JPH01501547A - Ｈｉｖ感染の病因に関するペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＩＶ感染の病因に関するペプチド １１匹五五皇Ｉ この発明は、ヒト免疫不全ウィルスｒＨＩＶＪの病因に関するペプチドに関する 。ざらに詳しくは、この発明はＨＩ　Ｖゲノムの凹領域由来のペプチドおよび後 天性免疫不全症候群ｒＡ　Ｉ　ＤＳＪ感染の回避、処置または検出のための方法 および組成物におけるこの種のペプチドの使用に関する。

背景技術 後天性免疫不全症候群ｒＡＩＤｓＪは、重篤なまたは典型的には完全な免疫抑制 とそれに伴う、広範囲の日和見感染および悪怪ｌ！瘍に対する宿主の感受性とを 特徴とする疾患である。

ＡＩＤＳの完全な臨床上の発現は、通常は、リンパ腺症、発熱並びに体重減損の ような症状を伴う症候群であるＡＩＤＳ関連コンプレックスｒＡＲｃｓＪが先行 する。

ヒト免疫不全ウィルスｒＨＩＶＪレトロウィルスは、ＡＩＤＳ感染およびＡＲＣ ３症候群に起因する病因作因と考えられている〔エム・ジー・サルンガドハラン ら、ＡＩＤＳおよび前ＡＩＤＳ患者由来の細胞病原性レトロウィルス（ＨＴＬＶ −ＤＩ）の検出、単離、並びに連続生産」。

＊ ５ｃｉｅｎｃｅ、２２４．ｐｐ、４９７−５０８（１９８４））　、ＡＩＤＳ／ ＡＲＣ８患者集団の８５〜１００％がＨＩＶに対する試験に血清学的に陽性であ る〔ジー・エヌ・シ１ｒつら、［後天性免疫不全症候群におけるヒトＴ［１ｗ１ ０イケミア（リンパ趨向性）ウィルスタイプ■の分子特徴Ｊ　、　５Ｃｉｅｉｌ Ｃｅ　、２２Ｂ、　ｐＩ）。

１１６５−７０　（１９８４））。

＊　この出願では、ヒト免疫不全ウィルス（ｒＨＩＶＪ）は、ウィルス分類国際 委員会のヒトレトロウィルス下部委員会により採択され、ヒトＴ細胞リンパ趨向 性ウィルスタイプ１１　（ｒＨＴＬＶ−Ｉ［［Ｊ　）、リンパ腹痛関連ウィルス （ｒＬＡＶＪ　）並びにＡＩＤＳ関連レトロウィル°ス宿主感染に際しＨＩＶウ ィルスの最初の標的はＴ−４リンパ細胞であるが、これもヘルパもしくはインデ ューサ［１胞であることが知られている。Ｔ−４リンパ細胞は免疫系の他の特定 タイプの細胞と相互に関連して感染に対する免疫性もしくは防御を与える。さら に詳しくは、Ｔ−４リンパ細胞は、免疫系の機能に重要な坩殖因子の生産を刺激 する。例えば、これらはＢ細胞を刺激し、抗貧血性幹細胞を減少させるが、これ により防御抗体のえ産が促進される。これらは、感染もしくは異常宿主１７Ｂ胞 を攻撃するマクロファージ（「キラー細胞」）の活性化も行い、単核細胞（「ス キャベンジャａ胞」）を誘導して侵略微生物を包囲し破壊する。従って、Ｔ−４ リンパ１８胞がＨＩＶ感染により機能を失う際は、この複合した免疫防御系は破 壊されると共に宿主は広範囲の日和見感染に対し感受性となる。Ｔ−４リンパ細 胞に加えて、ＨＩＶウィルスは、中枢神経系ｍｒＩａ、マクロファージ並びに８ リンパ細胞にも感染することが示されている〔ジエー・エム・イムマク、「エイ ズ：ｒ５を覆い得るＪ　、　Ｍｅｄｉｃａｌ　ｗｏｒｌｃｌ　Ｎｅｗｓ（１９８ ５年　８月２５日）〕。

ＨＩＶのようなレトロウィルスのゲノムはａｔｉ蛋白質をコードする３つの領域 を含有する。」対領域はウィルス粒子のコア蛋白質をコードする。」対領域はウ ィルス粒子のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）をコードする。

ｅｎｖ領域は、ウィルスの膜エンベロープおよび感染ｌ１１の細胞膜に見出され る主要糖蛋白質をコードする。ウィルスが標的細胞レセプタに付着し細胞膜の融 合を起こす能力は−Ｊ■遺伝子により制御される２つのＨＩＶウィルスの特質で ある。

これらの特質は、ウィルスの病原性において基本的な役割を果たすと考えられて いる。

ＨＩＶｅｎｖ蛋白質は前駆体ポリペプチドに起源し、これは成熟形態では、約４ ８１アミノ酸の高度に配糖化された大きな膜の外側の蛋−白質（ａｐ１２０）と 約３４５アミノ酸であって配糖化され得、膜を縦断する小さな蛋白質（ａｐ４１ ）とに開裂する〔エル・ラトナら、「エイズウィルスＨＴＬＶ−ＩＩＩの全塩基 配列Ｊ　、　Ｎａｔｕｒｅ、３１３．　ｐｐ、２７７−８４（１９８５））。

