JP4278293B2 - Hivの増殖を抑える方法及び組成物 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、一般に、症候性又は無症候性の感染患者におけるヒト免疫不全ウイルス−1(HIV−1)の増殖を阻害すること、及び感染経験の無い被検者の一次感染時におけるHIV−1増殖を緩和してAIDSへの進行を最少化するのに有用な組成物及び方法に関する。
背景技術
血清変換(seroconversion)の疾患であるHIV−1一次感染時には、高血漿レベルのヒト免疫不全ウイルス1型(HIV−1)RNAが見出される[C.Baumberberら、AIDS,7:(補遺2):S59(1993);M.S.Saagら、Nature Med.,2:625(1996)]が、その後それは免疫応答が感染を様々な程度に抑制するにつれて沈静化する。血清変換の後では、より低いが検出可能なレベルの血清HIV−1RNAが存在していて、このレベルは疾患の進行につれて上昇し、AIDSの段階になると最高レベルに到達する[M.S.Saagら、Nature Med.,2:265(1996)]。
【0002】
血清変換の時には約50%の患者が症候性の疾患を有していて[B.TindallとD.A.Cooper,AIDS,5:1(1991)]、症候性の血清変換がAIDS発症の高リスクと関連しているのは、重篤な主要疾患が恐らくはHIVの初期の広汎な広がりに関連しているためであろう。
【0003】
初期感染時にウイルス増殖を阻害すれば、AIDSにつながるその後の慢性ウイルス血症の発症が抑えられるだろう。汚染された血液のついた針で刺すこと又はHIVに感染した母親の妊娠のような「リスクがある」と定義された状況に対して抗ウイルス薬を投与する現代の医療はこのコンセプトを支持する。
【0004】
血清変換後の血漿HIV−1RNAレベルは、AIDSへの進行の可能性を最も強力に予知するものであることが証明されている[J.W.Mellorら、Science,272:1167(1996):M.S.Saagら、Nature Med.,2:265(1996);R.W.Coombsら、J.Inf.Dis.,174:704(1996):S.L.Wellesら、J.Inf.Dis.,174:696(1990)]。細胞性RNA[K.Sakselaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:1104(1994)及び細胞性HIVプロウイルスDNA[T−H.Leeら、J.Acq.Imm.Def.Syndromes,7:381(1994)]のような他のウイルス負荷測定も同様に、その後の疾患進行を決定するウイルス負荷を確証することにおける初期感染の重要性を立証する。
【0005】
従って、初期感染のときにHIV−1の感染性を阻害する及び/又は血清変換後のウイルス負荷を低下させるどんな介入もAIDSへの進行を遅延するか又は防止して、最終的な結果に好ましい影響を及ぼす。
【0006】
ヒト免疫不全ウイルス(HIV−1)に感染した患者を治療するために、プロテアーゼ阻害剤の複合療法を包含する、多種多様な治療法が利用されている。しかしながら、残念なことに、このタイプの治療法はある患者には重篤な副作用の原因となっている。別のやり方では、非感染者に対するHIV−1の伝播をコントロールするためにワクチンが開発されている。しかし、この営為が主として、被感染細胞の消滅に関わる細胞毒性的なT細胞によって認識される被感染細胞の表面に発現されるウイルスのタンパク質に向けられきた一方で、フリーなウイルスは、ウイルス粒子の表面抗原に対する抗体によって阻止され一掃されている。この形式の予防接種の限界はHIV−1とってすぐに明らかである。免疫原のウイルスエピトープに著しい多様性があり、個人の内部及び個人間で急速な突然変異の起こることが示されているからである[B.D.Prestonら、Science,242:1168(1988);J.D.Robertsら、Science,242:1171(1988);A.R.Meyerhansら、Cell,58:901(1989);K.Kusumiら、J.Viol.,66:875(1992);B.A.Larderら、Science,243:1731(1989);M.S.Sangら、N.Engl.J.Med.,329:1065(1993);M.A.Sandeら、JAMA,270:2583(1993);M.Seligmanら、Lancet,343:871(1994);G.Meyerら、Human retroviruses and AIDS 1993,I−V.A complication and analysis of nucleic acid and amino acid sequences.Los Alamos National Laboratory, ロスアラモス、NM.]。
【0007】
HIV−1株の変異及びウイルスタンパク質の頻繁な突然変異は、従来のワクチンアプローチの成功する応用を阻んできた[W.E.Paul,Cell,82:177(1995);J.E.Osborn,J.Acq.Imm.Def.Syndr.Hum.Retrovirol.,9:26(1995)]。突然変異及び抵抗性変異体を選別することは、成功するHIV−1ワクチンの開発における中心的な問題である[M.D.Danielら、Science,258:1938(1992);N.L.Letvin,N.Engl.J.Med.,329:1400(1993);M.Clericiら、AIDS,8:1391(1994);S.M.Wolinskyら、Science,272:537(1996)]。
【0008】
HIV−1治療に対する他のアプローチは、ウイルスの転写に必須なタンパク質(Tat)を産生するHIV−1のトランス活性化(tat)遺伝子に集中してきた。tat遺伝子及びそのタンパク質は配列決定され、HIV−1の提案された治療法との関わりが検証されてきた[例えば、米国特許第5,158,877号;米国特許第5,238,832号;米国特許第5,110,802号;国際特許出願第WO92/07871号(1992年5月14日公開);国際特許出願第WO91/10453号(1991年7月25日公開);国際特許出願第WO91/09958号(1991年7月11日公開);国際特許出願第WO87/02989号(1987年5月21日公開)を参照のこと]。Tatタンパク質は細胞外に遊離され、他の被感染細胞に取込まれてその細胞内のHIV−1の転写を増強したり、非感染細胞に取込まれて宿主細胞の遺伝子を活性化しウイルスによる感染にその細胞を罹りやすくする。細胞によるTatの取込みは非常に強く、このタンパク質の短い基本配列によって仲介されていると報じられている[S.Fawellら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91:664−668(1994)]。
