，Ｇ₄＝16％，Ｇ₅＝38％，Ｇ₆＝14％，Ｇ₇＝１％，Ｇ₈＝0.5％（式中、Ｇ_nはグルコース残基の質を表す）から構成される１−アミノ−１−デオキシ−マルトオリゴサッカリドの標準混合物の反応の生成物により得られた負イオンエレクトロスプレーマススペクトルである。図６Ａは、出発材料（１−アミノマルトオリゴサッカリド）の分子量を示し、そして図６Ｂは、ダンシル標識での誘導化後の１−アミノオリゴサッカリドの分子量を示す。同様に、図６Ｃは、（ヒドロクロライドとして観察された）ヒドラジンでの誘導化後の１−アミノマルトオリゴサッカリドの分子量を示す。発色団及び発蛍光団標識の結合の成功は、液体クロマトグラフィーベースのシステムにおけるセンシティブな検出及び分離のための有効なストラテジーを供する。個々の残基がG1c−α−１→４−G1c結合により連結されているマルトオリゴサッカリドの場合、そのグリココンジュゲート生成物は、排他的にα−グリコシルアミン形状を有するとキャラクタライズされた。アセトニトリル及び水の勾配を用いたキャピラリーHPLC（Ｃ₁₈）カラムでのダンシルヒドラジン置換された１−アミノ−１−デオキシ−マルトオリゴサッカリド（Ｇ₃〜Ｇ₇）の混合物の分離を示す代表的なクロマトグラムを図７に示す。このストラテジーの結果として、８までのサッカリド単位を有するオリゴサッカリドは、キャピラリーHPLC（Ｃ₁₈）により検出される発色団及び発蛍光団標識で官能化された。これは、BIOGEL Ｐ−２^TM精製した１−Ｎ−ダンシルヒドラジン置換−１−デオキシ−マルトオリゴサッカリドの個々のエレクトロスプレーマススペクトル（図８Ａ，８Ｂ，８Ｃ及び８Ｄ）により支持される。接合したオリゴサッカリド約100pmolの検出が、254nmでの吸光度ディテクターを用いるキャピラリーHPLCシステムで可能である。UVモニターと比較して検出限界が広い蛍光モニターを用いることにより、その感度レベルは数培増強することができた。ホウ酸複合体としてキャピラリー電気泳動により、ダンシルヒドラジン置換サッカリドも検出し、それによりフェムトモーラー量の糖が検出され、分離された。それゆえ、その接合したオリゴサッカリドは、糖生成物の利用性が限定されているグリコシルトランスフェラーゼアッセイ研究における基質としても機能し得る(Zhao，J．Y．らGlycobiology 4: 239; 1994)。更に、これらの疎水性の尾は、質量分析測定の間にマトリックスの表面活性を促進する。第２級アミン官能基の存在は、分子量及びオリゴサッカリド配列についての価値ある情報を抽出するために役立つ特徴的なフラグメンテーションパターンを誘導するプロトン化のための部位として機能する(Webb，J．W．らAnal Biochem 169: 337; 1988; John，C．M.らAnal Biochem 187; 281; 1990 )。実施例１，２及び３のデータは、種々の発色団及び発蛍光団標識でのオリゴサッカリドの官能化及び次のHPLC、キャピラリーHPLC及びキャピラリー電気泳動を含む液体クロマトグラフィーシステムを用いるセンシティブな検出、精製及びキャラクタリゼーションのための有効なストラテジーとしての本発明の有用性を更に支持する。更に、発色団及び発蛍光団が接合したオリゴサッカリドが、キャピラリーHPLC及び質量分析（FAB及びエレクトロスプレー（electrospray）の両方により検出することができたことは、LC−MS（液体クロマトグラフィー−質量分析）検出ストラテジーが上述の研究から得られた結果に基づいて構築され得たことを示す。更に、この反応に組織病理学において内在性糖レセプターを検出するめに有効な道具として機能するサッカリドへの蛍光プローブの結合のための一般的ルートを供する（Gabjus，H．J．らLectins and Glycoconjugates in Oncolog y Springer-Verlag，N.Y.，1988）。本発明によれば、発色団及び発蛍光団標識の適切な選択は、グリコシル−１−アミンと直ちに反応することが示されている一連の試薬からの合成Ｎ−結合グリココンジュゲートの高収率での生成のために行うことができる。実施例４微生物感染（Karlsson，K．A．An Rev Biochem 58: 309; 1989）及び哺乳動物細胞−細胞接着(Feizi，T．Curr Opinion in Structural Biol 3: 701; 1993) のようなレセプター媒介性の出来事における炭水化物複合体の示される重要性の点で、炭水化物結合性タンパク質に関係する生化学的アッセイは、特別の誘因に値する。化学発光ベースのアッセイは、他の慣用的なタンパク質結合アッセイ、例えば放射能標識に基づくアッセイに優るいくつかの利点を供する（campbell，A．K．らMeth ods Biochem Anal D．Click ed; 31: 317; 1985）。放射能標識は不安定で危険で廃棄物処理問題で困らせ、そしてインキュベーション及び計数に長時間を要す。