ES2350901T3 - Polipéptidos aislados basados en el epítopo neutralizante de la proteína p17 del vih útiles como vacunas, y anticuerpos anti-p17 neutralizantes que reconocen específicamente dicho epítopo neutralizante. - Google Patents

Abstract

Polipéptido aislado que puede reaccionar específicamente con un anticuerpo neutralizante anti-p17 del VIH que consiste en la secuencia de aminoácidos NH2-X1-Gly-X2-X3-Leu-Asp-X4-Trp-Glu-X5-Ile-X6-Leu-Arg-COOH (SEQ ID NO: 1) en la que X1 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Ser y Arg, X2 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Gly, Glu y Ser; X3 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Glu, Lys, Asp y Arg; X4 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Arg, Ala, Lys, Thr, Ser, Glu, Asp y Gln; X5 es un aminoácido seleccionado entre Lys, Arg y Ser; y X6 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Arg y Gln, siendo dicha secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 la secuencia del epítopo neutralizante de la proteína p17 del VIH entre las posiciones 9 y 22.

Description

Polipéptidos aislados basados en el epítopo neutralizante de la proteína p17 del VIH útiles como vacunas, y anticuerpos anti-p17 neutralizantes que reconocen específicamente dicho epítopo neutralizante.

La presente invención se refiere a polipéptidos aislados basados en una secuencia de la región amino terminal de la proteína p17 del VIH, útiles en el tratamiento y el diagnóstico del síndrome de inmunodeficiencia adquirida humana (SIDA), así como a los anticuerpos neutralizantes anti-p17 que reconocen específicamente esta secuencia amino terminal.

El SIDA comprende un grupo de síndromes clínicos provocados por un retrovirus denominado el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). El VIH infecta de una manera preferencial las células que expresan el antígeno CD4 en su superficie, por tanto los linfocitos T cooperadores y los macrófagos, pero también las células dendríticas de los ganglios linfáticos.

La infección por VIH puede bloquearse in vitro mediante anticuerpos obtenidos del suero de individuos infectados.

En el transcurso de los años se han desarrollado diversos anticuerpos neutralizantes del VIH, reaccionando la mayoría de ellos con los productos proteicos del gen env.

Estos productos proteicos se han utilizado como immunógenos de diversas formas, por ejemplo como extractos de glicoproteínas, proteínas recombinantes y péptidos sintéticos.

Los productos de env tradicionalmente se han considerado las proteínas más inmunogénicas del VIH y las más adecuadas para estimular una respuesta inmunitaria protectora frente al VIH.

Sin embargo, los investigadores también han centrado su atención en las proteínas codificadas por otros genes del VIH, por ejemplo las de gag. El gen gag, tal como se conoce, codifica para una poliproteína precursora que tiene un peso molecular de aproximadamente 55.000 (p55), que se corta con la proteasa de pol en los polipéptidos p24, p17 y p15 que constituyen las proteínas estructurales del núcleo del virión.

Algunos estudios han indicado que los productos del gen gag pueden ser la diana de una respuesta inmunitaria neutralizante.

En particular, se ha dado a conocer que la proteína p17 del VIH puede ser la diana de los anticuerpos que neutralizan la replicación del VIH y que altos niveles de anticuerpos anti-p17 se correlacionan con una evolución más lenta del SIDA.

La patente estadounidense 5.185.147 presenta varias secuencias de polipéptidos aisladas basadas en la región amino terminal de p17, que se describe que pueden inducir la aparición de anticuerpos anti-p17 que interaccionan con la partícula viral del VIH modificando la capacidad de infección in vitro. Sin embargo, tal como se conoce a partir de estudios con microscopio electrónico (por ejemplo Andreassen, H., H. Bohr, J. Bohr, S. Brunak, T. Bugge, R.M.J. Cotterill, C. Jacobsen, P. Kush, B. Lautrup, S.B. Petersen, T. Saemark y K. Ulrich, 1990, J. Acquir. Immune Def. Syndr. 3:615-622) la proteína p17 está ubicada dentro de la partícula viral y por tanto no está disponible para la interacción con anticuerpos anti-p17. La modificación de la capacidad de infección in vitro de la partícula viral del VIH ob-
servada en este estudio, por tanto no es atribuible a una inhibición eficaz de la actividad biológica de la proteína p17.

El problema que trata la presente invención es el de encontrar polipéptidos basados en la secuencia de la proteína p17 que podrán inducir de manera eficaz la aparición de anticuerpos que neutralicen la actividad biológica de la proteína p17 del VIH.

Para resolver este problema, los presentes inventores en primer lugar han estudiado los mecanismos mediante los cuales la proteína p17 ejerce sus efectos biológicos.

Tal como se describirá en más detalle en la sección que se refiere a los ejemplos, se ha encontrado que la actividad biológica de p17 proviene por un lado de su capacidad para aumentar la producción de citocinas proinflamatorias que tienen acción pro-VIH, tales como IFN-\gamma y TNF-\alpha, y por otro lado, de su capacidad para aumentar la producción de estas citocinas proinflamatorias cuando se inhibe mediante citocinas antiinflamatorias, tales como por ejemplo IL-4.

Además, los presentes inventores han encontrado que la actividad biológica de la proteína p17 se desarrolla a través de una interacción entre la proteína en forma de una entidad distinta, separada de la partícula viral, y los receptores específicos expresados en la superficie de la célula diana del VIH. Hasta el momento no se ha sugerido la existencia de estos receptores de p17 en los linfocitos que son la diana del VIH.

La presente invención se basa en el descubrimiento de la interacción p17/receptor.

Al estudiar la interacción p17/receptor, los inventores de hecho han identificado una región de la proteína p17 que constituye la región que se une al receptor celular y que puede provocar la aparición de anticuerpos inhiban la actividad biológica de la proteína p17, así como su unión al propio receptor. En la presente descripción, se indicarán estos anticuerpos como "anticuerpos neutralizantes anti-p17" y, cuando sea apropiado, se indicará esta región de unión como el "epítopo neutralizante".