【0009】
1992年9月3日に公開された国際特許出願第WO92/14755号は、Tatタンパク質及びTatタンパク質に結合し得るインテグリン細胞表面受容体に関する。インテグリンに結合する2つのTat配列が同定され、それは主なインテグリン結合部位である基本領域又はドメインであって、−Arg−Lys−Lys−Arg−Arg−Gln−Arg−Arg−Arg−[SEQ ID NO:4]並びに−Gly−Arg−Gly−Asp−Ser−Pro−[SEQ ID NO:5]というペプチド配列を有する。この明細書は、このTat配列に対応する多くのペプチド及び対応するインテグリンが、適当なインテグリンに対する抗体のように、細胞がTat被覆プレートへ結合することをin vitroで阻止することを示している。しかしながら、この明細書はまたこれらの試薬が細胞による機能性Tatの取込みを阻止しないことも示し(WO92/14755号の実施例9を参照のこと)、HIV−1感染における治療ベネフィットに対して提起された作用機序を無効にしている。この国際出願に記載されたTat配列は本発明のペプチド免疫原とは異なっている。
【0010】
Tatタンパク質に対するモノクローナルとポリクローナル抗体はいずれも動物で容易に産生され、Tatタンパク質の取込みをin vitroで阻止することが示された[例えば、D.Brakeら、J.Virol.,64,962(1990);D.Mannら、EMBO J.,10:1733(1991);J.Abrahamら、上掲;P.Auronら、上掲;M.Jayeら、上掲;G.Zauliら、上掲、を参照のこと]。さらに最近の報告は、組織培養基へ加えたTatタンパク質に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体がHIV−1感染をin vitroで減弱化することを示した[L.Steinaaら、Arch.Virol.,139:263(1994);M.Reら、J.Acq.Imm.Def.Syndr.Hum.Retrovirol.,10:408(1995);及びG.Zauliら、J.Acq.Imm.Def.Syndr.Hum.Retrovirol.,10:306(1995)]。
【0011】
発明者自身の公表物[G.Goldstein,Nature Med.2:960(1996);また、1995年11月30日に公開された国際特許出願第WO95/31999号も参照のこと]は、被感染細胞からのHIV−1Tatタンパク質の分泌及び被感染細胞と非感染細胞のいずれにもよるその取込みがHIV−1の感染性にとって重要であることを示す証拠を検討した。以前の研究は、Tatタンパク質に対する抗体がTatの取込みをin vitroで阻止しin vitroの感染性を阻害することも示した。Goldsteinは、哺乳動物を能動免疫して、HIV−1Tatタンパク質に対する抗体を潜在力あるAIDSワクチンとして誘導することを提唱した。
【0012】
HIV−1の疾患進行に関する知識が増しているにもかかわらず、当技術分野には、予防的及び治療的にHIV−1を処置するための組成物及び方法の開発に対するニーズが残っている。それは、続発し、一般には致死的であるAIDS疾患の治療及び可能ならば予防のためにHIV−1のウイルスレベルを低下させるのに有用なのである。
発明の要約
1つの側面では、本発明はペプチド又はポリペプチドを含む新規な組成物を提供し、それはエピトープI:R1−Val−Asp−Pro−Y−Leu−Glu−Pro−R2[SEQ ID NO:36](ここでYは様々にもArg、Lys、Ser又はAsnである)として言及される式から選択されるアミノ酸配列を含む。N−末端のR1は水素(即ち、修飾されていないN末端アミノ酸上の水素)であるか又は低級アルキル又は低級アルカノイルを表し得る。R1はまた、所望により低級アルキル又は低級アルカノイルで置換された1〜約5のアミノ酸配列を包含し得る。1つの態様では、R1は−X−Pro−であり、ここでXはGlu又はAspである。好ましくは、R1は2つのアミノ酸を表す。C末端のR2はまたC末端アミノ酸上のヒドロキシル基又はアミドを表し得る。力価を高めるためには、R2は好ましくはカルボキシル末端でアミド化された1〜約14の追加的なアミノ酸である。好ましい態様では、R2は−Trp−Lys−His−Pro−Gly−Ser−アミド[SEQ ID NO:10]である。本組成物のペプチド又はポリペプチドは、合成的に又は組換え的に産生される。この組成物は、担体に結合した合成ペプチドとして発現されるか又は多重抗原性ペプチドとして発現される上記ペプチドの1つ又はそれより多くの形態をとり得るか、又は選択されるペプチドは組換え的に産生されるタンパク質の内部に発現され得る。この組成物は、HIV−1Tatタンパク質の既知変異体の95%より多くと反応する抗体を誘導するように設計されている。
【0013】
もう1つの側面では、上記組成物はさらに、HIV−1Tatタンパク質のアミノ酸残基2又は4〜10に対応する他のアミノ酸配列を表す1つ又はそれより多い追加的なペプチド又はポリペプチドを含有する。これらの所望されるアミノ酸配列は以下に詳しく記載される。これらの配列は、好ましくはその位置にTatタンパク質変異を有するHIV−1株からのものである。
【0014】
他の側面では、本発明はエピトープII:R3−Lys−X−Leu−Gly−Ile−Ser−Tyr−Gly−Arg−Lys−Lys−R4[SEQ ID NO:37]として言及される式のペプチド又はポリペプチドを含む新規な組成物を提供する。この式によれば、XはGly又はAlaである。N−末端のR3は水素(即ち、修飾されていないN末端アミノ酸上の水素)を表し得るか又は低級アルキル又は低級アルカノイルであり得る。R3はまた、所望により低級アルキル又は低級アルカノイルで置換された1〜約5のアミノ酸配列を包含し得る。C末端のR4はC末端アミノ酸のフリーなヒドロキシル基又はアミド、又は所望によりアミドで置換された1〜約5までの追加的なアミノ酸の配列であり得る。本組成物のペプチド又はポリペプチドは、合成又は組換えによって産生されるが、組換えエピトープIIペプチドは組換えタンパク質のC末端に位置している。本組成物は、担体に結合した合成ペプチドとして発現されるか又は多重抗原性ペプチドとして発現される上記ペプチドの1つ又はそれより多くの形態をとり得る。本組成物は、HIV−1Tatタンパク質の既知変異体の約95%より多くと反応する抗体を誘導するように設計されている。
【0015】