センシティビティーの点で、化学発光は、生化学的及び生物医学的分析に著しいインパクトを与えている（Van Dyke，K．Bioluminescence and Chemiluminesc ence: Instrument and Applications CRC Press，1985）。化学発光ベースのアッセイは数分しかかからず、自動化する余地があり、そして分光光度測定（マイクロモルからナノモルの範囲の感度）及び蛍光測定アッセイ（ナノモルからピコモルの範囲の感度）と違い、フェムトモルからアットモルの範囲にある。ルミノール及びその構造的アナログ、例えばＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール（ABEI）は、最も広範囲で研究されている化学発光標識である（Av igliano,L らAnal Biochem 159: 67; 1986，Roswell，D．F.らMethods Enzymol 57: 409; 1978）。そられはHPLCにおける（Kawasaki，T.らJ ．Chem 328: 121; 1985; Imai，K．Methods Enzymol 133: 435; 1986）及び化学発光ベースのイムノアッセイにおける高感度検出のための標識化試薬として役立つ。しかしながら、炭水化物成分への化学発光標識のマンジュゲーションの先行技術の方法は、その還元端サッカリド残基に悪影響を与える。化学発光標識を含むグリココンジュゲートの合成は、本発明による、Ｎ−（４ −アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノールとの１−アミノ−２−アセトアミド−１，２−ジデオキシ−β−Ｄ−グルコピラノースの反応（図９の反応28）により証明される。その反応は実施例１に記載されるように行った。本方法は、還元端モノサッカリド残基を有する他のオリゴサッカリドに広げることができる。結果として、化学発光標識で標識された炭水化物リガンドは、診断試薬のような適用の可能性が見い出され得る。実施例５ネオ糖脂質の合成グリカン成分の脂質残基への合成的結合は、それらの物理的及び生物的特性において劇的な変化を示すことが示されている。長鎖アルキルアミン及び脂肪酸残基を有する合成グルコシルアミドは、著しい免疫剌激活性を示すことが示されている（Lockhoff，O. Angen Chem Int ．Ed．Engl 30: 1611; 1991）。Ｎ−アルキル−Ｎ−グルコシル脂肪酸アミドは、免疫学的テストシステムにおいて抗体の生産を増強することが示されている。それらの作用の特有のモードは、周知のアジュバントと異なることが示されており、Ｔ−リンパ球機能不全の患者、例えばAI DS患者の免疫化のための価値ある候補としてそれ自体供する。ワクチンの開発における有効なストラテジーの１つは、免疫調節であり、グルコシルアミドはこの顕著な特性を有することが示されていることから、先のものの合成のための中間体であるネオ糖脂質の合成は特に関心あるものである。ネオ糖脂質は、標的化薬剤デリバリーのためにデザインされたリポソームをコートし、それを形成するためにオリゴヌクレオチドを認識することが知られている精製されたレセプターでTLCプレートをプローブするのに役立つことが示されている（Tang，P.U.ら Biochem Biophys Res Commun. 132: 474; 1985; Childs ，R．A.らBiochem 262: 131; 1989）。これにより、天然のソースから得られたオリゴサッカリドは、生物学的システムにおける認識メーカーとしてのサッカリドの役割を証明するためにジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンのような脂質に結合されている(Feizi，T．らMethods Enzyn ol 230 484; 1994; Bezouska，K.ら Nature 373: 150; 1994; Pohlentz，G らE ur J ．Biochem 203: 387; 1992)。しかしながら、先に示されるように、この技術は、還元性のサッカリド残基の一体性に悪影響を与える還元的アミノ化手順を利用する。従って還元端糖残基の一体性を維持する方法の必要性がある。還元端におけるピラノース環の完全性を維持することが上手く達成されることを証明するために、実施例１の反応に従って、図９の反応29〜34に従ってグルココンジュゲートを調製した。各々の糖脂質誘導体（32及び33）を供する、１−アミノ−１−デオキシ−Ｎ，Ｎ−ジアセチルキトビオースのＬ−１，２−ジパルミトイル−Sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンとの反応により、並びにｎ −テトラデシルアミン及びｎ−オクチルアミンとの１−アミノ−２−アセトアミド−１，２−ジデオキシ−β−Ｄ−グルコビラノースの反応によりネオ糖脂質を形成した。