Por tanto, los inventores han verificado que los polipéptidos aislados, que tienen una secuencia de aminoácidos basada en la del epítopo neutralizante de la proteína p17, es decir la secuencia en la región N-terminal que se encuentra entre las posiciones de aminoácidos 9 y 22 de p17, resuelven el problema que trata la presente invención dado que, debido a su estructura secundaria, tales polipéptidos pueden inducir la aparición de anticuerpos que neutralizan la actividad biológica de la proteína p17. Por tanto, tales polipéptidos son particularmente adecuados para su uso en una vacuna para interferir con la replicación del VIH.

La numeración de los residuos de aminoácidos de la secuencia de p17 utilizada en este caso es según la propuesta en Ratner et al. (1985), Nature 313:277.

Además, se ha demostrado que los polipéptidos de la invención se reconocen específicamente por anticuerpos monoclonales anti-p17 neutralizantes, mientras que no se reconocen por anticuerpos monoclonales anti-p17 no neutralizantes. Por tanto, tales polipéptidos son particularmente adecuados para su uso en métodos de diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes anti-p17 en un sujeto infectado con VIH, así como en métodos para la purificación de tales anticuerpos.

Por tanto, un primer objeto de la invención es un polipéptido aislado que puede reaccionar específicamente con un anticuerpo neutralizante anti-p17 del VIH, que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde al epítopo neutralizante de la proteína p17 del VIH, es decir la secuencia que se encuentra entre la posición 9 y la posición 22 de la proteína p17 del VIH.

Tal como se describirá en más detalle en los ejemplos, los inventores han construido inicialmente un polipéptido sintético tal como se definió anteriormente, basado en la secuencia del epítopo neutralizante de la proteína p17 contenida en el plásmido BH10 (existencias de laboratorio). Este polipéptido sintético consiste en la secuencia NH_{2}-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-COOH (SEQ ID NO: 2). Los inventores han verificado experimentalmente que este polipéptido se reconoce específicamente por anticuerpos monoclonales neutralizantes obtenidos frente a p17 de BH10.

Por tanto, este polipéptido es adecuado para su uso como un inmunógeno que puede provocar la aparición de anticuerpos que neutralicen la actividad biológica de p17 de BH10.

Además se ha verificado que variantes de la proteína p17 característica de otras cepas del VIH tienen cambios en la región del epítopo neutralizante que, sin embargo, no alteran significativamente su reconocimiento por anticuerpos que neutralizan la actividad biológica de la p17. Entre estas variantes se citan, a modo de ejemplo ilustrativo, las secuencias de la p17 de cepas virales frecuentes en África (clado C).

Los polipéptidos aislados que consisten en una secuencia de aminoácidos basada en la secuencia que se encuentra entre las posiciones 9 y 22 de la proteína p17 de las cepas virales frecuentes en zonas geográficas específicas hacen posible por tanto obtener anticuerpos que tiene una mayor afinidad en comparación con la proteína p17 correspondiente y por tanto se prestan particularmente para su uso como vacunas para usar en estas zonas geográficas.

Usando la información de las secuencias contenidas en los bancos de datos genéticos (por ejemplo GenBank) relacionada con la secuencia de p17 de cepas que provienen de diferentes zonas geográficas, los presentes inventores por tanto han obtenido una serie de polipéptidos sintéticos correspondientes a las posiciones de 9 a 22 de la p17 de diferentes cepas del VIH, que comparten la propiedad inmunológica de reaccionar específicamente con anticuerpos neutralizantes dirigidos frente a p17 de la cepa correspondiente del VIH.

Estos polipéptidos consisten en la fórmula general: NH_{2}-X^{1}-Gly-X^{2}-X^{3}-Leu-Asp-X^{4}-Trp-Glu-X^{5}-Ile-X^{6}-Leu-Arg-COOH (SEQ ID NO: 1) en la que X^{1} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Ser y Arg; X^{2} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Gly, Glu y Ser; X^{3} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Glu, Lys, Asp y Arg; X^{4} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Arg, Ala, Lys, Thr, Ser, Glu, Asp y Gln; X^{5} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Lys, Arg y Ser; y X^{6} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Arg y Gln.

Todos los aminoácidos identificados en la presente descripción están en la configuración L. Las abreviaturas utilizadas para los residuos de aminoácidos son según la nomenclatura convencional.

Dentro del grupo de polipéptidos descritos anteriormente, el polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos NH_{2}-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-COOH (SEQ ID NO: 2) constituye la realización preferida. Este polipéptido corresponde a la secuencia entre las posiciones 9 y 22 de p17 de la cepa de laboratorio BH10 de VIH-1, que es representativa de las cepas existentes en Europa y América (clado B).

Para los fines de aumentar la solubilidad, los polipéptidos de la invención pueden unirse a una segunda secuencia de aminoácidos adecuada para este fin, tal como, por ejemplo, la secuencia -Pro-Gly-Gly-Lys-Lys-Lys-Tyr-Lys-COOH (SEQ ID NO: 3), que corresponde a las posiciones de 23 a 30 de la proteína p17 de la cepa HB10 de VIH-1.

En esta realización, la segunda secuencia de aminoácidos se une directamente al residuo carboxilo terminal del polipéptido según la invención.

Los polipéptidos de la invención tienen la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria neutralizante cuando se administra a un paciente infectado con la cepa correspondiente del VIH, y por tanto son adecuados para su uso en una vacuna.

Dentro de la presente descripción, el término vacuna pretende incluir una composición que comprende un polipéptido según la invención como principio activo y un vehículo farmacéuticamente aceptable, pudiendo inducir tal composición la inmunidad activa en un sujeto, por ejemplo un mamífero, incluyendo un ser humano, al que se administra en una cantidad eficaz.

Por tanto, un segundo objeto de la invención es una composición de vacuna que comprende un polipéptido de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una composición de este tipo también es adecuada para utilizarse como inóculo que va administrarse a un mamífero no humano para generar anticuerpos que reaccionan de manera inmunológica con el VIH, en particular anticuerpos anti-p17 neutralizantes del VIH.

En una realización preferida, cuando se utilizan los polipéptidos en una composición de vacuna o inóculo, los polipéptidos pueden conjugarse con una molécula portadora adecuada, es decir una molécula que puede acoplarse con el polipéptido y volverlo inmunogénico. Por tanto, un polipéptido tal como se definió anteriormente, que se conjuga con un portador, se encuentra dentro del alcance de la presente invención.