さらに別の側面では、本発明はエピトープIII:R5−Arg−Arg−X−Z−A−Y−Ser−R6[SEQ ID NO:38]として言及される式のペプチド又はポリペプチドを含む組成物を提供するが、ここでXはAla、Pro、Ser及びGlnからなる群から選択され、YはAsp、Asn、Gly及びSerからなる群から選択され、ZはPro及びHisからなる群から選択され、AはGln及びProからなる群から選択される。N末端のR5は水素、低級アルキル又は低級アルカノイルであるか又は所望により低級アルキル又は低級アルカノイルで置換された1〜約3のアミノ酸である。好ましい態様ではR5は所望により上記のように修飾された−Gln−Arg−である。C末端のR6はフリーなヒドロキシルか又はアミドである。そのような組成物の好ましい態様は少なくとも3つのエピトープIIIペプチド、即ち所望により上記のように修飾された、−Gln−Arg−Arg−Arg−Ala−Pro−Gln−Asp−Ser−(SEQ ID NO:1のアミノ酸54−62)、−Gln−Arg−Arg−Arg−Ala−His−Gln−Asp−Ser−(SEQ ID NO:65のアミノ酸2−10)及び−Gln−Arg−Arg−Arg−Ala−Pro−Pro−Asp−Ser−(SEQ ID NO:3のアミノ酸264−272)を含有する。Tatのアミノ酸56−62を代表するが、上記式の配列とは異なる配列を有する他のペプチド又はポリペプチドもその組成物に包含され得る。これら組成物のペプチド又はポリペプチドは合成的に又は組換え的に製造される。この組成物は、担体に結合した合成ペプチドとして発現されるか又は多重抗原性ペプチドとして発現される上記ペプチドの1つ又はそれより多くの形態をとり得るか、又は選択されるペプチドは組換え的に産生されるタンパク質の内部に発現され得る。この組成物は、HIV−1Tatタンパク質の既知変異体の約75%より多くと反応する抗体を誘導するように設計されている。
【0016】
さらに別の側面では、本発明はエピトープIV:R7−Ser−Gln−X−His−Gln−Y−Ser−Leu−Ser−Lys−Gln−Pro−R8[SEQ ID NO:39]として言及される式のペプチド又はポリペプチドを含む組成物を提供し、ここでXはAsn及びThrからなる群から選択され、YはAla及びValからなる群から選択される。N−末端のR7は水素、低級アルキル、低級アルカノイル、又は所望により低級アルキル又は低級アルカノイルで置換された1〜約3のアミノ酸配列であり得る。C末端のR8はまたフリーのヒドロキシル基、アミド又は所望によりアミドで置換された1〜約3までの追加的なアミノ酸の配列であり得る。好ましいエピトープIVペプチドは、−Ser−Gln−Thr−His−Gln−Ala−Ser−Leu−Ser−Lys−Gln−Pro−[SEQ ID NO:40]である。これら組成物のペプチド又はポリペプチドは、合成的に組換え的に産生される。この組成物は、担体に結合した合成ペプチドとして発現されるか又は多重抗原性ペプチドとして発現される上記ペプチドの1つ又はそれより多くの形態をとり得るか、又は選択されるペプチドは組換え的に産生されるタンパク質の内部に発現され得る。この組成物は、HIV−1Tatタンパク質の既知変異体の64%より多くと反応する抗体を誘導するように設計されている。
【0017】
さらに別の側面では、本発明は、1つ又はそれより多くのエピトープIIペプチド及び/又は1つ又はそれより多くのエピトープIIIペプチド及び/又は1つ又はそれより多くのエピトープIVペプチドと複合した1つ又はそれより多くのエピトープIを含むペプチド又はポリペプチドを含有する上記の組成物を提供する。そのような組成物は、知られているすべてのHIV−1Tatタンパク質の約99%より多くと反応する抗体を誘導する組成物を提供するように、適切なエピトープペプチドを複合し得る。
【0018】
また別の側面では、本発明は、上記に定義された少なくとも1つのエピトープIアミノ酸配列を所望によりカルボキシ末端のエピトープIIとともに含有するか又は少なくとも2つのエピトープIアミノ酸配列を含有するペプチド又はポリペプチドを連続的にコードする合成遺伝子を提供する。この合成遺伝子はスペーサー遺伝子によって分離された各アミノ酸配列を含有し得るか又は担体タンパク質とのオープンリーディングフレームにおいて各ペプチド/ポリペプチドを発現し得る。この合成遺伝子は、スペーサーがエピトープI配列に融合していれば、エピトープII配列を組換えタンパク質のカルボキシ末端にして、スペーサーによって担体タンパク質から分離され得る。さらなる態様は、一緒に及び担体タンパク質に融合した多数のエピトープIペプチドを包含する。
【0019】
また別の側面では、本発明は合成分子、例えば宿主細胞において上記合成遺伝子の産物の発現を指令及び制御する調節的な核酸配列と機能的に連結した合成遺伝子を含むベクターを提供する。
【0020】
また別の側面では、本発明は上記合成遺伝子又は合成分子を含有する組換えウイルスを提供するが、このウイルスは宿主細胞においてこの遺伝子又は分子の産物の多重コピーを発現し得る。このウイルスはヒトに対して非病原性である。
【0021】
さらに別の側面では、本発明は上記の合成遺伝子又は合成分子を含有する共生細菌を提供するが、この細菌はこの遺伝子又は分子の産物の多重コピーを発現し哺乳類の細胞において抗体を誘導し得る。
【0022】
さらに別の側面では、本発明は上記組成物のペプチド又はポリペプチドに対して向けられている単離された抗体の組成物を提供する。抗体は又上記組成物の多重成分に対しても獲得され得る。この抗体は、本発明のペプチド/ポリペプチド組成物、本発明の合成遺伝子又は合成分子、本発明の組換えウイルス又は共生細菌で哺乳動物を免疫化し、前記免疫された哺乳動物から抗体を単離して精製することによって産生される。別のやり方では、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体又はそれらの混合物であり得る。
【0023】
従って、本発明のもう1つの側面は、既知のHIV−1Tatタンパク質の95%より多く、好ましくは99%より多くと反応する抗体を誘導するのに有用な医薬組成物である。この誘導された抗体はHIV−1の増殖を抑え得る。この医薬組成物は、上記の組換え又は合成ペプチド/ポリペプチド組成物、上記の合成遺伝子/分子、本明細書に記載される組換えウイルス、又は本明細書に記載される共生細菌の少なくとも1つを、製剤的に許容される担体において含む。
【0024】
本発明のさらに別の側面は、上記の抗体組成物を含有する、HIV−1の増殖を抑えるのに有用な医薬組成物である。
【0025】
本発明のさらなる側面では、HIV−1のウイルスレベルを減少する方法は、上記の抗体誘導性の医薬組成物へヒトをさらすこと、ほとんどのHIV−1Tatタンパク質と反応する抗体を能動的に誘導すること及びこのウイルスの増殖をin vivoで抑えることを含む。この方法は、十分な免疫系を有するHIV−1感染患者又は非感染又はごく最近感染した患者に対して適切である。この方法はHIV−1Tatタンパク質と反応する抗体を誘導し、この抗体がHIV−1初期急性感染時のウイルス増殖を減少させ、AIDSに導く慢性のウイルス血症を最少化する。
