JP2838147B2 - ネオ糖タンパク質およびその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ネオ糖タンパク質の合成および使用に関す
る。モノシアロラクトースおよびジシアロラクトース
は、牛初乳（bovine colostrum）から単離され、そして
カツプリング剤により担体タンパク質としてのヒト血清
アルブミン（HSA）に結合される。ネオ糖タンパク質は
ワクチンとして、そして更にレクチン発現性腫瘍（lect
inexpressing tumor）の部位検出および治療用のリガン
ドとして適している。

ガングリオシド、すなわちシアール酸を含有するグリ
コスフインゴ脂質は疎水性セラミド部分と親水性炭水化
物とで構成される原形質膜脂質（plasma membrane lipi
ds）である。グリコスフインゴ脂質はスフインゴシンと
長鎖脂肪酸とで構成されるセラミド部分により外側原形
質膜にそのオリゴサツカライド鎖が細胞外空間に突出す
るように係留されている。それらは細胞表面に細胞を区
別する種特異的なパターン形成することから、それらは
細胞事象において生物学的に重要な機能を有していると
考えられる。

グリコスフインゴ脂質はすべての哺乳動物細胞に典型
的なものであるが、ほんの小量しか通常は存在しない。
シアール酸を含有するグリコスフィンゴリピド、すなわ
ちガングリオシドは、ニユーロン原形質膜上に特に集中
している。ガングリオシドはまた神経外胚葉起源の腫瘍
（例えば黒色腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫など）の細
胞表面に強力に発現する。これらガングリオシドの一部
は正常哺乳動物細胞上に存在するが、そのほか脳および
神経線維にも、比較的小量にしかすぎないが存在するも
のである。このため関連のガングリオシドGM2、GM3、GD
2およびGD3が腫瘍関連抗原として興味深いものとなって
きている。これらのガングリオシドを標的抗原とする神
経外胚葉起源の腫瘍の腫瘍免疫療法の可能性も様々な研
究陣により研究されつつある。今日まで２つの異なるア
プローチがとられ、幾分の成功を収めている。

1. 適宜のガングリオシドに対する単クローン抗体の使
用、および 2. 適宜のガングリオシドによる能動免疫。

精製GM2ガングリオシドに対する抗体は黒色腫患者に
おいては生じ得ないことが研究により示された。バチル
ス・カルメツト−グエリン（Bacillus Calmette−Gur
in;BCG）またはサルモネラ・ミネソタ（Salmonella min
nesota）などのアジュバンドが用いられそして患者をシ
クロホスフアミドで前処理してはじめてガングリオシド
GM2に対するIgM抗体が誘発された（Livingston et al.
（1987）,Proc.Natl.Acad.Sci.84,2911〜2915）。更
に、GM2ガングリオシド含量の高いヒトまたはマウス黒
色腫または星状細胞腫細胞系統より成る全細胞ワクチン
を黒色腫患者に注射したところIgMアイソタイプの抗−G
M2抗体が誘導された（Livingston et al.loc.cit.）。

黒色腫患者についての今日までの研究は、ガングリオ
シドGM2に対する抗体の力価増大が生存時間の増大と相
関することを示している。

ガングリオシドワクチンを設計する上での主たる問題
は精製ガングリオシドの免疫原性が低い点およびそれら
を単離することの困難さである。ガングリオシドGM3お
よびGD3の糖部分、すなわちそれぞれモノシアロラクト
ースおよびジシアロラクトースが牛初乳から容易に取得
され得ることも知られていた。我々は、カプリング試薬
によりHSAに結合させたモノシアロラクトースおよびジ
シアロラクトースがそれぞれガングリオシドGM3およびG
D3に対して生成させた単クローン抗体と反応することを
見出した。逆に、前述のネオ糖タンパク質はガングリオ
シドGM3およびGD3と反応する抗体を生成させることがで
き、従って特異的腫瘍免疫療法のためのワクチンとして
適している。更に、それらは例えばレクチン発現性腫瘍
組織の部位検出および治療のためのリガンドとしても適
している。

従って、本発明は、 ａ） グリコスフインゴ脂質の糖部分、好ましくはモノ
シアロラクトースまたはジシアロラクトースと酵素を含
む担体タンパク質、好ましくはヒト血清アルブミンとよ
り成るネオ糖タンパク質、 ｂ） 好ましい出発物質が糖源としての牛初乳であるそ
の製造方法、 ｃ） および、ワクチンとしての、あるいは例えば腫瘍
診断の一部としてのコンペテイテイブラジオイムノアツ
セイでガングリオシドを検出するための診断助剤として
の、またレクチン発現性腫瘍の治療また診断剤としての
使用 に関する。