Ejemplos de portadores adecuados para este fin son proteínas tales como KLH ("hemocianina de lapa californiana"), edestina, tiroglobulina, albúminas tales como albúmina de suero bovino (BSA) o la albúmina de suero humano (HSA), eritrocitos tales como eritrocitos de oveja (SRBC), anatoxina tetánica, anatoxina colérica, poliaminoácidos tales como, por ejemplo, poli(D-lisina: ácido D-glutámico) y similares.

Para facilitar la unión del polipéptido a la molécula portadora, pueden añadirse residuos de aminoácidos al extremo N terminal o al extremo Terminal C del polipéptido. El uso de un residuo de cisteína (Cys) adicional al extremo Terminal C del polipéptido es particularmente adecuado para este fin, dado que, tal como se conoce, la cisteína puede formar puentes disulfuro.

Por consiguiente, cuando se conjuga el polipéptido de la invención con un portador, éste preferiblemente contiene un residuo de cisteína (Cys) adicional unido al residuo carboxilo terminal del polipéptido. En este contexto, la expresión residuo de carboxilo terminal del polipéptido pretende significar o bien el residuo carboxilo terminal de la secuencia que constituye el epítopo neutralizante de p17 (Arg 22 en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2) o bien el residuo carboxilo terminal de la segunda secuencia de aminoácidos que tienen la función de aumentar la solubilidad del polipéptido (Lys 30 en SEQ ID NO: 3).

Además, en otra realización, el polipéptido puede contener también un residuo adicional de norleucina (Nleu) en la posición C-terminal que precede al residuo de cisteína adicional mencionado anteriormente, para una mayor trazabilidad del péptido durante los procedimientos de conjugación con la molécula portadora.

Por tanto, en una realización de la invención, el polipéptido se conjuga con un portador, preferiblemente a través de un residuo de cisteína (Cys) adicional o un dipéptido de Nleu-Cys adicional en la posición carboxilo terminal.

Como una alternativa al uso de un portador, pueden usarse los polipéptidos de la invención en forma de péptidos ramificados.

Un polipéptido tal como se definió anteriormente, en forma de un péptido ramificado también se encuentra por tanto dentro del alcance de la presente invención.

La expresión "péptido ramificado" pretende indicar un complejo que tiene un alto peso molecular constituido por una pluralidad de copias idénticas de un polipéptido de la invención unidas a un núcleo central al que pueden unirse simultáneamente una pluralidad de copias idénticas de dicho polipéptido.

Puede obtenerse un péptido ramificado uniendo el polipéptido en varias copias a un núcleo central de "tecnología MAP" de polilisina, de tal modo que se logre un alto peso molecular y que sea inmunogénico incluso sin la presencia de la molécula portadora (Nordelly B., et al., 1992, J. Immunol. 148: 914-920). Además, el núcleo de polilisina puede modificarse tal como se describe por ejemplo en Okeda K., et al., 1993, Journal of Molecular Recognition 6:101-109 o puede sustituirse por otras sustancias, tales como, por ejemplo, glucosa que tiene la misma capacidad que la polilisina de unir varias moléculas del mismo polipéptido y por tanto generar complejos que tienen alto peso molecular.

La elección del portador o del tipo de núcleo se basa en criterios conocidos y es sustancialmente independiente del epítopo utilizado, por lo que no constituye un objeto específico de la presente invención y por tanto no se tratará en mayor detalle.

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La composición de vacuna o inóculo de la invención puede contener además componentes adicionales que incluyen, por ejemplo, un adyuvante antigénico, es decir una sustancia que puede aumentar la eficacia o inmunogenicidad de un antígeno.

Dado que algunos de los adyuvantes adecuados para animales no son adecuados para seres humanos, los adyuvantes de la vacuna y del inóculo puede ser iguales o diferentes.

Como adyuvantes que pueden usarse en una vacuna se enumeran a modo de ejemplo ilustrativo, alumbre (hidróxido de aluminio), el adyuvante incompleto de Freund y el compuesto MF59 descrito recientemente por Graham B.S., et al. (Ann. Int. Med. 1996, 125:270-279).

La vacuna o inóculo de la presente invención contiene una cantidad eficaz de un polipéptido de la invención. La cantidad eficaz de polipéptido por dosis unitaria depende de criterios, no obstante bien conocidos, que incluyen, entre otras cosas, la especie a la que pertenece el sujeto va a inocularse, el peso corporal del sujeto que va a inocularse y el régimen de administración predeterminado. Las vacunas y los inóculos normalmente contienen cantidades de polipéptido que pueden variar desde 1 hasta 100 microgramos/kg para su uso en mamíferos de tamaño promedio (cabras, perros, monos) y en seres humanos, y desde aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 500 microgramos por dosis en animales pequeños (ratones, ratas, conejos, hámsteres).

Estas cantidades se basan en el peso del polipéptido tal cual, sin tener en cuenta el peso del portador cuando se utiliza.

Tal como se indicó anteriormente, los polipéptidos de la invención pueden usarse como reactivos específicos en un ensayo para detectar la presencia en una muestra de un material biológico de anticuerpos neutralizantes anti-p17, es decir anticuerpos que se dirigen frente a la proteína p17 y que pueden neutralizar la actividad biológica de dicha proteína.

Este ensayo puede utilizarse por ejemplo para monitorizar los tratamientos antivirales y de inmunomodulación y para monitorizar la evolución de la infección por VIH.

Este ensayo también puede utilizarse para aplicaciones industriales, por ejemplo para el control de calidad de preparaciones de inmunoglobulina anti-p17 obtenidas mediante cromatografía u otras metodologías preparativas.

El ensayo para la detección de anticuerpos neutralizantes anti-p17 puede ser un ensayo inmunológico, tal como, por ejemplo, un ensayo inmunoenzimático en fase heterogénea (ELISA, técnica de inmunoabsorción ligada a enzimas) o en fase homogénea (EMIT, inmunoensayo enzimático homogéneo), un ensayo radioinmunológico, un ensayo radioinmunológico basado en la fluorescencia, un ensayo de inmunotransferencia de tipo Western, o cualquier otra técnica en la que se marca el anticuerpo o el antígeno con una molécula detectable o con cualquier otro medio indicador.