【0026】
さらにもう1つの側面では、本発明は、HIV−1の感染に有効又は迅速な免疫応答を発動することができないヒトへ、上記の抗体組成物を含有する医薬組成物を投与することによってHIV−1のウイルスレベルを減少させる方法を提供する。この方法は本組成物を慢性的に投与することを含み得る。
【0027】
本発明のまた別の面は、上記の組成物並びにそのような組成物でトランスフェクトされた宿主細胞を生産する方法を包含する。
【0028】
本発明のさらに別の側面は、上記組成物での予防接種により誘導された抗体の力価及び特異性の測定及び検出に有用なキットである。本発明のキットはエピトープI〜IVのペプチド、及び被覆された固体支持体、これらのペプチドに対する抗体の結合を検出するための標識試薬、この標識によってもたらされるシグナルを励起又は検出するための様々な基質及び器具、並びに血液サンプルをとるための従来器具、適切なバイアル及び他の診断アッセイ成分を包含する。
【0029】
さらなる側面では、本発明は、本発明の組成物で予防接種した患者の抗体の力価及び反応性を検出するための方法を提供する。この方法は、患者の生物学的体液、例えば血清の希釈液を、エピトープ1〜IVの1つ又はそれより多くのペプチドが結合したプレート又はビーズとインキュベートすること、非結合性の生物学的材料を洗い流すこと、及び標識試薬、例えば酵素に結合した抗ヒト免疫グロブリンでこのペプチドに結合した所望の抗体を測定すること、という工程を包含する。利用される標識のタイプによって、標識によって産生されるシグナルは、酵素と反応する基質をさらに加えて、例えば色の変化を起こすことによって励起され得る。他の従来的な標識もこのアッセイ設計に取込まれ得る。
【0030】
本発明の他の側面及び利点はその好ましい態様の以下の詳細な記載においてさらに記載される。
発明の詳細な説明
本発明は、免疫原に対する免疫応答をまだ発動し得る非感染者又は感染初期の患者に抗体、つまり既知のHIV−1Tatタンパク質変異体の95%より多く、好ましくは99%より多くと反応する抗体を誘導する組成物を提供することによって、上記の問題に対する解答を提供する。誘導された抗体はHIV−1の増殖を阻害することができる。このことがAIDSへのさらなる疾患の進行を防止する。抗体組成物はまた、HIV−1感染への有効又は迅速な免疫応答を発動し得ない感染者又は非感染者における使用にも提供される。これら組成物はTatタンパク質の95%より多く、好ましくは99%より多くと反応し、HIV−1のウイルスレベルを減少させることができる。これら抗体は、免疫学的に独特なTatタンパク質を感染時に産生するHIV−1にさらされたか又は感染された大きな人口集団におけるAIDSの進展をコントロールする治療と予防の両方のコンテクストにおいて有用である。
【0031】
あるHIV−1Tatタンパク質のエピトープによってもたらされるペプチドに基づいた、本発明の組成物は、タンパク質様の性質であるか、又はTatへの抗体を誘導し、次いでHIV−1の増殖を抑えるペプチド及びポリペプチドをコードする核酸組成物であり得る。
【0032】
HIV−1Tatタンパク質は2つのエクソンから産生される:エクソン1は72のアミノ酸(aa)タンパク質(図1、SEQ ID NO:1を参照のこと)をコードし、これはスプライシングせずに発現され得るか又は約101のアミノ酸ペプチドを産生するエクソン2によってコードされる約29のアミノ酸ペプチドをスプライスされ得る。エクソン1の72アミノ酸産物はそれだけで細胞の取込み及び活性化が可能なので、抗体がこの72アミノ酸ペプチドと反応し、その細胞内輸送を阻止することが必須である。HIV−1Tatはエクソン1[SEQ ID NO:1及び2]のアミノ酸22位及び37位にCysを、及びこれらの間に5つの追加的なCysを含有する。このペプチド領域はCysリッチ領域と命名され、複雑な三次構造を産生するCys−Cys共有結合を有する。科学文献はこの領域は免疫原ではないらしいと示している。
【0033】
発明者は、エピトープ、即ちエクソン1[SEQ ID NO:2]又は他のTat配列変異体におけるN末端の直線配列1〜21(22aa)及びC末端の直線配列38〜72(35aa)のなかに抗体(抗原性の配列)によって認識される結合領域を同定した。このより大きな配列の免疫原性領域が発明者によって同定され、以下のエクソン1のN末端及びC末端コンセンサス配列において下線を施されている:エピトープIはエクソン1のアミノ酸2〜10位の9アミノ酸配列として同定された。エピトープIIはエクソン1のアミノ酸41〜51位の11アミノ酸配列として同定された。エピトープIIIはエクソン1のアミノ酸56〜62位の7アミノ酸配列として同定された。エピトープIVは、エクソン2の最初のPro(アミノ酸73)及びエピトープIIIに重なるSer62(点の下線)を包含する、Tatのアミノ酸62〜73位の12アミノ酸配列として同定された。
【0034】
【化1】
【0035】
「Tat配列変異体」という用語は、Tatタンパク質アミノ酸残基を含有するポリペプチド又はペプチド、又はSEQ ID NO:1の配列と実質的に同等である他のHIV−1株のTatタンパク質に由来する配列を意味する。それぞれの変異体は、図1[SEQ ID NO:1]のコンセンサス配列及び/又は他の変異体から、エピトープI〜IVの関心対象の残基内の少なくとも1つのアミノ酸変化によって区別され得る。この変化は、本発明の組成物へ加えられるとき、特定のTatエピトープに対して同じか又は異なる抗原特異性を提供し得る。
【0036】
A.エピトープI免疫原性組成物
従って、1つの態様では、本発明は天然に存在しないペプチド又はポリペプチドを含有し、1つ又はそれより多くのエピトープIアミノ酸配列を含む組成物を提供する。これらエピトープI配列は、エピトープI配列にin vivoでさらされた哺乳動物において(本発明の目的のために)特定の体液性免疫応答を誘発する。エピトープIアミノ酸配列は、数多くの「Tat配列変異体」に由来する図1のTatコンセンサス配列[SEQ ID NO:1]のアミノ酸残基2〜10又は4〜10に対応する。
【0037】