今日に至るまでＡＩＤＳに対する有効な処置がなく、多くの努力は疾患の回避に 集中していた。この種の回避手段は、全血、器官並びに精液供与体のＨＩＶ抗体 検索および疾患の伝搬に関しＡＩＤＳの危険が高いグループの教育を包含する。

ＡＩＤＳおよびＡＲＣ８状況の実験的もしくは初期段階臨床処置は、ＨＰＡ−２ ３、ホスホノフォルメート、スラミン並びにアンサマイシンのような抗ウイルス 薬剤の投与を包含するが、これらは明らかに、逆転写酵素を阻害することにより ウィルスの複製を阻害するものである。しかしながら、これらの薬剤のいくつか を有効量で投与すると望ましくないことに衰弱をひき起こす副作用を伴う。ＡＩ ＤＳを処置する提はハイブリドーマ技術の適用に焦点を合わせていた。これらの 処置戦略の大半は、インターロイキン−２のような免疫調節因子の併用投与を必 要とすると考えられる。しかしながら、これらの処置のいくつかは将来が約束さ れているかもしれないが、真に有効と示されたものは皆無である。

最近の研究によれば、ＨＩＶはヒトにおいて遺伝的連続変異を惹起することも示 されている。少なくとも２種類のウィルスが米国のＡＩＤＳ患者において同定さ れている。さらに、高レベルのＨＩＶ中和抗体を有する患者は、低い中和能力の 患者より重篤な疾患の態様に陥る〔ウィリアム・ハゼトライン博士。メモリアル ・スロンーケタリング・ガンセンタでのスピーチ、　１９８５年１０月９日〕。

これらの最近の観察は、ＨＩＶ　ＡＩＤＳ感染に対する有効なワクチンまたはモ ノクローナル抗体指向治療法の開発には大きな障害があることを示唆している。

従って、今日に至るまでのこれらの開発にも拘らず、ＨＩＶおよびＡＩＤＳ関連 感染の回避、処置並びに診断のための有効な薬剤を開発する必要性が存する。

発明の開示 本発明は、ＨＩＶウィルスの病因に関するペプチドを提供することにより前記し た問題を解決する。１つの態様によれば、この発明のペプチドは、実質的にＨｆ Ｖｅｎｖ遺伝子の約アミノ酸６００〜アミノ酸７５０の間の領域から誘導された アミノ酸配列を特徴とするペプチドよりなる群から選択される。この領域は、ウ ィルスが媒介する病原性による事態において重要な役割を有すると考えられる。

ざらに好ましくは、・この発明のペプチドは実質的に次のＨＩＶｅｎｖ遺伝子の アミノ酸配列からなる一一ベブチド１二アミノ１６１６−６３２　：ペプチド２ 二アミノ酸６６７−６８０　：ペプチド３二アミノ１！６２フー６３９＊；ペプ チド４：アミ、ノａ！７２８−７５１並びにペプチド６４二アミノ酸６２７−６ ３９゜この発明は前記特定したペプチドのそれぞれのＤ−レトロ型、すなわちＬ 型のカルボキシ末端アミノ酸で始まりＤアミノ酸を用いて反対方向に合成して生 産されるものをも包含する。

＊　検定したペプチドサンプルの不注意によるミスラベルのためペプチド３に言 及した８７３，６２１号出願はＨＩＶ」竺遺伝子の７ミノ１７０２−７１５とし ていた。ペプチドサンプルのアミノ酸配列決定をひき続き行った結果「ペプチド ３」ラベルされたペプチドは実際は配列：ＨＩＶ」竺遺伝子のアミノ酸６２７− ６３９を有することが示された。

従って本出願で用いるように、「ペプチド３」はＨＩＶ」竺遺伝子のアミノ酸６ ２７−６３９の配列を有するペプチドを意図する。これはペプチド６４と同じ配 列である。よって、ペプチド３と６４とは同一である。２つの番号を使用し２つ のペプチド調製物を区別する。

この発明の他の態様は、実質的にＨＩ　Ｖ　ｅｎｖ遺伝子のアミ／［１４２６− ４５０からなるペプチド５、実質的にＨＩＶｅｎｖｉ伝子のアミノ［９４９Ｂ− ５１９からなるペプチド６、実質的にＨＩＶ」竺遺伝子のアミノ酸１４８−１６ ５からなるペプチド３１並びに実質的にＨＩＶｅｎｖ遺伝子のペプチド２９８− ３１４からなるペプチド７８を包含する。この発明は前記特定したそれぞれのペ プチドのＤ−レトロ型をも包含する。これらのペプチドは抗血清を生産し、これ は従来の検定においてはＨＩＶウィルスに結合し、合胞体形成を阻害しまたはウ ィルスを中和する。

さらに、ペプチド自体は従来の検定においてＨＩＶ指向性合胞体形成またはＨＩ Ｖの中和をすることができよう。従ってこの種のペプチドは、ＡＩＤＳ感染の回 避、処置並びに検出のための組成物および方法に有用である。