Como antígeno puede utilizarse un polipéptido aislado basado en el epítopo neutralizante de p17 según la invención o una mezcla de tales polipéptidos. El polipéptido puede conjugarse opcionalmente con una molécula portadora con el fin de facilitar su unión a un soporte o para aumentar el peso molecular para un mejor reconocimiento en los análisis de inmunotransferencias de tipo Western.

Por ejemplo, en una prueba de ELISA inmunoenzimática, un polipéptido según la invención que se utiliza como antígeno, puede recubrirse en un soporte sólido, tal como, por ejemplo, una placa de microtitulación, una tira, o un pocillo, usando métodos conocidos en la técnica.

Entonces, se incuba el antígeno unido al soporte sólido con una muestra del material biológico de interés, es decir el material dentro del cual se desea verificar la presencia de anticuerpos neutralizantes anti-p17.

Este material biológico puede ser, por ejemplo, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, orina, saliva, o liquido de cultivo celular o de cultivo tisular y similares.

El anticuerpo unido puede detectarse mediante la adición de un antisuero o un anticuerpo monoclonal conjugado con una enzima. Para este fin, puede utilizarse cualquier marcador enzimático conocido en la técnica (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, etc.). La sensibilidad de la prueba puede mejorarse adicionalmente con el uso de un sistema de biotina-avidina o estreptavidina para la detección del analito.

La detección final puede obtenerse mediante la adición de una disolución de sustrato, que varía dependiendo de la enzima utilizada. Ejemplos de sustratos adecuados son O-fenilendiamina, tetrametilbencidina, fosfato de paranitrofenilo. Los resultados pueden leerse a simple vista o con un espectrofotómetro.

La prueba para la detección de los anticuerpos neutralizantes anti-p17 puede ser cualitativa o cuantitativa. Una prueba cuantitativa puede obtenerse con metodologías conocidas en la técnica, por ejemplo dilución de punto final o construcción de una curva de referencia.

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Los polipéptidos de la invención además pueden utilizarse como reactivos específicos para la purificación de anticuerpos neutralizantes anti-p17 de una muestra biológica. Tal muestra biológica puede ser una muestra de material biológico tomada de un sujeto, tal como, por ejemplo, una muestra de sangre, plasma, suero, saliva, orina o una muestra de líquido ascítico, líquido de cultivo tisular o celular, o una preparación de inmunoglobulina.

Dicho sujeto puede ser por ejemplo un paciente humano infectado con el virus VIH o un mamífero no humano inoculado previamente con una proteína que pueda generar anticuerpos neutralizantes anti-p17. Tal proteína por ejemplo puede ser la proteína p17 del VIH en una forma sustancialmente purificada o recombinante, o un polipéptido derivado del mismo que contiene al menos el epítopo neutralizante de p17 identificado en la presente invención, conjugándose opcionalmente dicho polipéptido con un portador, o en forma de un péptido ramificado, o en cualquier otra forma inmunogénica.

En este contexto, la expresión "proteína p17 en una forma sustancialmente purificada" pretende indicar la proteína p17 sustancialmente aislada del resto de la partícula viral.

Los anticuerpos neutralizantes pueden purificarse con cualquier técnica de purificación por afinidad conocida en la técnica utilizando un polipéptido según la invención o una mezcla de tales polipéptidos como reactivo de purifica-
ción.

Para este fin, se une el polipéptido utilizado como el reactivo de purificación a una matriz adecuada para su uso en las técnicas de purificación por afinidad, tales como, por ejemplo, agarosa, gel de sílice, poliacrilamida, perlas magnéticas y similares.

La unión del polipéptido a la matriz puede lograrse reticulando los grupos funcionales presentes en la matriz y en el péptido mediante la interposición de un brazo espaciador. Los brazos espaciadores generalmente son cadenas alifáticas C_{6}-C_{8} con grupos funcionales que pueden formar un puente entre la matriz y el péptido. Para este fin, pueden usarse tanto grupos funcionales hidrófobos (por ejemplo, un brazo espaciador que incluye un anillo de benceno) como grupos funcionales hidrófilos (por ejemplo alcoholes). Como alternativa a los brazos espaciadores, pueden utilizarse moléculas portadoras o biotina.

Para evitar la desnaturalización del péptido y para facilitar su unión a la matriz, puede ser útil activar previamente la matriz de modo que pueda obtenerse la unión posterior del ligando en condiciones suaves.

La activación es una reacción química entre la matriz y los compuestos activadores que conduce a la formación, en la superficie de la propia matriz, de grupos reactivos que se combinan inmediatamente con grupos ligandos. Los grupos reactivos tales como imidocarbonato, oxirano, triclorotriazina, O-imidazolilcarbonilo, etc., se conocen en la técnica. Puede activarse un brazo espaciador con un grupo amino terminal mediante la reacción con un éster de
N-hidroxosuccinamida o con ácido bromoacético dando un agente alquilante altamente reactivo.

Alternativamente, el polipéptido puede unirse a una matriz por medio de enlaces no covalentes, por ejemplo utilizando una resina de triazina.

Finalmente, el polipéptido puede unirse a una matriz mediante enlaces covalentes reversibles.

El enlace de afinidad entre el polipéptido unido a la matriz y los anticuerpos anti-p17 puede romperse o bien directamente, creando condiciones que pongan freno a interacciones bioespecíficas, o bien mediante una elución de afinidad competitiva.

Los anticuerpos anti-p17 que se unen específicamente a un polipéptido de la presente invención pueden neutralizar la actividad biológica de la proteína p17 del VIH e interferir con la interacción entre la proteína y su receptor celular (véase el ejemplo 7).

Tales anticuerpos pueden obtenerse mediante el procedimiento de purificación descrito anteriormente o en forma de anticuerpos monoclonales con el método de fusión celular descrito en el ejemplo 6.

Los inventores también han verificado que los anticuerpos monoclonales anti-p17 que no tienen capacidad para neutralizar la actividad biológica de la proteína p17 del VIH tampoco pueden unirse al epítopo neutralizante de p17 en un ensayo de ELISA en fase sólida (véase el ejemplo 8).