エピトープIは、R1−Val−Asp−Pro−Y−Leu−Glu−Pro−R2[SEQ ID NO:36]という一般式のペプチドと定義される。N末端のR1は修飾されていないN末端アミノ酸のVal上の水素を表し得るか、又はR1はValに結合した低級アルキル又は低級アルカノイルであり得る。R1はまた、所望により低級アルキル又は低級アルカノイルで置換された1〜約5のアミノ酸配列を包含し得る。1つの態様では、R1は−X−Pro−であり、ここでXはGlu又はAspである。C末端のR2はまたC末端アミノ酸のPro上のヒドロキシル基を表し得るか、R2はPro上のアミドであり得る。別のやり方では、R2は、所望によりカルボキシル末端でアミド化された1〜約14の追加的なアミノ酸配列であり得る。X及びYの位置はこのエピトープペプチドの共通変異体を表し、ここでXはGlu(90%)又はAsp(10%)であり、Yは様々にもArg(74%)、Lys(11%)、Ser(9%)又はAsn(4%)である。X位にGlu又はAspを含有するペプチドは他の変異体と有効に交叉反応する抗体を誘導する。別のやり方では、X−Pを省略するペプチドは、Val−Asp−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro(SEQ ID NO:1のアミノ酸4〜10)に対する抗体を有効に誘導する。式Glu−Pro−Val−Asp−Pro−Lys−Leu−Glu−Pro[SEQ ID NO:56]という望ましい免疫原が既知HIV−1Tatタンパク質の95%より多くと反応する/交叉反応するのに対し、式Val−Asp−Pro−Lys−Leu−Gly−Pro[SEQ ID NO:57]という免疫原は、既知のHIV−1Tatタンパク質の97%より多くと反応する/交叉反応する。
【0038】
4つのY位変異体すべてに対する抗体がこの4つすべてを免疫原として使用することによって産生される。別のやり方では、交叉反応性によって、免疫する配列を2つ又は1つにさえ減らして4つのY位変異体すべてに対して反応を誘導することができる。以下の実施例で詳しく論じられるように、エピトープI含有ペプチド:Val−Asp−Pro−Y−Leu−Glu−Pro−Tyr−Lys−His−Pro−Gly−Ser−[SEQ ID NO:58](ここでYはArg、Lys、Ser又はAsnである)によって誘導される抗体の反応性を以下の表1に報告する。暗いシェードは自己反応性を示し、薄いシェードは顕著な(40%以上)交叉反応性を示す。
【0039】
【表1】
【0040】
本発明の組成物は、好ましくは以下のエピトープIペプチド又はポリペプチドの1つ又はそれより多くを含有する:
R1−Val−Asp−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−R2[SEQ ID NO:6];
R1−Val−Asp−Pro−Lys−Leu−Glu−Pro−R2[SEQ ID NO:7];
R1−Val−Asp−Pro−Ser−Leu−Glu−Pro−R2[SEQ ID NO:8];
R1−Val−Asp−Pro−Asn−Leu−Glu−Pro−R2[SEQ ID NO:9]。
【0041】
上に示したように、YがLysである免疫原[SEQ ID NO:7]は、他の3つの変異体と良好な反応性を有する抗体を誘導する。YがSerである変異体と良好な交叉反応性の有る高力価の抗体を誘導した免疫原はなかった。従って、YがLysであったエピトープIの免疫原[SEQ ID NO:7]は4つのY位変異体すべてに対して十分な交叉反応性を有し、単独で免疫原性の組成物に使用され得る。YがLysであるペプチドのこの反応パターンは今日までのテストの大部分で出現するが、あるテストサンプルでは交叉反応性において上記結果とは異なることが起こり得ると当業者は期待すべきである。
【0042】
別のやり方では、本発明の組成物はこれらアミノ酸配列[SEQ ID NO:6〜9]の2つ、3つ又は4つすべてを含む。別に、YがLysであるエピトープI免疫原及びYがAsn[SEQ ID NO:6]のエピトープI免疫原の複合物は、YがSerであるか又はYがAsnであるエピトープI変異体に対してやや優れた力価を提供する。
【0043】
さらに別のエピトープIペプチド免疫原はYの位置にオルニチンを含有するが、これはオルニチンの側鎖が1つ−CH2−が少ないリジンに似ているからである。このエピトープI配列はさらに大きい交叉反応性を提供し得て、単独又は他のエピトープI免疫原と組み合わせて使用され得る。
【0044】
上記エピトープIの式によると、反応性のあるエピトープIの最少配列を形成する7つのアミノ酸残基に他のアミノ酸が隣接され得て、全エピトープI配列の長さは7〜約25アミノ酸になり得る。以下の実施例1に示すように、このフランキングアミノ酸の同一性はエピトープI免疫原の生物学的機能に本質的ではない。特に、エピトープI配列のN末端上の追加的なアミノ酸は免疫原性に影響しない。従って、エピトープIのN末端R1は、フリーのN末端アミノ水素、低級アルキル(即ち、C1〜C10アルキル)、アセチル基のような低級C1〜C10アルカノイル又は1〜約5のアミノ酸の配列からなる群から選択され得る。好ましくは、R1は2つのアミノ酸を表す。
【0045】
エピトープI最少配列のC末端上の追加的なアミノ酸は、抗体の力価を増強する。エピトープIの免疫原は最適な免疫原性のためにはC末端に少なくとも2つのアミノ酸の延長を必要とし、延長されたアミノ酸配列の内部に存在するとき免疫原となる。従って、C末端R2は単純なフリーヒドロキシル基であり得る一方で、それはまたC末端アミドでもあり得る。しかしながら、力価を高めるためには、R2は好ましくはカルボキシル末端でアミド化された1〜約14の追加的なアミノ酸配列である。好ましい態様では、R2は−Trp−Lys−His−Pro−Gly−Ser−アミド[SEQ ID NO:10]である。
【0046】
本発明の上記エピトープI組成物は数多くの追加的なペプチド又はポリペプチドを含有し得るが、それはSEQ ID NO:1の2〜10アミノ酸のアミノ酸残基に対応する他の配列を含有するが、上記エピトープI組成物に対する抗体とは交叉反応しない他のTat変異体に由来する。これらの追加的なペプチド及びポリペプチドは「所望のエピトープIa免疫原」として言及される。たとえば、本発明の組成物に存在し得る任意エピトープIa免疫原は以下のアミノ酸配列[順に、SEQ ID NO:11〜18]の少なくとも1つの少なくとも1つのコピーを含有し得る:
R1−Gly−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−R2;
R1−Ala−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−R2;
R1−His−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−R2;
R1−Asp−Pro−Gly−Leu−Glu−Pro−R2;
R1−Asp−Pro−Arg−Ile−Glu−Pro−R2;
R1−Asp−Pro−Arg−Leu−Gly−Pro−R2;
R1−Asp−Pro−Arg−Leu−Glu−Ala−R2;及び
R1−Asn−Pro−Ser−Leu−Glu−Pro−R2;
本発明のエピトープI組成物は、単一ペプチドの多重コピー、又は任意の順序のエピトープIaペプチド、又はこれらペプチドの少なくとも2つの多重コピーを所望により包含する、異なるエピトープIペプチドの多重コピーを含有し得る。1つの態様では、全4種のアミノ酸配列[SEQ ID NO:6〜9]の少なくとも1つのコピーが存在する。