後者は、Ｏ−グリコシド及び膜タンパク質に関する研究における一般的な界面活性剤であるオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドのアザーアナログである。それらは、潜在的な免疫調節剤として役立つグリコシルアミドの合成のための価値ある中間体でもある。シクロヘキシル基置換化β−グリコシルアミン生成物（34）を供するＮ−アセチルグルコサミンの１−アミノ誘導体とのシクロヘキシルアミンの反応により、ネオ糖脂質を形成した。その化合物は、グリコステロイドの形成のために役立つモデルである。グリコステロイドは、例えばそのバイオアベイラビリティーが腸の上皮に浸透することができないことにより制限される薬剤の経口デリバリーのための、薬剤輸送のために用いられる膜浸透エンハンサーとして認識されている。図10は、Ｌ−１，２−ジパルミトイル−Sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンとの１−アミノ−１−デオキシ−Ｎ，Ｎ−ジアセチルキトビオースの反応により形成された生成物の分子量を示すネオ糖脂質（30）の負FABマススペクトルである。実施例６ネオグリコペプチドの合成還元的アミノ化合物又はアマドリ転位により形成されたペプチド結合又はアミン結合のいずれかを通しての炭化水素のペプチドへのコンジュゲーションによってネオグリコペプチドを形成することができる(Meldal，M. Curr Opinion Struc turea Biol 4: 710; 1994; Lee，Y．C.らGlycoconjugate: Composition Structu re and Function H．J．Allen & E．C．Kisaulis，eds; Dekker，New York; 121 ; 1992)。グリコシルアミンはアスパラギン酸又はグルタミン酸誘導体の側鎖に結合され（Christiansen-BramsらJ ．Chem Soc．Perkin．Trans I: 1461; 1993）、そして結果として生ずるブロックは、生物活性を有する修飾ペプチドの合成のために用いられている。Ｌ−リシルリシンは、腫瘍に対する合成ワクチンの開発のために(Toyokuni，T.らTetrahedron Lett 31: 2673; 1990)、炭水化物抗原の多価リガンドを作製するために（Ponpipom，M．MらJ ．Med．Chem 24: 1388; 198 1; Fendersen，B．A．らJ ．Exp．Med 160: 1591; 1984）、適切な骨格として用いられている。タンパク質担体への（しばしばＴ細胞独立性である）ポリサッカリドのマンジュゲーションは、それらを、ワクチン候補である潜在性を有する免疫原性が増加されたＴ−細胞依存性抗原に転化するのに用いられている（Jennin gs，H．J．Adv ．Carb Chem Biochem 41: 155; 1983）。糖残基の、それらの還元端炭素を通してのリシンのε−NH₂基へのコンジュゲーションは、図11に示される１−アミノ−１−デオキシ−１，２−デオキシ−β−Ｄ−グルコースとのBoc-Lys-OMeアセテートの反応（35）により証明される。その反応は、実施例１のように行った。メラノトロピンＣ−末端ペプチドアナログへの糖の結合反応36（図11）に示されるようにＮ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースのグリコシルアミンを、ペプチドAc-Lys-Pro-Val-NH₂中に存在するリシンのε−NH₂基に接合した。そのコンジュゲートを実施例１の通り調製した。本実施例は、上述の研究における、並びに細胞−細胞相互作用における細胞表面炭水化物の機能的役割に基づく研究を含む生物医学的及び治療的適用のための、ネオグリコペプチドの合成の有用性を証明する。そのペプチド自体は、解熱及び抗炎症効果の両方を示すα−メラノトロピンのアセチル化Ｃ末端である（Deeter，L．B．らPeptides 9: 1285; 1989; Hiltz，M ．E らPeptide 12: 767; 1991）。α−メラノトロピンは、脊椎動物の下垂体により合成されるトリデカペプチドホルモンである（Hadley，M．E．らScience 2 13: 1025; 1981）。現在の研究は、胎児の発達及び学習記憶に関する神経メカニズムにおけるメラノトロピンに関する。認識及び膜を横切る活性な輸送のためのマーカーとしてのグリカンの導入は、タンパク質分解又は他のデグラデーションに耐えることにより活性ペプチドの寿命を増加させることに加えて、薬剤デリバリーのための大きな潜在性を有し得る。例えば、エンケファリングリコペプチドは、血液−脳関門を迅速に横切ることが見い出されている(Polt，R.らGlycoconj ugate J ． 10: 262; 1994)。炭水化物を組み込む高分子プロドラッグは、認識成分として用いられている。例えば、ペプチジルスペーサーアームを有するポリマー薬剤−サッカリドが報告されている。（Duncan，R.らJ control Rel 10: 51; 1989）。