本発明は更に、実施例および特許請求の範囲中に含ま
れる。

実施例 1. 牛初乳からのモノシアロラクトースおよびジシアロ
ラクトースの単離 牛初乳をv.Nicolaiの方法にわずかな改変を加えて処
理した（v.Nicolai、ボン大学学位論文、1971年）。

牛初乳（10）を遠心分離して脂肪を除きそしてタン
パク質を冷却下に50％アセトンで沈澱させた。改めて遠
心分離、上清を回転蒸発器でもとの1/10容になるまで濃
縮した。

粗製画分をSephadex G−15カラムに通して塩を除き、
そして糖陽性およびクロライド陰性画分を合一し、濃縮
した。個々の糖を0.1M Tris/Hcl緩衝液（pH7.5）中のDE
AE−Sephadex A−25カラムでのイオン交換により塩化ナ
トリウム勾配を用いて分離した。適宜の糖画分を合一
し、濃縮し、そしてSephadex G−15カラムに通して塩を
除去した。

カラム後処理段階で得られた各画分中の糖の検出は、
エールリツヒ（Ehrlich）およびアンスロン試験によ
り、または溶媒混合物ピリジン／酢酸エチル／氷酢酸／
水（6:3:1:3）を用いたシリカゲルプレートでの薄層ク
ロマトグラフイで分画しそしてそのプレートにレゾルシ
ノールを噴霧することにより行った。

2. カプリング剤SPDPによるモノシアロラクトースおよ
びジシアロラクトースのヒト血清アルブミン（HSA）へ
の結合 糖をタンパク質に結合させるにはいくつかの可能性が
ある。例えば糖をタンパク質の遊離エプシロン−アミノ
−リジル基に直接結合させることもできれば、あるいは
またホモ−またはヘテロ二官能性カプリング剤を介して
結合させることもできる。

以下、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（SPDP）をカプリング剤として用い
たカプリング反応を説明する。反応工程は実質的に公表
された方法（J.Carlsson et al.（1978）,Biochem.J.17
3,723〜737）に対応する。

ａ） モノシアロラクトースおよびジシアロラクトース
の還元アミノ化 ナトリウムシアノボロハイドライドを添加したメタノ
ール性酢酸アンモニウム溶液中でモノシアロラクトース
およびジシアロラクトース中のグルコースのC₁原子を還
元アミノ化するためにWiegandt法を用いた（H.Wiegand
t,W.Ziegler,（1974）Hoppe−Seyler's Z.Physiol.Che
m.355,11〜18）。

還元アミノ化された糖誘導体はBiogel P2カラムで精
製した。

以下、R₁およびR₂は次の通り定義される： ｂ） 還元アミノ化糖とSPDPとの反応 この誘導体化は0.1M燐酸ナトリウム緩衝液＋0.1M塩化
ナトリウム（pH7.5）中で３〜５倍モル過剰のSPDPを用
いて行った。室温での反応時間は２〜12時間であった。

糖−NH₂−SPDP誘導体はBiogel P2カラムでＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドおよび未反応SPDPから分離した。そ
の誘導体にSPDPが混入しているときは、極性が漸増する
溶媒混合物を用いて溶出される小型シリカゲルカラムで
付加的精製工程を行った。

ｃ） HSAのSPDPとの反応 タンパク質誘導体化は糖誘導体化と同様の条件下0.1M
燐酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）中、遊離エプシロン−
アミノリジル基に基づき、３〜５倍モル過剰のSPDPを用
いて行った。

タンパク質−SPDP誘導体はSephadex G−25カラムにか
け以後の反応のための緩衝液（0.1M燐酸ナトリウム緩衝
液、pH6、5mM EDTA）で溶出して分離した。

ｄ） HSA−SPDP誘導体の還元 HSA−SPDP誘導体中に誘導体化により新たに導入され
たジスルフイド橋を25mMジチオトレイトールを添加した
0.1M燐酸ナトリウム緩衝液（pH6）、5mM EDTA中で還元
し２−チオピリドンを除去した。タンパク質の固有のジ
スルフイド橋はこれらの反応条件下では還元されない。
反応は室温で行い、そして反応時間は１〜２時間であっ
た。

還元されたHSA−SPDP誘導体を、Sephadex G−25カラ
ムにかけ0.1M燐酸ナトリウム緩衝液（pH6）、5mM EDTA
を溶出緩衝液として用いて分離した。