【0047】
以下により詳しく論じるように、これら組成物のエピトープI及びIaペプチド又はポリペプチドは合成的に組換え的に製造される。エピトープI免疫原は、担体タンパク質が結合した合成ペプチドとして発現され得る。エピトープI免疫原はまた、所望により担体タンパク質に結合した、多重抗原性ペプチドとしても発現され得る。別のやり方では、エピトープI免疫原は、所望により担体タンパク質と同時発現されるか又はフレームで融合した、組換え的に生産されるタンパク質の内部に発現され得る。
【0048】
エピトープI組成物は、免疫化される免疫能のある哺乳動物、即ち、非感染者又は無症候性の感染者において、HIV−1のTatタンパク質の既知変異体95%以上、及び好ましくは99%以上に対して向けられる能動的な体液性の免疫応答(即ち、抗体)を誘導する生物学的な活性を示す。そのような処置の最終結果は、急性感染状態のHIV−1の増殖を抑制し、AIDSへの進行に関連する血清変換後の高いHIV−1血漿レベルを防止することである。HIV−1感染初期の無症候性フェーズにおける抗体の能動誘導は、ウイルス増殖を抑制し、血漿ウイルス負荷量を下げ、AIDSへの進行の可能性を低下させ得る。SEQ ID NO:6〜9であるアミノ酸配列全4種のうち少なくとも1つのエピトープを含有する組成物は、HIV−1の共通Bサブタイプについて知られている400種のTat配列の約97%、及び配列決定された全18種の非BサブタイプHIV−1のTatタンパク質[Dr.Esther Guzmanの好意によるロスアラモスNIAID HIV−1データベース;GenBankデータベース]に対して免疫応答を誘発し得る。
【0049】
B.エピトープII免疫原性組成物
別の態様では、本発明は少なくとも1つのエピトープIIアミノ酸配列を含む組成物を提供する。このエピトープII配列は、エピトープII配列にin vivoでさらされた哺乳動物において(本発明の目的のために)特定の体液性免疫応答を誘発する。エピトープIIは、R3−Lys−X−Leu−Gly−Ile−Ser−Tyr−Gly−Arg−Lys−Lys−R4という式のペプチドを規定し、ここでXはGly(70%)又はAla(30%)である。この配列は高度に保存されている。XがGlyである免疫原はXがAlaである配列と交叉反応する抗体を誘導する。
【0050】
N末端のR3は、修飾されていないN末端アミノ酸Lys上の水素を表し得るか、R3はLys上の置換基である低級アルキル又はアセチル基のような低級アルカノイルであり得る。R3はまた、所望により低級アルキル又は低級アルカノイルで置換された1〜約5のアミノ酸配列を包含し得る。C末端のR4はC末端アミノ酸Lysのフリーなヒドロキシル基を表し得るか、R4はC末端アミノ酸上のアミドであり得る。R4は所望によりアミドで置換された1〜約5までの追加のアミノ酸の配列で所望によりあり得る。エピトープIIの現在好ましい免疫原は、−Lys−Gly−Leu−Gly−Ile−Ser−Tyr−Gly−Arg−Lys−Lys−(SEQ ID NO:1のアミノ酸41〜51)である。これは、既知HIV−1Tatタンパク質の96%以上と反応/交叉反応し得る。
【0051】
エピトープIIは他の配列の内部に存在する時は免疫原性に乏しい。従って、最適な免疫原性のためには、この配列は担体タンパク質に融合又は結合した合成ペプチドとしてかまたは所望により担体タンパク質に結合した多重抗原性ペプチドとして製造される。別のやり方では、エピトープIIは、所望によりそのアミノ末端配列で担体タンパク質とフレームで融合した組換えタンパク質のC末端配列として発現され得る。本発明の組成物では、エピトープIIペプチドは好ましくは単独で又は1つ又はそれより多くのエピトープIペプチドと複合して提示される。他の組成物は、1つ又はそれより多くのエピトープIII又はIVペプチドを利用し得る。
【0052】
C.エピトープIII免疫原性組成物
別の態様では、本発明は少なくとも1つの、好ましくは2つ又はそれ以上のエピトープIIIアミノ酸配列を含む組成物を提供する。これらエピトープIII配列は、エピトープIII配列にin vivoでさらされた哺乳動物において(本発明の目的のために)特定の体液性免疫応答を誘発する。このエピトープはエピトープI及びIIよりもかなり多い変異を示す。このエピトープIII免疫原性ペプチド及びポリペプチドは、SEQ ID NO:1のアミノ酸56〜62に対応するTat変異タンパク質配列から派生する。エピトープIIIは、R5−Arg−Arg−X−Z−A−Y−Ser−R6[SEQ ID NO:38]という式のペプチドを規定するが、ここでXはAla、Pro、Ser又はGlnであり、YはAsp、Asn、Gly又はSerであり、ZはPro又はHisであり、AはGln又はProであり得る。XがAlaであるエピトープIIIは他のX位変異体と交叉反応する抗体を誘導する。Y位にAspを含有するエピトープIII免疫原は、他のY位変異体と交叉反応する抗体を誘導する。Z及びA位についての最も一般的な3つの変異体は、Pro−Gln−(61%)、−Pro−Pro−(8%)及び−His−Gln−(8%)である。この3種の免疫原によって誘導される抗体は他のものと交叉反応しないので、これら変異体(77%)をカバーするには3種の免疫原を使用する必要があろう。
【0053】
上記エピトープIIIの式によると、反応性のあるエピトープIIIの最少配列を形成する7つのアミノ酸残基は他のアミノ酸を隣接し得て、全エピトープIII配列の長さは7〜約25アミノ酸になり得る。以下の実施例3に示すように、このフランキングアミノ酸の同一性はエピトープIII免疫原の生物学的機能に本質的ではない。特に、エピトープIII配列のN末端上の追加的なアミノ酸は免疫原性に影響しない。N末端R5は、N末端Arg上の水素を所望により表し得るか、R5はN末端Arg上の置換基である低級アルキル又はアセチル基のような低級アルカノイルである。別のやり方では、R5は、所望により低級アルキル又は低級アルカノイルで置換された1〜約3のアミノ酸である。好ましい態様ではR5は所望により上記のように修飾された−Gln−Arg−であり、このエピトープの免疫原性を高める。C末端のR6はC末端アミノ酸上のフリーなヒドロキシルか、又はC末端アミノ酸上のアミド置換基であるが、これはC末端を延長すると免疫原性を損ねるためである。
【0054】
本発明の組成物において提示され得るエピトープIII免疫原は、以下の好ましいエピトープIIIアミノ酸配列のうち少なくとも1つの、所望により上記のように修飾された、少なくとも1つのコピーを包含し得る:R5−Gln−Arg−Arg−Arg−Ala−Pro−Gln−Asp−Ser−R6、R5−Gln−Arg−Arg−Arg−Ala−His−Gln−Asp−Ser−R6及びR5−Gln−Arg−Arg−Arg−Ala−Pro−Pro−Asp−Ser−R6(順に、SEQ ID NO:20〜22)。