Un objeto adicional de la presente invención es por tanto un anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido frente a la proteína p17 del VIH, que puede neutralizar la actividad biológica de la proteína p17 del VIH y reconocer específicamente el epítopo neutralizante de la proteína p17 del VIH, consistiendo dicho epítopo neutralizante en la secuencia de aminoácidos que se encuentra entre la posición 9 y la posición 22 de la proteína p17 del VIH.

En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos del epítopo neutralizante reconocida por el anticuerpo según la invención es la secuencia: X^{1}-Gly-X^{2}-X^{3}-Leu-Asp-X^{4}-Trp-Glu-X^{5}-Ile-X^{6}-Leu-Arg- (SEQ ID NO: 1) en la que X^{1} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Ser y Arg; X^{2} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Gly, Glu y Ser; X^{3} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Glu, Lys, Asp y Arg; X^{4} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Arg, Ala, Lys, Thr, Ser, Glu, Asp y Gln; X^{5} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Lys, Arg y Ser; y X^{6} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Arg y Gln.

Más preferiblemente, dicha secuencia de aminoácidos es la secuencia -Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg (SEQ ID NO: 2).

Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en aplicaciones terapéuticas o profilácticas clínicas, como antagonistas específicos de la proteína p17 para inmunosuprimir selectivamente la respuesta fisiológica inducida con esta proteína viral y, más específicamente, las respuestas que están implicadas en la regulación por incremento del proceso inmunitario proinflamatorio y que son dependientes de la interacción de p17 con su receptor celular.

Otro objeto de la presente invención es por tanto el uso de un anticuerpo tal como se definió anteriormente para la preparación de un medicamento para inhibir los efectos inmunoestimulantes de la proteína p17 del VIH producidos durante el transcurso de una infección por VIH.

Para este fin, pueden usarse los anticuerpos de la invención en su forma nativa, o en una forma desnaturalizada o en forma de fragmentos de inmunoglobulina de unión a antígeno (es decir fragmentos F(Ab')_{2}, Fab, Fab' o Fv). Estos fragmentos de inmunoglobulina pueden obtenerse químicamente, enzimáticamente o mediante técnicas de ADN recombinante, por ejemplo minianticuerpos.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo preferiblemente se administran por vía parenteral, más preferiblemente por vía intravenosa; además se prefiere enormemente una administración lenta, por ejemplo mediante un equipo de administración intravenosa convencional o partir de un medicamento subcutáneo de absorción lenta.

Cuando se administra por vía parenteral, los anticuerpos se formulan en una unidad de dosificación en forma inyectable, por ejemplo una disolución, una emulsión o una suspensión, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo puede ser acuoso o no acuoso y, además, puede contener sustancias que pueden aumentar la isotonicidad y la estabilidad química del medicamento. El anticuerpo se formula preferiblemente en forma purificada, sustancialmente libre de agregados y otras proteínas, y a diversas concentraciones que oscilan preferiblemente desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 20 mg/ml.

La dosis que va administrarse se determina midiendo el efecto del anticuerpo anti-p17 en la reducción de los parámetros que son indicativos de la enfermedad que va tratarse. Considerando el aclaramiento natural de los anticuerpos, puede repetirse la dosis periódicamente según el estado clínico del paciente y el grado de replicación del VIH. Cuando se usa como profilaxis, puede ser posible administrar tandas cortas de anticuerpos anti-p17 cada dos meses, cada seis meses o cada año.

Además, los anticuerpos de la invención pueden usarse como reactivos específicos en un ensayo para la detección de la proteína p17 en una muestra de un material biológico, tal como, por ejemplo, una muestra de líquido de cultivo tisular o cultivo celular o una muestra de un material biológico tomada de un paciente.

Este ensayo de detección de antígenos puede basarse en cualquier técnica convencional, tal como inmunoensayo competitivo o de captura (RIA, ELISA, inmunotransferencia de tipo Western, TR-FIA etc.). Para realizar inmunoensayos competitivos, pueden usarse la proteína p17 natural o recombinante o uno o más de los polipéptidos basados en el epítopo neutralizante de la proteína p17 según la presente invención. Éstos pueden conjugarse con marcadores tales como, por ejemplo, enzimas para técnicas de ELISA, materiales radioactivos para técnicas de RIA, o moléculas fluorescentes para técnicas de TR-FIA u otras técnicas inmunofluorescentes. La detección del antígeno puede obtenerse mediante inmunofluorescencia, citometría de flujo u otras técnicas conocidas en la técnica.

Los ejemplos que siguen se facilitan a modo de ilustración y no pretenden limitar en modo alguno el alcance de la presente invención.

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Ejemplos Ejemplo 1 Producción de p17 recombinante

Se amplificó la secuencia codificante de la proteína p17 del aislado BH-10 del VIH-1 (aminoácidos 1-32, Ratner, L., W. Haseltine, R. Patarca, K.J. Livak, B. Starcich, S.F. Josephs, E.R. Doran, J.A. Rafalski, E.A. Whitehoren, K. Baumeister, L. Ivanoff, S.R. Petteway, M.L. Pearson, J.a. Lautenberger, T.S. Papas, J. Ghrayeb, N.T. Chang, R.C. Gallo y F. Wong-Staal, 1985, Nature 313:277-284) mediante PCR y se clonó en el sitio BamH1 del plásmido pGEX-2T (Pharmacia, Uppsala, Suecia) que permitió su fusión con el extremo NH_{2}-terminal de la enzima glutatión
S-transferasa (GST).

Los cebadores y las secuencias de oligonucleótidos utilizadas se basaron en la entrada HIVBH10 del banco de datos GenBank, que corresponde al genoma completo del aislado BH-10 del VIH-1. Se confirmó la secuencia correcta del gen de p17 clonado usando los cebadores de secuenciación pGEX (Pharmacia), un secuenciador de ADN automático (ABI PRISM 310; Perkin Elmer, Foster City, CA) y el kit de reacción Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction para el equipo ABI PRISM con ADN polimerasa AmpliTaq FS (Perkin Elmer).