実施例７ビオチン化オリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成アビジン−ビオチン複合体は、アフィニティー精製及び組織内の局在化等を含むいくつかの生物分析的適用のための用途の広い道具である（Wilchek，MらAnal Biochem 171: 1; 1988）。ビオチニルグリカンはアビジン又はストレプトアビジンとの安定な多価複合体の形成（Shao，M．C．らMethods Enzymol 184: 653; 1990）を通してのオリゴサッカリド結合特異性のキャラクタリゼーション（Shao ，M．C．Anal Biochem 205: 77; 1992）及び糖タンパク質におけるグリカン処理の制御(Shao，M．C．らJ ．Biol．Chem 262: 2973;1987)のための道具として機能する。ビオチンヒドラジンは、完全な糖タンパク質に基づく炭水化物基の適接のビオチン化のために利用されている(Shannessy，D．J.らAnal Biochem 163: 204 ; 1987)。ビオチン化サッカリドコンジュゲート（37、図11）を、実施例１の方法を用いる１−アミノ−２−アセタミド−１，２−ジデオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドとのビオチンヒドラジンの本発明のアミノ基転移反応により調製した。そのビオチン化反応は、糖の還元端を完全に残し、それゆえアビジン−ビオチン技術を利用することを目的とした研究に役立つ優れたコンジュゲートである。実施例８薬剤−オリゴサッカリドコンジュゲートの合成いくつかの市販の薬剤に、それらのアグリコン成分に共有結合した糖残基を含む。例えばグリコシド抗生物質及び強心配糖体等である。頻繁に、そのサッカリド成分は、薬剤が正確に機能するために重要である。従って、治療及びデリバリーの能力を増加させるためのサッカリド残基に接合した薬剤の合成のため、並びにそれらの摂取効率及び薬物速度についてよりよく理解するためにも重要な適用がある。これは、炭水化物結合タンパク質／レセプターを有する標的細胞及び器官に用いられる治療のために特に価値あるものである。病気のホストを媒介するそれらの能力による、選択のための炭水化物リガンドは、抗炎症剤となるための潜在性を有する（Phillips，M．L．らScience 250: 1130; 1990）。本実施例は、２つの市販の薬剤、即ち１−ヒドラジノフタラジン（図２の11及び図５の21〜24）及びイソニコチン酸ヒドラジドのオリゴサッカリドコンジュゲートの合成を示す。１−ヒドラジノフタラジンは、その主な効果が心筋システムに対してであり、通常経口的に投与される抗高血圧剤である（Physician's Desk Reference ，Medical Economics Data Production Co．Motrale，NJ; 809; 1994 ）。薬剤が経口的に供することができない場合、又は低血圧に対する緊急の必要性がある場合、例えば妊娠の毒血症を治療する場合に非経口投与が行われる。ヒドララジンは、母系及び胎児の病的状態を導く原因の１つである妊娠の高血圧疾患に特に役立つ（Rakel，R．E．Conn's Current Therapy 244，257，260，958; 1992）。イソニコチン酸ヒドラジドは、抗結節剤として広く用いられる市販の薬剤である。イソニコチン酸ヒドラジド−サッカリドコンジュゲートを、各々Ｎ−アセチルグルコサミン（図２の13）及びマルトトリオースのグリコシル−１−アミン誘導体とのイソニコチン酸ヒドラジドの反応により調製した。これら２つの薬剤がグリコシル−１−アミンと反応する容易さ及び高収率は、これら２つの薬剤−サッカリドコンジュゲートに関連する主な注目を引く特徴である。上述の２つの薬剤の莫大な治療及び商業的価値並びにそれらのサッリドコンジュゲートに関する研究から生ずる潜在的に得られるものは、それらがデリバリー、生物分布、薬物速度及び能力に関する場合、他の注目すべき特徴である。実施例９リンカー／スペーサー基とのオリゴサッカリドコンジュゲートの合成 γ−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタールとのＮ−アセチルグルコサミンの１−アミノ誘導体の反応により、その他方の端においてそのアセタール誘導体として保護された（ｉ）４つの炭素原子からなるスペーサーアームの導入のため及び（ii）アルデヒド基を導入するために役立つ生成物（図９の反応生成物38 ）を形成した。スペーサーアームは立体的及び他の不要な相互作用を避けるためにカップリング反応に頻繁に用いられる。γ−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタールとの反応により生成されたグリココンジュゲートの目的は、グリココンジュゲートプローブを形成する時に先の特徴の両方の利点をとることである。