この発明のペプチドは、疾患の病因に寄与する正常細胞への付着および合胞体形 成のようなウィルスに媒介された事態に関するＨＩＶｅｎｖ蛋白質の機能領域を 包含する。これらペプチドに包囲された機能領域は保存性の高いＨＩＶｅｎｖ遺 伝子の免疫原性決定子に対応もする。従って、これらのペプチドは、免疫原性が 高＜ＨＩＶウィルスの遺伝的変異体の範囲に渡るウィルス病原性に関するＨＩＶ ｅｎｖ蛋白質の断片を包含する。

この発明のペプチドは、有利には、ＨＩＶウィルスの未変性」竺蛋白質と反応性 の抗体を誘発するかまたは中和もしくは合胞体形成を阻害することによりウィル スを妨害するワクチンもしくは治療組成物に使用し得る。さらに、これらのペプ チドを組成物および構造中で容易に修飾してＨＩＶウィルスに対するこれらのペ プチドの比活性を改良する。加えて、これらのペプチドはＨＩＶ感染を検出する 診断剤として使用し得る。

１１東１皇皇１１ 第１図は、本発明のそれぞれのペプチド１−６．３１．６４並びに７８のアミノ 酸配列、およびＨＩＶｅｎｖ遺伝子のアミノ酸６００〜アミノ１！７５０の間の 領域のものを示す。

この図面において、アミノ酸は以下のように一文字コードで表現する： Ｐｈｅ　：　Ｆ　Ｌｅｕ　：　Ｌ　Ｈｅ　：　Ｉ　Ｍｅｔ　：　ＨＶａｌ　：　 ｖ　Ｓｅｒ　：　Ｓ　Ｐｒｏ　：　Ｐ　Ｔｈｒ　：　ＴＡｌａ　：　Ａ　Ｔｙｒ 　：　Ｙ　Ｈｉｓ　：　ＨＧｌｎ　：　ＱＡｓｎ　：　Ｎ　ｔｙｓ　：　に　＾ ｓｐ　：　Ｄ　Ｇｌｕ　：　ＥＣｙｓ　：　ＣＴｒｐ　：　Ｗ　Ａｒｇ　：　Ｒ Ｇｌｙ　：　Ｇ及里μＪＪ［飢晟貝 第１図に示すように、ＨＩＶゲノムの」竺遺伝子断片に対応する種々のペプチド を調製し、これらを幾種かの従来の検定で、検定してこれらがウィルスに媒介さ れた病因に係る！！！に関していることを反映する活性を示すことを明らかにし た。

本発明は、ＩＴ１図に示す実例のペプチドに制限されないと理解すべきである。

そうではなく、本発明の範囲に包含されるペプチドは、ＨＩ　Ｖ　ｅｎｖｉ７伝 子のアミノ［２６００〜アミノ酸７５０の間の領域の外側に延在しまたは少なく ともこれを包含し、この領域由来のアミノ酸配列、もしくは断片もしくはこれら の組合せであることを特徴とするペプチドおよびＨＩＶに対し所望の免疫学的も しくは生物学的活性を示すペプチドの実質的部分までも及ぶ。さらに、この発明 によるペプチドは、ペプチド１−４および６４のものより長いもしくは短い、ま たはこれらの断片もしくは組合せを包含するアミノ酸配列を有するものを包含し 、実質的にＨＩＶｅｎｖ遺伝子のアミノ１１６００−７５０の間の領域よりなり 所望の免疫学的もしくは生物学的活性を示すペプチドまでも及ぶ。さらに、この 発明によるペプチドは、ペプチド５、ペプチド６、ペプチド３１またはペプチド ７８のいずれかより長いもしくは短い、またはこれらペプチドのそれぞれの断片 を包含しＨＩＶに対して免疫学的もしくは生物学的活性を示すアミノ酸の配列を 特徴とするものを包含する。

従って、この発明のペプチドの内のいずれか１つのペプチドを特に選択するのは ｆ！要でないことを理解すべきである。

このような選択は、多数のペプチドを取り前記したようにＨＩＶに対するそれら の免疫学的および生物学的活性を検出することにより行われる。

この発明によるポリペプチドは、固体支持体上での合成を含む公知の如何なるペ プチド合成法を用いる従来の合成にょっても調製し得る。この発明のペプチドは 、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列で形質転換された適当な宿主中でもＥ ｌ製し得る。例えば、この発明のペプチドは、そのペプチドをコードするＤＮＡ 配列で形質転換されそれを発現する適当な宿主の発酵により調製し得る。これに 代えて、この発明のペプチドのいくつかをコードするＤＮＡ配列を互いに連結し た後これらの配列を適当な宿主の形質転換に用いＨＩＶ感染の病因に関するペプ チドを発現させてもよい。この種の方法の組合せも用い得る。この発明の好適な 態様では、化学合成のみを用いる。この方法によれば、この発明のペプチドは、 Ｍ製が容易で起源において非生物的であるためさらに有利である。

この発明のペプチドは、好ましくは、キーホールリンベットヘモシアニン（ｒＫ ＬＨＪ）のような１つもしくはそれ以上のキャリヤ蛋白質と連結した後ここに記 載する組成物および方法に使用する。ペプチドは従来の種々の方法でキャリア蛋 白質と連結されるが、例えば、エム・ライヒリン、［蛋白質およびペプチドのた めの連結剤としてのグルタルアルデヒドの使用Ｊ　、　Ｈｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　 ＥｎＺ　ｍｏｌｏｇ　、　７０．　ｐＩ］、　１５９−６５（１９８０）により 記載されたものがある。