Se expresaron las proteínas de fusión de GST en Escherichia coli y se purificaron utilizando perlas de glutatión-sefarosa 4B (Pharmacia). Se cortó la proteína viral con GST mientras que aún estaba unida a las perlas de agarosa-glutatión, tal como se describe en Gearing, D.P., N.A. Nicola, D. Metcalf, S. Foote, T.A. Willson, N.M. Gough, y R.L. Williams, 1989, BioTechnology 7:1157-1161).

Se purificó además la proteína p17 mediante FLPC de fase inversa, alcanzando una pureza mayor del 98%.

Se verificó la ausencia de contaminación por endotoxinas en la preparación de p17 recombinante del VIH-1 (<0,1 unidades de endotoxina/ml) con la prueba basada en los amebocitos de Limulus (Whitaker BioProducts, Inc, Walkersville, Maryland, EE.UU.). También se biotiniló la p17 purificada del VIH-1 utilizando AH-NHS-biotina (SPA, Milán, Italia) según las instrucciones del fabricante.

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Ejemplo 2 Cultivo de células sanguíneas mononucleadas periféricas (PBMC)

Se aislaron las PBMC mediante gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque (Pharmacia) a partir de sangre heparinizada recién recogida de sujetos sanos. Se sembraron las células en placas de cultivo de 96 pocillos con fondo en U (Nunc, Roskild, Dinamarca) a una densidad de 10^{6} células/ml y se cultivaron durante el número de días indicado a 37ºC en medio RPMI-1640 (Sigma, San Luis, MO) complementado con 10% de suero AB humano inactivado mediante calentamiento (Sigma), 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de medio completo de estreptomicina.

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Ejemplo 3 Efecto de p17 en la secreción de TNF-\alpha e INF-\gamma en PBMC estimuladas con IL-2

Para evaluar si p17 puede influir en la producción de algunas citocinas proinflamatorias, es decir TNF-\alpha e INF-\gamma, que se conoce bien que crean un entorno más adecuado para la replicación del VIH-1, se llevaron a cabo una serie de experimentos para medir la secreción de estas citocinas en PBMC en un cultivo estimulado con IL-2 en ausencia y en presencia de p17. Se sometieron a prueba diversas dosis de IL-2 desde 2,5 hasta 100 U/ml.

En todos los sujetos analizados, una dosis de 20 U/ml dio una inducción consistente de la secreción tanto de TNF-\alpha como de INF-\gamma en el sobrenadantes del cultivo de PBMC. La adición de p17 a diferente dosis aumentó la producción de estas citocinas en las PBMC tratadas con IL-2. Se observó el máximo aumento a una concentración de p17 de 50 ng/ml, aunque la p17 era biológicamente activa a concentraciones bajas de hasta 5 ng/ml. A una concentración de p17 de 50 ng/ml, el aumento era más pronunciado para TNF-\alpha (desde el 36 hasta más del 100%) que para INF-\gamma (desde el 29 hasta el 50%).

No se observó aumento en la producción de citocinas por p17 en los cultivos de PBMC no estimulados.

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Ejemplo 4 Inversión de la inhibición inducida por IL-4 en la producción de TNF-\alpha e INF-\gamma con p17

La adición de IL-4 a los cultivos de PBMC estimulados con IL-2 redujo tanto la producción de INF-\gamma como la de TNF-\alpha. La reducción en la secreción de INF-\gamma estuvo entre el 62 y el 83%, mientras que la reducción en la secreción de TNF-\alpha estuvo entre el 68 y el 84%.

Para verificar si p17 puede contrarrestar los efectos inhibidores de IL-4, se añadió la proteína viral a las PBMC al inicio del cultivo simultáneamente con IL-2 e IL-4.

Tras 72 horas en cultivo, se recogieron los sobrenadantes y se analizaron para determinar la secreción de TNF-\alpha e INF-\gamma.

En todos los experimentos realizados, los resultados obtenidos muestran que p17 puede restaurar la capacidad de PBMC para producir TNF-\alpha e INF-\gamma, con una recuperación respectivamente del 88-100% y del 77-89%.

Ejemplo 5 Prueba para la unión de p17 a un receptor celular específico

Para establecer si la actividad de p17 se debe a la interacción con un receptor expresado en la célula diana, se conjugó la proteína viral con biotina y se hizo reaccionar con PBMC recién aisladas de sujetos sanos o estimuladas durante 48 horas con fitohemaglutinina (PHA).

Entonces se identificó la p17 en la superficie celular mediante el uso de estreptavidina marcada con ficoeritrina mediante citometría de flujo.

El experimento se llevó a cabo de la siguiente manera. Las PBMC se estimularon o no durante dos días con PHA a una concentración de 5 \mug/ml y entonces se incubaron durante 30 minutos en hielo con diferentes cantidades de p17 biotinilado que oscilaban entre 50 ng/ml y 1,6 \mug/ml. Se lavaron las PBMC dos veces con PBS y se incubaron durante 30 minutos en hielo con una cantidad adecuada de estreptavidina conjugada con ficoeritrina (Becton Dickinson, San José, California) diluida en PBS que contenía el 2% de suero bovino fetal (FCS). En algunos experimentos, también se colorearon las células con anticuerpos monoclonales anti-CD-4, anti-CD-8, anti-CD-16 o anti-CD-19 conjugados con isotiocinato de fluoresceína (FITC) (Becton Dickinson). Para evaluar la fluorescencia de fondo, se incluyeron conjugados de anticuerpos para el control del isotipo IgG (Becton Dickinson). Entonces, se lavaron las células dos veces con PBS que contenía el 2% de FCS y el 0,2% de NaN_{3} y se analizaron en un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson). Se realizó el análisis utilizando el software CellQuest (Becton Dickinson).

Los resultados obtenidos en PBMC recién aisladas de un paciente muestran que la p17 no se une a los linfocitos T CD-4+ y los linfocitos T CD-8+, ni a las células NK (CD-16+), sino que, en cambio, esta presente en la superficie de la mayoría de los linfocitos B (CD-19+). Por el contrario, cuando se estimulan, los linfocitos T CD-4+ y T CD-8+ y los linfocitos NK adquieren la capacidad de unirse a la p17.