ｅ） 糖およびタンパク質誘導体のカプリング 還元されたHSA−SPDP誘導体を直ちに糖−NH₂−SPDP誘
導体と反応させた：糖−NH₂−SPDP誘導体はタンパク質
中のエプシロン−アミノリジル基に基づき２〜５倍モル
過剰で用い、そして反応時間は室温で24〜48時間であっ
た。

カプリング生成物またはネオ糖タンパク質はSephadex
G−25のカラムクロマトグラフイによる他の反応生成物
から分離した。

前述の手順においては、還元アミノ化糖はSPDPを介し
てタンパク質の遊離エプシロン−アミノリジル基に結合
される。代替となるもう一つの可能性はタンパク質のジ
スルフイド橋を還元し、そしてそのシステイン残基の遊
離状態となったスルフヒドリル基に還元アミノ化糖をSP
DPを介して結合させることである。

3. 中間生成物同定のための検出方法 中間生成物同定のために次の検出方法を選択使用し
た： Ａ） モノシアロラクトースおよびジシアロラクトース
および相当する誘導体の場合 ａ） 以下の溶媒すなわち ピリジン／酢酸エチル／氷酢酸／水（6:3:1:3） クロロホルム／メタノール/0.2％水性塩化カルシウム
（60:35:8） 中のシリカゲルＧ−60プレートでの薄層クロマトグラフ
イでの移動挙動における、および沃素蒸気、ニンヒドリ
ンおよびレゾルシノールによるバンドの染色性における
還元アミノ化およびSPDP−誘導体化後の変化。

ｂ） ノイラミン酸測定を1,2−ジアミノ−4,5−ジメト
キシベンゼンでわずかに改変し（S.Hara et al.（198
6）J.Chromatography 377,111〜119）そして２−チオピ
リドンをジチオトレイトールで脱離させることによるSP
DP−誘導体化の定量。SPDP−誘導体化糖の量に対応する
２−チオピリドンの遊出量はラムダ＝343nmの波長にお
ける吸光度増加を光度計で測定することにより測定で
き、またその濃度はランバート・ビーアの法則を用いて
算出することができる。ラムダ＝343nmにおける２−チ
オピリドンのモル吸光係数は7.06×10³M^-1×cm^-1である
（D.R.Grassetti ＆ J.F.Murray,（1967）Arch.Bioche
m.Biophys.119,41〜49）。

ｃ） J.Lechner et al.（1985）J.Biol.Chem.260,860
〜866の方法による、還元アミノ化およびSPDP−誘導体
化後の個々の糖誘導体のGC分析。

Ｂ） HSAの場合 ａ） タンパク質測定はBio−Radタンパク質アツセイを
用いて行った。

ｂ） SPDP誘導体化は、Bio−Radタンパク質アツセイを
用いたタンパク質測定、およびジチオトレイトールを用
いた２−チオピリドンの脱離により定量した。結合SPDP
量に対応する放出２−チオピリドンは波長ラムダ＝343n
mにおける吸光度増加を光度計で測定することにより測
定し、そして濃度はランバート・ベールの法則により算
出した。λ＝343nmにおける２−チオピリドンのモル吸
光係数は7.06×10³M^-1×cm^-1である（Grassetti ＆ Mur
ray,loc.cit.）。

ｃ） HSAおよびHSA−SPDP誘導体はSDSゲル電気泳動
（クーマシーブル染色）において異なる移動挙動を示
す。

4. ジシアロラクトース−HSA接合体（コンジユゲー
ト）の合成 特徴的な実験用混合物において、2mlのメタノール性
酢酸アンモニウム溶液中の10mg（10.75μmol）のジシア
ロラクトースを20mgのナトリウムシアノボロハイドライ
ドを添加して還元アミノ化した。その還元アミノ化糖を
Biogel P2カラムで精製し、次いで13mlの0.1M燐酸ナト
リウム緩衝液（pH7.5）中で、1050μのエタノールに
溶解した13mgのSPDPと反応させ、そしてジシアロラクト
ース−NH₂−SPDP誘導体をBiogel P2カラムおよびシリカ
ゲルカラムで精製した。1,2−ジアミノ−4,5−ジメトキ
シベンゼンによるノイラミン酸測定およびジチオトレイ
トールを用いた２−チオピリドンの脱離により測定され
た収率はジシアロラクトースの使用量の約50％（4.8〜
5.2μmol）であった。

HSAの誘導体化には、5.6mgのSPDPを450μのエタノ
ールに溶解し、そして5550μの0.1M燐酸ナトリウム緩
衝液（pH7.5）中の6mgのHSAに添加した。Sephadex G−2
5カラムでの精製により、HSA1分子あたり45〜53SPDP分
子という誘導体化度を有する約4.8mgのHSA−SPDP誘導体
が得られた。