ペプチドをＥｌ製しこれをキャリヤ蛋白質と連結した後は、所望に応じて、本発 明の方法および組成物に従来の様式で抗体を用いる。例えば、ペプチドもしくは 連結ペプチドを、単独もしくは本発明の他のペプチドと組合せて、好ましくはペ プチドを例えば０．１％ＳＤＳを含むＰＢＳ中に最初に溶解することにより、通 常はよく知られたアジュバントおよび添加物を１つもしくは組合せと共に混合す る。この発明の他の態様では、ペプチドを疎水性基に連結し組成物中へのアジュ バントを作成する。勿論、治療組成物をＩＩ製する倍のよく知られた方法をこの 発明のペプチドを用いて採用し得ることを理解すべきである。

前記Ｅｌ製した組成物を次に従来の様式でＨＩＶ感染の処置に用いる。この種の 処置方法およびこれらの投与レベル並びに必要な要件は従来公知であり、有効な 方法および技術から当業者が選択し得る。例えば、この発明のペプチドは、ＨＩ Ｖ感染患者への投与に際し薬学的に許容できるアジュバントと薬学的に許容でき る様式およびＨＩＶ感染の重篤性を軽減するのに有効な量で組合せることができ る。投与量および処置方法は、患者の健康状態、重篤性並びに感染経路のような 因子と処置担当者の判断とによろう。

これとは別に、この発明のペプチドは、少なくともある程度の期間はＨＩＶ感染 に対するワクチンおよび人間保護の方法に有用である。ペプチドは、これらのワ クチンおよび方法にあっては、単独でまたはこの発明の他のペプチドと共に従来 のワクチン中の抗原の使用と矛盾しない様式で使用し得る。

例えば、この発明のペプチドは、従来、ワクチンに用いられる薬学的に許容でき るアジュバントと組合せ免疫学的に有効な量で投与してＨＩＶ感染に対しある期 間患者を保護し得る。

この発明の組成物およびワクチンの双方は従来の投与様式で患者に投与し得る。

投与の頻度は、用いる特定の組成物もしくはワクチンおよび患者の状態のような 因子に依存しよう。

これらの組成物もしくはこれらのワクチンの追加免疫を用いる後続する処置は、 最初の処置もしくはワクチン接種の結果に依存しよう。

さらに、この発明のペプチドおよびこれらに対する抗体は、血液、器管もしくは 精液サンプル中のＨＩＶおよびＨＩＶに対する抗体の存在を検出するよう設計さ れた現在使用可能な方法およびキットに用い得る。

ここに説明した発明がより十分に理解されるように以下の実施例を記載する。こ れらの実施例は説明の目的のためのみであり、いかなる意味においてもこの発明 を限定するよう構成するものではない。

友凰Ｉユ Ａ、ＨＩＶ感染の病因に関する ペプチ°の調 ）１１Ｖゲノムの」並遺伝子の断片に対応するペプチド１−６．３１．６４並び に７８を合成した。これらのペプチドを第１図に示すが、図中アミノ酸の番号は 、エル・ラトナら、ｒＡＩＤＳウィルスＨＴＬＶ−Ｈの全塩基配列Ｊ　、　Ｎａ ｔｕｒｅ。

３１３、　ｐｐ、　２７７−８４（１９８５）に記載された」竺遺伝子に対応す る。

アール・ピー・メリフィールド、「固相ペプチド合成、工、テトラヘフチトノ合 成Ｊ　、Ｊ、　Ａｇｅ、Ｃｈｅｇｉ、５ｏＣ６，８３，Ｉ）Ｅｌ。

２１４９−５４（１９６３）により記載された固相法の改良変法を用い、アプラ イド・バイオシステム・モデル４３０Ａペプチド合成ＩＩ置と生産元より提供さ れる試薬と手段とを用いてペプチドを合成した。この改良法では、ニス・サカキ バラら、［ペプチド合成におけるフッ化水素の使用、■、無水フッ化水素中での 種々の保護基の有様Ｊ　、　Ｂｕｌｌ、　Ｃｈｅｇｉ、Ｓｏｃ、Ｊａｐ、　、　 ４Ｇ。

ｐｐ、２１６４−６８（１９６７）に記載された方法の変法において、１０％ア ニソールを含有する液体ＨＦを用い樹脂から保護されたペプチドを脱ブロックし 分離した。

まず、樹脂から分離したペプチドをｎ−ブタノール／水（６／１００）を溶離剤 として用いるセファデックスＬＨ２０カラム上の分配クロマトグラフにより精製 した。溶離物ヲＡｌｔｅｘ　Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ−ＯＤＳカラム上で０．１ ％ＴＦＡアセトニトリルグラジェントを用いる溶出による準Ｂ１１１用高圧逆相 クロマトグラフによりさらに精製した。溶出物を６ＮＨＣｊで１８時間加水分解 した後、ベックマンアミノ酸分析機でアミノ酸分析を行い生産されたペプチドの アミノ酸配列を確認した。