Los datos demuestran que existe un receptor para p17 del VIH en linfocitos circulantes y que se expresa de manera constitutiva en los linfocitos B mientras que se expresa de manera inducible en la superficie de los linfocitos T.

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Ejemplo 6 Producción de anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-p17

Se inmunizaron por primera vez ratones hembras Balb/c con 100 \mug de p17 del ejemplo 1 emulsionada en adyuvante completo de Freund y se administró inmunización de refuerzo a intervalos de 15 días con 100 \mug de proteína en adyuvante incompleto. Tras tres días de la inmunización de refuerzo n.º 4 se extrajeron los bazos para fusión celular. Horan Hand, P., A. Thor, D. Wunderlich, R. Muraro, A. Caruso y J. Schlom, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5227-5231 describieron el protocolo de fusión, que prevé el uso de células de mieloma de ratón NS-0 en presencia de polietilenglicol al 50%.

Se determinó la especificidad de los anticuerpos mediante ELISA e inmunotransferencia de tipo Western. En resumen, se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos hechas de poliestireno con p17 (0,25 \mug/pocillo) en tampón carbonato. Tras lavar con PBS que contenía el 0,05% de Tween-20 (v/v), se añadió el sobrenadante del cultivo tisular de hibridoma a los pocillos recubiertos con p17. Tras una hora de incubación a 37ºC y lavado, se detectó la unión de los anticuerpos monoclonales frente a p17 usando anticuerpos de cabra IgG anti-ratón conjugados con peroxidasa de rábano picante (Deco, Glostra, Dinamarca) seguido de la adición de O-fenilendiamina como sustrato para la reacción colorimétrica.

Se evaluó la reactividad de los anticuerpos monoclonales con p17 nativa mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western utilizando un kit comercial para el análisis de inmunotransferencia de tipo Western del VIH-1 (Sanofi Diagnostic Pasteur, Marnes La Coquette, Francia).

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Ejemplo 7 Prueba para la neutralización de la actividad biológica de p17 del VIH-1

Se comprobó si los anticuerpos monoclonales anti-p17 obtenidos en el ejemplo 6 podían influir en la actividad biológica de p17 y en la interacción de la proteína con su receptor celular expresado en linfocitos T y B.

Se cultivaron las PBMC por triplicado en placas de 96 pocillos con fondos en U en medio completo con IL-2 (a una concentración de 20 U/ml) en presencia o en ausencia de diferentes concentraciones de p17 recombinante purificada (que oscilaron entre 2,5 y 100 ng/ml). Se obtuvo la inhibición de las secreciones de TNF-\alpha e INF-\gamma añadiendo IL-4 (20 ng/ml) a las células estimuladas con IL-2. Al inicio del cultivo, se añadieron los anticuerpos anti-p17 a las células en concentraciones que oscilaron entre 0,5 y 10 \mug/ml. Tras tres días de activación celular, se recogieron los sobrenadantes del cultivo y se sometieron a prueba para determinar la presencia de TNF-\alpha e INF-\gamma.

También se utilizaron anticuerpos anti-p17 en las concentraciones anteriormente indicadas para bloquear la unión de p17 con el receptor celular expresado en los linfocitos T y B. Se evalúo la capacidad de los anticuerpos para bloquear la unión p17/receptor mediante citometría de flujo.

Entre los diversos anticuerpos obtenidos en el ejemplo 6, sólo uno de ellos denominado MBS-3 pudo bloquear los efectos de p17 en la secreción de citocinas proinflamatorias. De hecho, las células PBMC estimuladas con IL-2 y p17 redujeron la producción de INF-\gamma y TNF-\alpha a niveles comparables con los obtenidos en cultivos estimulados con IL-2 sólo cuando se añadió el anticuerpo monoclonal MBS-3 al cultivo al inicio de la estimulación con el mitógeno (datos no mostrados).

La adición de MBS-3 a los cultivos estimulados con IL-2 más IL-4 y p17 bloqueó completamente la capacidad de la proteína viral para invertir la actividad inhibidora de IL-4.

Otros anticuerpos monoclonales anti-p17, y entre éstos uno en particular denominado MK-1, no mostraron ninguna capacidad para la neutralización. Además, la adición de MBS-3 al inicio de la estimulación con el mitógeno no interfirió, en ausencia de p17, con la síntesis de las citocinas proinflamatorias y con la IL-4 inhibidora. Finalmente, MBS-3 (pero no MK-1) bloqueó completamente la unión de p17 con su receptor de una manera dependiente de la dosis.

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Ejemplo 8 Mapeo de epítopos

Se caracterizó el anticuerpo monoclonal neutralizante anti-p17 uniendo a los epítopos específicos de p17 mediante la técnica de mapeo de epítopos.

Basándose en la secuencia conocida de p17 de la cepa HB10 del VIH-1, se sintetizaron 62 péptidos de 10 aminoácidos de longitud. Estos péptidos eran representativos de toda la longitud de p17 y coincidían entre sí con un cambio en toda la molécula de p17 de dos aminoácidos.

Como control positivo para la síntesis de los péptidos y para la reactividad de los anticuerpos, también se sintetizó el polipéptido EAENLKKYFN (un código de letras) de INF-\gamma, que reconoce el anticuerpo monoclonal IGMB-15 (Caruso A., L. Tiberio, C. De Rango, C. Bonfanti, G. Flamminio, G. Gribaudo, E. Monti, E. Viani, N. Manca, G. Garotta, S. Landolfo, A. Balsari y A. Turano, 1993, J. Immonol. 150:1029-1035).

Se sintetizaron los péptidos utilizando un kit de síntesis SPOT (Genosys Biotechnologies, Pampisfors, Gran Bretaña) en una membrana celular de 8 x 12 cm de área derivatizada con un dímero de \beta-alanina que tiene grupos amino (NH_{2}) expuestos. Se evaluó la reactividad de los anticuerpos monoclonales frente a los péptidos según las instrucciones del proveedor.

Entonces, se identificó la región de unión de MBS-3 en la secuencia incluida entre las posiciones 9 y 22 de p17 (SEQ ID NO: 2). También se reconoció el mismo péptido por otros dos anticuerpos neutralizantes anti-p17 en una prueba de ELISA en fase sólida, mientras que no se reconocieron otros anticuerpos anti-p17 no neutralizantes.