【0055】
エピトープIII組成物に包含され得る他の所望の免疫原性配列は、R5−Arg−Arg−Pro−Pro−Gln−Asp−Asn−R6、R5−Arg−Arg−Ala−Pro−Gln−Asp−Arg−R6;R5−Arg−Gly−Ala−Pro−Gln−Asp−Ser−R6;R5−Arg−Arg−Ala−Pro−Glu−Asp−Ser−R6;又はR5−Arg−Arg−Ala−Ser−Gln−Asp−Ser−R6(順に、SEQ ID NO:23〜27)を包含する。以下の実施例の検討から決定されるように、本発明の組成物にこれらエピトープIIIを包含することで、好ましいエピトープIII免疫原によって誘導される抗体と交叉反応しないか又はそれに対して十分強い交叉反応性を有さない、HIV−1の稀なTatタンパク質と反応する抗体を誘導することができる。
【0056】
以下により詳しく記載されるように、エピトープIIIペプチド又はポリペプチドは他の配列の内部に存在する時は免疫原性に乏しい。エピトープIIIは最適な免疫原性のために組換え的に製造され得るが、この配列は合成的に担体タンパク質に結合させるか又は所望により担体タンパク質に結合した多重抗原性ペプチドとして製造され得る。別のやり方では、エピトープIIIは、所望によりそのアミノ末端配列で担体タンパク質とフレームで融合した組換えタンパク質のC末端配列として発現され得る。本発明の組成物は、所望により少なくとも1つのエピトープI免疫原と、及び所望により1つ又はそれより多くのエピトープII又はエピトープIV免疫原と一緒になった3つ又はそれ以上の異なるエピトープIII免疫原を好ましくは含有する。
【0057】
D.エピトープIV免疫原性組成物
別の態様では、本発明は少なくとも1つの、好ましくは2つ又はそれ以上のエピトープIVアミノ酸配列を含む組成物を提供する。これらエピトープIV配列は、エピトープIV配列にin vivoでさらされた哺乳動物において(本発明の目的のために)特定の体液性免疫応答を誘発する。エピトープIV免疫原性ペプチド及びポリペプチドは、HIV−1Tatのエクソン2由来のC末端Proを包含する、SEQ ID NO:1のアミノ酸62〜72に対応するTat変異体タンパク質配列から派生する。エピトープIVは、R7−Ser−Gln−X−His−Gln−Y−Ser−Leu−Ser−Lys−Gln−Pro−R8[SEQ ID NO:39]という式のペプチドを規定し、ここでXはAsn又はThrであり、YはAla又はValであり得る。XがThrである免疫原はXがAsnであるペプチドと交叉反応する抗体を誘導する。YがValである免疫原はYがAlaであるペプチドと交叉反応しない抗体を誘導する。しかしながら、Y位にAlaを含有するペプチドは、YがValであるエピトープIVに対するペプチドと交叉反応する抗体を誘導する。従って、最適のエピトープIV免疫原は、Ser−Gln−Thr−His−Gln−Ala−Ser−Leu−Ser−Lys−Gln−Pro[SEQ ID NO:40]であり、これは既知HIV−1Tatタンパク質の64%と反応/交叉反応する抗体を誘導する。
【0058】
上記エピトープIVの式によると、反応性のあるエピトープIVの最少配列を形成する12のアミノ酸残基は他の数個のアミノ酸を隣接し得て、全エピトープIV配列の長さは12〜約18アミノ酸になり得る。N末端R7は、N末端アミノ酸の水素、又はN末端アミノ酸上の置換基である低級アルキル又はアセチル基のような低級アルカノイルを表し得る。N末端の延長は免疫原性を顕著に阻害するが、R7はまた所望により低級アルキル又は低級アルカノイルで置換された1〜約3のアミノ酸配列であり得る。C末端のR8はC末端アミノ酸上のフリーなヒドロキシルか、又はC末端アミノ酸上のアミド置換基であるか、R8は所望によりアミドで置換された1〜約3までの追加的なアミノ酸の配列であり得る。追加的に言うと、このエピトープの重要成分であるC末端Proは、Tatのエクソン2によってコードされる。従って、エピトープIVに対する抗体は、スプライスされないTatエクソン1タンパク質とほとんど反応しない。
【0059】
このエピトープIV配列は他の配列の内部に存在する時は免疫原性に乏しい。従って、最適な免疫原性のために、この配列は担体タンパク質に結合した合成ペプチドとして、又は所望により担体タンパク質に結合した多重抗原性ペプチドとして製造され得る。本発明の組成物は、所望により少なくとも1つのエピトープI免疫原と、及び所望により1つ又はそれより多くのエピトープII又はエピトープIII免疫原と一緒になった、2つ又はそれ以上の異なるエピトープIV免疫原を好ましくは含有する。
【0060】
E.複数のエピトープを含有する組成物
エピトープI、II、III及びIV及び本明細書で同定される所望の免疫原のアミノ酸配列がHIV−1の400以上の既知Tat配列に関する厳密な分析から得られたが、当業者には、本発明の教示の後で、さらなるTatタンパク質、それらをコードする核酸配列及び新たに単離されるHIV−1サブタイプBのTatタンパク質、又は他のサブタイプのTatタンパク質、又は他のHIV株に由来するそれらのフラグメントに関する研究から同様の組成物を入手し得ることが理解されるべきである。
【0061】
従って、本発明の組成物、即ち上記に同定されたアミノ酸配列を含有するペプチド/ポリペプチドは、ヒト被検者に提供されるとき、ほとんどのHIV−1株の細胞外Tatタンパク質を免疫学的に阻止することに有用である。これら組成物はこのウイルスの爆発的な増殖をきわどく減少させ、ウイルスの有効な免疫コントロールを可能にするように機能する。
【0062】
各エピトープの免疫原は、好ましくは天然に存在する各エピトープ変異体の最も高い比率と反応する抗体を誘導するように設計されている。エピトープIのようなエピトープに対しては、ある免疫原の多重コピーを合成又は組換え免疫原に取込んで、免疫原性を高めてより高い力価の抗体を産生し得る。さらに、各エピトープの配列における変異が独立に起こるので、2つ又はそれ以上のエピトープを複合してカバレッジを拡張することも可能である。例えば、エピトープI免疫原(95%)をエピトープII免疫原(96%)と複合すれば、既知HIV−1Tatタンパク質の99.8%と反応する抗体が免疫応答性の被検者に生じる。従って、1例として、本発明の組成物は、Cys−Glu−Pro−Val−Asp−Pro−Lys−Leu−Glu−Pro−Trp−Lys−Glu−Leu−Gly−Ile−Ser−Tyr−Gly−Arg−Lys−Lys−アミド[SEQ ID NO:67]のような1つのエピトープI(下線部)−エピトープII(二重下線部)が融合し、エピトープIに担体タンパク質が結合したペプチド免疫原、又は多重抗原性ペプチドとして合成され、所望により担体タンパク質が結合した同様のペプチド(カップリングのためにN末端のCがない)を含有する。別のやり方では、2つ又はそれ以上の免疫原の混合物が以下のように使用され得る。