Ｂ、この発明のペプチドの ＊ この発明の１つの態様では、ペプチド１−６　．３１．６４並びに７８を好まし くは使用前に１つもしくはそれ以上のキャリヤ蛋白質に連結する。従って、前記 したように調製したこれらのペプチドのそれぞれをキャリヤ蛋白質キーホールリ ンペットヘモシアニン（ＫＬＨ，シグマ）に連結する際は、２−のリン酸ナトリ ウム！ｌ笥液（０，１Ｍ、　ＤＨ−８＞中の２ｑのペプチドと２−のリン酸ナト リウム緩衝液（０，１Ｍ、Ｈ−８＞中の５■のＫＬＨとを混合した。そｐ の後ＩＪ１＋１！の０．２５％グルタルアルデヒド溶液を１１［に渡りいくつか の部分に分けて混合物に添加した。その結果得られた混合物をさらに６時間撹拌 した後ＰＢＳに対し一夜透析した。

＊　不注意による過誤のため、８７３，６２１号出願ではペプチド２および３を 非連結型で使用すると記載した。１６２１号出願および本出願双方の実施例で用 いるペプチド２および３は連結型で使用した。

ワクチン組成物に使用するため、この発明のペプチドを破ａｍ毒抗原、ジフテリ ア毒抗原または他の天然もしくは合成キャリアであって従来技術を用いヒトに使 用するのに適するものと連結し得る。これとは別に、ペプチドを患者の免疫応答 を増強する適当なアジバントに連結してもよい。ペプチドを使用前に全ゆる適当 な合成低分子囮キャリヤと組合せて使用することもできる。最終的に、ジスルフ ィド結合により適当なキャリヤに連結するため付加的なシスディン残基をペプチ ドのＣまたはＮ末端に付加することもできる。

２、に１豊１Ｌ且１ それぞれのににＨ連結ペプチド１−６．３１．６４並びに７８を１＝１の割合で ７０インドの（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）完全アジュバントと共に乳化した。続いてそ れぞれのマウスへの１００刀／　２５０　ｔｔｌの乳化物の皮下注射により３匹 のＢＡＬＢ／ＣＪマウス（ジャクソン研究所、バー・ハーバ−、マイネ）の群に 接種した。１４日目および３５日目にそれぞれのマウスに７０インドの不完全ア ジュバントに１＝１に乳化した１００Ｉ９／２５０１１１の同じ連結ペプチドの 追加免疫注射を行った。

尾部の血液を２１日目および４２日目に採血し、血清サンプルと共に検定する時 まで一２０℃で保存した。

３、免疫学的検定 １、」竺ペプチド被覆プレートに対する抗ペプチド血清を用いるＥＬＩＳＡ この試験では、この発明のそれぞれのペプチド１−６．３１．６４並びに７８に より動物内で生成した抗血清がそのペプチドに結合することを測定した。従って 、この発明のペプチドは免疫原性であり試験動物内で応答を誘発する。

検定を行うため４枚の内２枚の９６−穴マイクロタイタブレート（ヌンク・イム ノエ）をＰＢＳ　（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ　ＮａＣ１１，Ｈ−７，２）中 で５０Ｉ１１の５０ｓ／ｄ非連結ペプチド混合物を用い被覆し、そのプレートを 室温で一夜インキユベートした。３枚目と４枚目のプレートはそれぞれ１枚目お よび２枚目のプレートの対照として機能するが、ペプチドで予儀被猿する以外は 前者を後者のプレートと同様にして処理した。その後プレートを倒立させ全ての 穴を空にし、ＰＢＳｌｏ、０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。

ベーパータオル上で軽く叩いて吸取りプレートを乾燥した。

プレートの吸取りの後３５０成の５％ウシ胎児血清／ＰＢＳ（ｒＦｃｓ／ＰＢＳ Ｊ　’）溶液をそれぞれの穴に添加し室温で１時間インキュベートした。その後 前記したようにプレートを洗浄し吸取った。

その後３匹のマウスのそれぞれの群に由来する保存血清サンプルを前記したよう に調製した２枚の予備被覆プレート上および２枚の対照プレート上で検定した。

第１の予備被覆プレートでは、最初の希釈１：１０に続く５％ＦＣＳ／ＰＢＳ中 でのＮ続２倍希釈で免疫原性ペプチドに対する抗体応答を検定した。第２のプレ ートでは、最初の血清希釈１：２０に続いて５％ＦＣ８／ＰＢＳ中での連続３倍 希釈を行った。

２時間インキュベートした後前記したようにプレートを洗浄し吸取り乾燥した。

その後５％ＦＯ３／ＰＢＳ中の５０ＩＪ１の１　：　２０００希釈ヤギ抗マウス −Ｉ、Ｇ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｒＨＲＰＪ　）（Ａ、Ｐ、！！鎖および 軽ｌｌｌ特異的、キャペル研究所）をそれぞれの穴に添加し、室温で１時間プレ ートをインキュベートした。その後プレートをＰＢＳｌｏ、０５％Ｔｗｅｅｎ− ２０で洗浄した。ジメチルスルホキシド中４２ｍＭの３．３’　、５．５’　− テトラメチルベンジジン（ｒＴＭＢ／ＤＭＳＯＪ　）、７．３５成の３０％過酸 化水素（ｒＨ２０２Ｊ　）　を５０ｍのｏ、１１ｖｌ酸ナトＩＪウム−り工た。