Además, en una prueba de ELISA competitiva, los péptidos anteriormente indicados fueron eficaces en desplazar la unión del anticuerpo MBS-3 hacia p17 absorbida en fase sólida.

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Ejemplo 9 Cromatografía de afinidad anticuerpos anti-p17

Se unieron 2 mg de péptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 con un residuo adicional de lisina (Lys) en su extremo C-terminal con 2 ml de gel de acoplamiento Sulfolink (Pierce, Rockford, IL) siguiendo el protocolo convencional recomendado por Pierce. Se conectó la columna de afinidad a un aparato de FPLC (Pharmacia) y se equilibró con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se aplicaron los sobrenadantes de hibridoma que contenían los anticuerpos monoclonales anti-p17 MBS-3 a la columna a una velocidad de flujo de 0,1 ml/min. y se eluyeron los anticuerpos unidos a la misma velocidad de flujo con glicina 0,1 M, pH 3,0. Se encontró que los anticuerpos eluidos reconocen específicamente la proteína p17 en el análisis mediante inmunotransferencia de tipo Western (datos no mostrados).

<110> Medestea Internazionale s.r.l.

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<120> Polipéptido aislados basados en el epítopo neutralizante de la proteína p17 del VIH útiles como vacunas, y anticuerpos anti-p17 neutralizantes que reconocen específicamente dicho epítopo neutralizante

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<130> Documento E051056

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<160> 3

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> VIH

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<220>

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<221> MISC_FEATURE

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<222> (1)..(14)

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<223> Xaa en la posición 1 se selecciona de Ser y Arg; Xaa en la posición 3 se seleccionad de Gly, Glu y Ser; Xaa en la posición 4 se selecciona de Glu, Lys, Asp y Arg; Xaa en la posición 7 se seleccionad de Arg, Ala, Lys, Thr, Ser, Glu, Asp y Gln; Xaa en la posición 10 se selecciona de Lys, Arg y Ser; Xaa en la posición 12 se selecciona de Arg y Gln

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<400> 1

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\hskip1cm

1

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<210> 2

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> VIH

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<400> 2

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\hskip1cm

2

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<210> 3

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> VIH

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<400> 3

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\hskip1cm

3

Claims (18)

1. Polipéptido aislado que puede reaccionar específicamente con un anticuerpo neutralizante anti-p17 del VIH que consiste en la secuencia de aminoácidos NH_{2}-X^{1}-Gly-X^{2}-X^{3}-Leu-Asp-X^{4}-Trp-Glu-X^{5}-Ile-X^{6}-Leu-Arg-COOH (SEQ ID NO: 1) en la que X^{1} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Ser y Arg, X^{2} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Gly, Glu y Ser; X^{3} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Glu, Lys, Asp y Arg; X^{4} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Arg, Ala, Lys, Thr, Ser, Glu, Asp y Gln; X^{5} es un aminoácido seleccionado entre Lys, Arg y Ser; y X^{6} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Arg y Gln, siendo dicha secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 la secuencia del epítopo neutralizante de la proteína p17 del VIH entre las posiciones
9 y 22.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de aminoácidos es NH_{2}-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-COOH (SEQ ID NO: 2).

3. Polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, en el que una segunda secuencia de aminoácidos que puede aumentar la solubilidad del polipéptido se une directamente al residuo de aminoácido en la posición carboxilo terminal de dicha secuencia de aminoácidos del epítopo neutralizante de la proteína p17 del VIH.

4. Polipéptido según la reivindicación 3, en el que la segunda secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 3.

5. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que está conjugado con un portador.

6. Polipéptido según la reivindicación 5, que está conjugado con un portador mediante un residuo de cisteína (Cys) adicional o un dipéptido adicional -Nleu-Cys en la posición carboxilo terminal.

7. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que está en forma de un péptido ramificado.

8. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso como una vacuna o un inóculo que puede generar una respuesta inmunitaria que neutraliza la actividad biológica de la proteína p17 del VIH.

9. Composición farmacéutica de vacuna o inóculo que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para la preparación de un medicamento que puede generar una respuesta inmunitaria que neutraliza la actividad biológica de la proteína p17 del VIH en un sujeto al que se administra.

11. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 como reactivo específico en una prueba para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes anti-p17 del VIH en una muestra de material biológico.

12. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 como un reactivo específico para la purificación de anticuerpos neutralizantes anti-p17 del VIH de una muestra de material biológico.

13. Anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido frente a la proteína p17 del VIH, que puede neutralizar la actividad biológica de la proteína p17 del VIH y reconocer específicamente el epítopo neutralizante de la proteína p17 del VIH, siendo dicho epítopo neutralizante la secuencia de aminoácidos que se encuentra entre la posición 9 y la posición 22 de la proteína p17 del VIH y que consiste en -X^{1}-Gly-X^{2}-X^{3}-Leu-Asp-X^{4}-Trp-Glu-X^{5}-Ile-X^{6}-Leu-Arg- (SEQ ID NO: 1) en la que X^{1} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Ser y Arg; X^{2} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Gly, Glu y Ser; X^{3} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Glu, Lys, Asp y Arg; X^{4} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Arg, Ala, Lys, Thr, Ser, Glu, Asp y Gln; X^{5} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Lys, Arg y Ser; y X^{6} es un residuo de aminoácido seleccionado entre Arg y Gln.

14. Anticuerpo según la reivindicación 13, en el que dicha secuencia de aminoácidos es la secuencia: -Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg- (SEQ ID NO: 2).

15. Anticuerpo según las reivindicaciones 13 ó 14, que es un fragmento de inmunoglobulina F(ab')_{2}, Fab, Fab' o Fv.

16. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 13-15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 13-15 para la preparación de un medicamento terapéutico o profiláctico que puede inhibir la actividad inmunoestimulante de la proteína p17 del VIH producida en el transcurso de una infección por VIH.

18. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 13-15 como un reactivo específico en una prueba para detectar la presencia de la proteína p17 del VIH en una muestra de material biológico.