クロロアセトアルデヒドジメチルアセタールでの後者のアルキル化により、アルデヒド基をポリサッカリドに結合するための方法が報告されている（Boguald，J らCarbohydr Res 148 101; 1986）。その生成物の脱アセタール化は、他の基、例えばタンパク質を接合するために役立つアルデヒド基を有するポリサッカリドを供した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｈ 15/203 Ｃ０７Ｈ 15/203 15/207 15/207 15/24 15/24 15/26 15/26 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者リチャーズ，ジェイムスシー. カナダ国，オンタリオケー２ジェイ１エム７，ネペアン，ラルキンドライブ 148

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｎ−結合グリココンジュゲートを合成するための方法であって、１−アミノ官能基の置換により、求核置換に有利な条件下で、グリコシル−１−アミンを求核試薬と反応させることを含む方法。２．前記求核試薬が−NH₂又は−NHNH₂基を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。３．前記求核試薬が、発色団又は発蛍光団であることを特徴とする請求項１に記載の方法。４．前記発色団又は発蛍光団が、置換化脂肪族及び芳香族アミン、ヒドラジン並びにベンジルアミンからなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。５．前記発色団又は発蛍光団が、ダンシルヒドラジン、１−ヒドラジノフタラジン、９−フルオレンアミン、イソニコチン酸ヒドラジド、イソニコチン酸ヒドラジド、２−ヒドラジノピリジン及び４−アミノ−４′−ジメチルアミノアゾベンゼンからなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。６．前記求核試薬がイソニコチン酸ヒドラジドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。７．前記求核試薬が、化学発光基を有する化合物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。８．前記化学発光基を有する化合物が、ルミノール及びそのアナログからなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。９．前記化学発光基を有する化合物がＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノールであることを特徴とする請求項８に記載の方法。 10．前記求核試薬がビオチン基を有する化合物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 11．前記求核試薬が脂質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 12．前記脂質がジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジヘキサデシルグリセロホスホエタノールアミン、ｎ−テトラデシルアミン、ｎ−オクチルアミン及びシクロヘキシルアミンからなる群から選択されることを特徴とする請求項11に記載の方法。 13．前記求核試薬が、リンカー／スペーサー基を有する化合物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 14．前記リンカー／スペーサー基を有する化合物が、γ−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール又は１−Ｎ−（９−フルオロメトキシカルボニル）−６ −ジアミノ−ヘキサンであることを特徴とする請求項12に記載の方法。 15．前記求核試薬が、ビオチンヒドラジド及びリシン基を含むペプチドからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 16．前記ペプチドが、Ｌ−リシルリシン及びBoc-Lys-OMeからなる群から選択されることを特徴とする請求項15に記載の方法。 17．求核試薬に対するグルコシル−１−アミンの比が、重量で約１：１〜約１：２の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 18．前記反応が、非プロトン性溶媒の存在下で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。 19．前記非プロトン性溶媒が、ピリジン、DMSO及びDMFからなる群から選択されることを特徴とする請求項18に記載の方法。 20．前記グリコシル−１−アミンが、１−アミノ−１−デオキシ −マルトオリゴサッカリドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。