その後マイクロプレート読取り機（ダイナチックＭＲ６００）を用い４１０ｎｌ で分光光度的にプレートを解析し、それぞれのペプチド１−６．３１．６４並び に７８に対する抗血清がそのペプチドに結合することを観測した■、ウィルス被 覆プレートに対する 抗ペプチド血清を用いるＥＬＩＳＡ この検定ではこの発明のペプチドに対して生成した抗血清がＨＩＶウィルス被覆 プレートに結合することを示す。

５％ウシ血清アルブミンを含有する１００ｕｌの炭酸緩衝液（Ｈ−９，６）を標 準ＨＩＶウィルス（Ｏバート・ガロ博士より寄贈）を被覆した９６穴マイクロタ イタブレートのそれぞれの穴に添加し、室温でプレートをインキュベートした＊ 。ウィルス被覆マイクロタイタブレートはエレクトロヌクレオニクス、フェアフ ィールド、ニュージャージ州からも入手可能である。プレートは脱イオン水で３ 回リンスする。

＊不注意による過誤のため、８７３，６２１号出願はＨＩＶウィルス被覆プレー トの調製に言及した。１６２１号出願と本出願との双方の実施例で用いるウィル ス被覆プレートはロバート・ガロ博士の寄贈である。使用したプレートは、実際 は、９６穴マイクロタイタブレート（ヌンク・イムノエ）を炭ｍａｌｌ液（ｐＨ −９，６）中の５１１１／ｄ標準ＨＩＶウィルス混合物１００Ｉｊｌで被覆し、 ４℃で一夜プレートをインキュベートし、プレートを倒立させて全ての穴を空に し、脱イオン水で３回プレートを洗浄した後吸取ることにより作成され、または 少なくとも作成できたと理解している。

プレート吸取りの後２０％の通常ヤギ血清を含有する１００ＪＪ１の塩溶液−Ｐ Ｏａ　（ＰＢＳ）をそれぞれの穴に添加した。次に５１１１２のヒト試験血清も しくは対照血清をそれぞれの穴に添加し、プレートを４℃で一夜もしくはＭ温で ２Ｒ１’にインキュベートした。その後０．０５％Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ２ ０を含有するＰＢＳで３回プレートを洗浄し吸取った。

次に１００ＩＪ１の０．０５％Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ２０中の１＝４０００ 希釈１％通常ヤギ血清およびヤギ抗ヒトＩ、ＧＨＲＰ（重鎮および軽鎖特異的） をそれぞれの穴に添加し、室温で１時間プレートをインキュベートした。抗ヒト Ｉ、ＧＨＲＰの力価を検定した後指示抗体の適切な最終濃度を確認した。１時間 のインキュベートを終えた後０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅａｎ−２０で２回および もとのＰＢＳで１回リンスした。

その後ソレンンンのリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ−５）中の０．００５％Ｈ２Ｏ ２および０．０５％オルトフェニレンジアミン（ｒＯＰＤＪ　）”溶液１００成 を添加し、暗所において室温で２０分反応させた。

＊これは有効な腫瘍原性物質であり、廃棄する前に次の溶液で無毒化する： ５０ｇ　Ｋ２ＣｒＯ４ ２５ａｄ！　ＩＯＮ　Ｈ２ＳＯ４ １４５ｓｅ　Ｈ２Ｏ ５０１１１の４Ｎ　Ｈ２ＳＯ４をそれぞれの穴に添加することにより反応を停止 した。目視観測によりまたは４９０ｎａ＋でマイクロプレート読取り機を用いて プレートを読取った。

それぞれのプレートは、ヒト血清または抗ヒトＩ　Ｇ−ＨＲＰ共役を含有しない 一連の「ブランク」対照穴を有し、それには次の内１つを添加したニ ーー２０％通常ヤギ血清を含有する塩溶液−ＰＯ’４（ＰＢＳ） 一−ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０（０，０５％）−−０，００５％Ｈ２０２と０． ０５％ＯＰＤとを含有するソレンソンのリン酸−クエン’ｔａｍ衝液（Ｈ−さら に、それぞれのプレートは、ヒト血清を含有しない一週の「バックグランド」対 照穴を有し、それには次の内１つを添加したニ ーー２０％通常ヤギ血清を含有するｉ溶液−ＰＯａ（ＰＢＳ） −−１：　４０００の希釈で１％通常ヤギ面清とヤギ抗ヒトＩ、Ｇ　ＨＲＰとを 含有するＰ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ　−２０＜０．０５％） 一−０，００５％Ｈ２０２と０．０５％ＯＰＤとを含有するソレンソンのリン酸 −クエンＭＭ衝液（ｐＨ−それぞれの試験プレートは陰性および陽性対照内情を も有する。それぞれのペプチド１−６．３１並びに６４に対して生成した抗血清 を試験した。