HSA−SPDP誘導体中に新たに導入されたジスルフイド
橋は0.1M燐酸ナトリウム緩衝液＋5mM EDTA（pH6）中の2
5mMジチオトレイトールを用いて分解した。反応時間は
室温で１時間であった。Sephadex G−25カラムでの精製
後、還元されたHSA−SPDP誘導体を直ちに0.1M燐酸ナト
リウム緩衝液＋5mM EDTA（pH6）中でジシアロラクトー
ス−NH₂−SPDP誘導体と反応させた。そのカプリング反
応は光度計で、２−チオピリドンの脱離による波長ラム
ダ＝343nmにおける吸光度増によってフオローすること
ができる。24〜48時間後吸光度の更なる増加はなく、カ
プリング反応は完了した。

カプリング生成物をSephadex G−25で精製することに
よりHSA1分子あたり30〜33ジシアロラクトース分子で誘
導体化された2.1〜2.5mgのジシアロラクトース−HSA接
合体が得られた。

カプリング生成物の誘導体化度は1.）Bio−Radタンパ
ク質アツセイを用いたタンパク質測定により、および2
a.）1,2−ジアミノ−4,5−ジメトキシベンゼンを用いた
カプリング生成物中のノイラミン酸の測定により、ｂ）
波長ラムダ＝343nmにおける吸光度を測定しそして適宜
のパラメータをランバート・ベール式に代入することに
より（最終カプリング段階における）放出２−チオピリ
ドンの濃度を算出することにより、およびｃ）、ａ）お
よびｂ）に記載の方法を用いて回収された未反応ジシア
ロラクトース−NH₂−SPDP誘導体の濃度を測定すること
により測定した。

5. ジシアロラクトース−HSA接合体の免疫学的反応 カプリング生成物（ジシアロラクトース−HSA接合
体）を次いで、単クローン抗−GD3抗体を用いたBio−Do
tアツセイで試験した:mAb 704/16およびmAb 624/253
（いずれもGD3ガングリオシドに対するもの）のいずれ
もがネオ糖タンパク質と反応した。

また、非還元条件下でのSDS−ゲル電気泳動および引
き続きウエスタンブロツテイングを行った後も、単クロ
ーン抗体mAb 704/16およびmAb 625/253のジシアロラク
トース−HSA接合体との反応を示すことができた。

マウスでの免疫実験では、ジシアロラクトース−HSA
接合体がGD3ガングリオシドよりも相当に免疫原性が高
い、すなわち、より強い体液性免疫応答を誘発すること
を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハンス・ハーラルト・ゼトラツエク ドイツ連邦共和国デー‐3550 マルブル ク．ゾネンハング ３ (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/76 C07K 14/82 C07K 16/30 - 16/44 A61K 39/00 G01N 33/53 G01N 33/92 ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】糖部分がモノシアロ−またはジシアロラク
   トースであるグリコスフィンゴ脂質の糖部分が担体タン
   パク質に結合したネオ糖タンパク質。
2. 【請求項２】担体タンパク質がヒト血清アルブミン（HS
   A）である請求項１記載のネオ糖タンパク質。
3. 【請求項３】モノシアロ−またはジシアロラクトースを
   担体タンパク質に結合させることよりなる請求項１また
   は２記載のネオ糖タンパク質の製造方法。
4. 【請求項４】モノシアロ−またはジシアロラクトースを
   担体タンパク質に共有結合的に結合させることよりなる
   請求項１または２記載のネオ糖タンパク質の製造方法。
5. 【請求項５】Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジル
   ジチオ）プロピオネート（SPDP）がカプリング剤として
   用いられる請求項４記載のネオ糖タンパク質の製造方
   法。
6. 【請求項６】牛初乳が糖源として用いられる請求項３乃
   至５のいずれかの項に記載のネオ糖タンパク質の製造方
   法。
7. 【請求項７】請求項１または２に記載のネオ糖タンパク
   質からなる腫瘍免疫療法用ワクチンの製造のための免疫
   原。
8. 【請求項８】腫瘍がレクチン発現性腫瘍である請求項７
   記載の免疫原。
9. 【請求項９】請求項１または２に記載のネオ糖タンパク
   質からなる腫瘍用診断剤。
10. 【請求項１０】腫瘍がレクチン発現性腫瘍である請求項
    ９記載の診断剤。
11. 【請求項１１】請求項１または２に記載のネオ糖タンパ
    ク質からなるガングリオシドのコンペティティブラジオ
    イムノアッセイ用試薬。
12. 【請求項１２】ガングリオシドがGM3またはGD3である請
    求項11記載の試薬。