プレートの解析の結果、この発明のそれぞれのペプチド１．２．４、並びに３１ に対して生成した抗血清はＨＩＶウィルスと結合することが判明した。

この発明のペプチドおよびこれらにより生成した抗血清を用い、これらの合胞体 形成阻害能力について、シー・デー・リチャードソンとビー・ダブリュ・チョビ ン、［バラミキソウィルスによる膜融合を特異的に阻害するオリゴペプチド：反 応部位の研究」、■皿旦Ｂ、１３１．　ｐｐ、　５１８−３２（１９８３）に記 載された検定手順の変法で検定した。本検定では、生きたウィルスの代りに組換 えＨＩＶｅｎｖ蛋白質をこの発明のペプチドの１つもしくはこれらにより生成し た抗血清の存在下でＴ−４陽性細胞の培養に添加し、合胞体形成阻害の程度と培 養物中の細胞融合とを観測した。

この発明のペプチドおよびこれらにより生成した抗血清は細胞へのウィルス付１ １および合胞体形成のようなウィルスが媒介する現象を阻害することがこの検定 により示された。検定では、ペプチド１−６．３１並びに６４およびそれぞれの ペプチド１−６．３１．６４並びに７８に対して生成した抗血清を試験した。ペ プチド３のみが合胞体形成を阻害した１゜よって、それぞれのペプチド１，２． ４．５．３１並びに７８に対して生成した抗血清が合胞体形成を阻害した。

＊ペプチド６４はこの検定で合胞体形成を阻害せずペプチド６４はペプチド３と 同一であるため、先に報告したペプチド３についての阻害活性は検定したサンプ ル中にペプチド３と共に存在した不純物に起因し得る。

従って、この検定は、この発明のペプチドおよびこれらに対して生成した抗血清 の治療剤としての有用性を示す。例えば、この種のペプチドの感染宿主への投与 は、ウィルスの細胞から細胞への伝播およびウィルスに誘導された細胞融合を阻 害して感染の拡散と免疫系の最終的破墳とを回避するのに十分なものとする。こ れとは別に、これらのペプチドはプライム投与量で有用に投与でき、これは続い て感染宿主がウィルスに対し有効な中和抗体を生成することを可能とする。

１１、久工反ス生１旦１ ａ、細胞の溶解に基く ＨＩＶ中和 この発明のペプチドに対して生成した抗血清を検定し細胞の溶解に基＜ＨＩＶウ ィルスを中和するこれらの能力を測定した。この検定では、ＨＩＶ感受性細胞を 抗血清と混合し、それを数日間インキュベートした後溶解について顕微鏡的にこ の発明のペプチド１．２．４．５並びに３１に対する抗血清はＨＩＶウィルスを 中和し、ＨＩＶ感染および続＜ａＭｉの溶解を回避することを観測した。それぞ れのペプチド６および７８に対する抗血清はこの種の活性を示さず、ペプチド３ および６４に対する抗血清は検定しなかった。

このような中和活性は、この発明のペプチドおよびこれらに対する抗血清がＨＩ Ｖｇｉ染を回避するワクチンに有用であることを示す。従って、これらのペプチ ドおよび抗血清は感染宿主内でウィルス複製を阻害する治療組成物に有用である 。

Ｃ，ＨＩＶおよびＨＩＶに対する抗体の検出におけるこの発明のペプチドおよび これらの抗体の使用 ＨＩＶおよびＨＩＶに対する抗体の存在を検出するよう設計された方法および診 断キットが現在では利用可能である。

本発明の方法により調製されたＨＩＶ感染の病因に関するペプチドおよびこれら を用いて生成した抗体をこれらの方法およびキットに用いてＨＩＶおよびＨＩ　 Ｖ、に対する抗体の存在を検出することもできる。これらのペプチドおよびこれ らの抗体はＡＩＤＳキャリヤの迅速かつ簡便な同定を可能とする診断キットにパ ッケージしてもよい。

例えば、この発明のペプチドまたはこれらを用いて生成した抗体は、例えばラジ オイムノアッセイもしくはＥＬＩＳＡ技術のようなＨＩＶ抗原もしくは抗体検出 について現在利用可能な免疫的診断試験に用い得る。

それぞれの検定では、この発明のペプチドおよびこれらのペプチドに対する抗体 を使用する。実験動物にフロイントのアジュバントのような適当な溶液中のこの 発明のペプチドを去し、その結果得られる血清を用いることにより抗体を生産す る。その他、この発明のペプチドに対するモノクローン抗体を標準的ハイブリド ーマ技術を用いて生産することもできる。

ある種のラジオイムノアッセイでは、前記したように生産されたＨＩＶペプチド に対する抗体は、例えば試験管の内側のような固相に接着している。患者血清の サンプルを前記のように作成した既知量のこの発明のペプチドと共に試験管に入 れ、放射活性ヨウ素のような放射活性アイソトープでラベルする。患者血清中の いかなるＨＩＶ抗原もＨＩＶ抗体との結合についてラベルしたペプチドと競合し ないだろう。過剰の液体を除去し、試験管を洗浄し、放射活性の量を測定する。

陽性の結果、すなわち患者の血清がＨＩＶ抗原を含有していれば、対照と比較し て試験管に残る低量の放射活性により示される。

ある種のＥＬＩＳＡ試験では、この発明に従って調製したペプチドでマイクロタ イタブレートを被覆し、これに患者の血清サンプルを添加する。血清中に存在す るあらゆるＨＩＶ抗体とＨＩＶ抗原との相互作用をおこなわせる門インキュベー トした後プレートを洗浄する。部分［ヒトイムノグロブリンの注射により実験動 物内で生成させその後酵素に連結した抗ヒト抗体のａ製動を添加する。インキュ ベートすると抗原抗体反応が起こり、その後プレートを洗浄する。その後酵素の 基質をマイクロタイタブレートに添加し、酵素が基質と反応する時間の間インキ ュベートする。その後最終調製物の吸光度を測定する。吸光度の大きな変化は陽 性の結果、すなわち患者の血清がＨＩＶに対する抗体を含有することを示す。

この発明の態様のいくつかを前記したが、この発明の基本的な構成をこの発明の 方法を利用する他の態様を提供するよう変更し得ることは明らかである。従って 、この発明の範囲は、実施例として前記した特定の態様によらず、ここに記載す る請求の範囲により特定されるべきである。

Ｆ　工（、Ｉ ＥＥＥＧＣＥＲＤＲＤ ペプチド１　（ＨＩＶ　ｅｎｖ　ノアミノ酸６１６−６３２）　：　ＰＷＡＳＷ ＳＮ）Ｃ５ＬＥＱＩＷＮＮヘフチド２　（ＨＩＶ　ｅｎｖ　ノアミノＦＬ６６７ −６８０）　：　Ｌ（ｊＬＤＫＷＡｓｔ、ＷＮＷＦペプチド３　（ＨＩＶ　ｅｎ ｖのアミノ［９６２７−６３９）　：　ＥＱＩＷＮＮｊｆ！”ｇａペプチド４　 （ＨＩＶ　ｅｎｖのアミノ酸７２８−７５１）　：　ＬＰＩＰＲＯＤＲＰＥＧＩ ロココロコ■ＥＩＲヘフチド５　（ＨＩＶ　ｅｎｖ　ノアミノｗｉ４２６−４５ ０）　：　ＲＩＫＱＩＩＮＭＷＱＬ％ＸＡ）ｆｆＪＬＰＭｓＧＱｆペプチド６　 （ＨＩＶ　ｅｎｖ　ノアミノｆｉｌ　４９１ｉ−５１９）　＝　Ｖ）ＣＩＥＰＬ ｃｖＡＰＴＸＡＸＲＲｗＱＲＥＸＩＲＡペプチド３１　（ＨＩＶ　ａｎｙ　／） アミノ酸１４８−１６５）　：　ＮＳＳＳＧＲＭ！ＭＥＫＧＥ！Ｘ）ｆｃｓペプ チド６４　（ＨＩＶ　ａｎｙ　ノアミノ酸６２７−６３９）　”　ＥＱＺＷＮｈ ？ｆｆｉｗＭＥ’ＷＤペプチド７８　（ＨＩＶ　ｅｎｖ　ノアミノ酸２９Ｂ−３ １４）　：　ＳＶ）：ＩＮ（：’！’ＲＰＮＮＮＴＲＫ５！国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＩＶウィルスの病因に関するペプチドであって、実質的にＨＩＶ　ｅｎｖ 遺伝子の約アミノ酸６００〜アミノ酸７５０の間の領域から誘導されるアミノ酸 配列を特徴とするペプチドよりなる群から選択されるペプチド。
2. ２．実質的に次の式のアミノ酸配列： 【配列があります】 並びにこれらのＤレトロ型よりなるアミノ酸の配列を特徴とするペプチドよりな る群から選択される請求項１記載のペプチド。
3. ３．ＨＩＶウィルスの病因に関するペプチドであって、実質的に次の式のアミノ 酸配列： 【配列があります】 並びにこれらのＤレトロ型よりなるペプチドよりなる群から選択されるアミノ酸 の配列を特徴とするペプチド。
4. ４．ＨＩＶ感染に対し所定期間患者を保護するよう処置する薬学的に許容できる 組成物であって、免疫学的に有効な量の請求項１〜３いずれかに記載の少なくと も１つのペプチドからなる組成物。
5. ５．ＨＩＶ感染に対し所定期間愚者を保護するよう処置するに際し、前記患者を 薬学的に許容できる様式で請求項４記載の組成物を用いて処置する手順からなる 処置方法。
6. ６．患者のＨＩＶ感染を処置する薬学的に許容できる組成物であって、ＨＩＶ感 染の重篤性を軽減するのに有効な量の請求項１〜３いずれかに記載の少なくとも １つのペプチドからなる組成物。
7. ７．患者のＨＩＶ感染を処置するに際し、前記患者を薬学的に許容できる様式で 請求項６記載の組成物を用いて処置する手順からなる処置方法。
8. ８．血液、組織または精液サンプル中のＨＩＶ抗原に対する抗体を検出する方法 であって、請求項１〜３いずれかに記載の少なくとも１つのペプチドを特徴とす る検出方法。
9. ９．血液、組織または精液サンプル中のＨｌＶ抗原を検出する方法であって、請 求項１〜３いずれかに記載の少なくとも１つのペプチドに対する抗体を特徴とす る検出方法。
10. １０．請求項１〜３いずれかに記載の少なくとも１つのペプチドまたはこれらペ プチドの１もしくは複数に対して生成する少なくとも１つの抗体を特徴とするＨ ＩＶ診断キット。