【0063】
任意のエピトープII、III又はIV又は他の所望の免疫原と一緒であるか又は一緒でないエピトープIが製造され、例えば化学合成物又は組換えペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質又は融合ペプチドといった様々な形態の免疫原性組成物において使用され得る。
【0064】
1.担体に結合した合成ペプチド/タンパク質
1つの態様として、本発明の組成物は、選択される担体タンパク質に結合した、同一又は異なるエピトープI免疫原のアミノ酸配列及び/又はエピトープII/III/IV免疫原性アミノ酸配列及び所望の免疫原の所望によるアミノ酸の単一又は多数のコピーを含有する合成ペプチドであり得る。本発明の組成物のこの態様では、フランキング配列を有するか又は有さない上記多数のエピトープIアミノ酸配列がポリペプチドにおいて連続的に複合され、同一の担体に結合され得る。別のやり方では、エピトープI、II、III又はIVの免疫原が同一又は異なる担体タンパク質へペプチドとして別個に結合され、得られる免疫原−担体構築体は一緒に混合して単一の組成物を形成する。
【0065】
この態様に対しては、担体タンパク質は、望ましくは選択される免疫原の免疫原性を増強し得るタンパク質又は他の分子である。そのような担体は、アジュバント効果を有するより大きな分子であり得る。例示的な従来のタンパク質担体は、制限しないが、E.coliのDnaKタンパク質、ガラクトキナーゼ(galK、細菌におけるガラクトース代謝の第1段階を触媒する)、ユビキチン、α−交配因子、β−ガラクトシダーゼ及びインフルエンザNS−1タンパク質を包含する。ジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイドのようなトキソイド(即ち、天然に存在する毒素をコードする配列で、その毒性を消失させる十分な修飾を施したもの)もまた担体として利用され得る。同様に、多種多様な細菌性の熱ショックタンパク質(例、ミコバクテリアhsp−70)が使用され得る。グルタチオンレダクターゼ(GST)はもう1つの有用な担体である。当業者は適切な担体を容易に選択し得る。
【0066】
特に望まれる免疫原−担体タンパク質構築体においては、1つ又はそれより多くのエピトープ免疫原及び所望の免疫原ペプチド/ポリペプチドをミコバクテリアE.coli熱ショックタンパク質70(hsp70)に共有結合し得る[K.Suzueら、J.Immunol.,156:873(1996)]。もう1つの望まれる態様では、組成物は免疫原含有のペプチド又はポリペプチド配列をジフテリアトキソイドに共有結合させることによって形成される。
【0067】
2.多重抗原性ペプチド
また別の態様では、ペプチド又はポリペプチドエピトープ免疫原及び任意に選択される所望の免疫原は、多重抗原性ペプチド(「MAP」、オクタマーリジンコアペプチドとしても言及される)構築体の形態であり得る。そのような構築体は、Tam,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5409〜5413(1988)によって記載されたMAPシステムを利用することによって設計され得る。このシステムは、リジン残基のコアマトリックスを利用し、その上に本発明の同一エピトープI、又は所望の免疫原の多重コピーが[D.Posnettら、J.Biol.Chem.,263(4)1719〜1725(1988);J.Tam,“Chemically Defined Synthetic Immunogens and Vaccines by the Multiple Antigen Peptide Approach”,Vaccine Research and Developments,Vol.1,W.KoffとH.Six編、51〜87頁(Marcel Deblau社、ニューヨーク、1992)]に記載されるようにして合成される。各MAPは唯一のペプチドの多重コピーを含有する。それ故、例えば本発明のエピトープ組成物は、そのリジンコアに結合したペプチド又はポリペプチドエピトープ免疫原が上記に同定した4アミノ酸配列[SEQ ID NO:6〜9]の1つ又は連続リピートを含有するMAPを包含する。エピトープI、II、III又はIV配列の任意の所望される複合物を得るために多数の異なるMAPが利用され得る。好ましくは、これらMAP構築体は、他のT細胞刺激性の配列と結合しているか、又は医薬組成物として、既知のアジュバントのようなT細胞刺激剤とともに投与される。
【0068】
3.スペーサー
例えばペプチド/ポリペプチド−担体構築体のような上記組成物又はMAPのいずれかにおいて、各ペプチド/ポリペプチド免疫原又は免疫原の各アミノ酸配列は、所望により「スペーサー」と呼ばれる所望のアミノ酸によって分離され得る。スペーサーは、2つの配列の間に挿入され、免疫原の三次元構造に不都合に影響することなくそれらの連結を可能にする1〜約4のアミノ酸配列である。スペーサーは、所望されるならば、配列の分離を可能にする制限エンドヌクレアーゼ開裂部位も含有し得る。適切なスペーサー又はリンカーが知られていて、当業者により容易に設計され、選択され得る。好ましいスペーサーはGly及び/又はSerアミノ酸を含有する配列である。
【0069】
F.合成遺伝子を包含する、本発明の核酸組成物
本発明の他の態様は、担体タンパク質に融合したペプチド及びポリペプチドを包含する上記組成物のペプチド及びポリペプチド免疫原を包含する、上記ペプチド/ポリペプチド組成物をコードする核酸配列を包含する。核酸配列はまた担体タンパク質をコードする配列も包含し得る。
【0070】
従って、本発明の1つの好ましい態様は、1つ又はそれより多くのエピトープI免疫原性ペプチド/ポリペプチドを連続的にコードする「合成遺伝子」である。この合成遺伝子は好ましくは2種、3種又は全4種のエピトープIアミノ酸配列[それぞれ、SEQ ID NO:6〜9]をコードする:
R1−Val−Asp−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−R2;
R1−Val−Asp−Pro−Lys−Leu−Glu−Pro−R2;
R1−Val−Asp−Pro−Ser−Leu−Glu−Pro−R2;
R1−Val−Asp−Pro−Asn−Leu−Glu−Pro−R2。
【0071】
合成遺伝子はまた上記に同定された所望の免疫原から任意に選択されるものをコードし得るし、エピトープII又はIIIのペプチドがエピトープI配列のC末端に融合してそれ自身のC末端上でさらに修飾されていなければ、エピトープII又はIII免疫原を包含し得る。合成遺伝子は、同一アミノ酸配列の多重コピー、多くの異なる免疫原又はアミノ酸配列のコピー又は多くの異なる免疫原又はアミノ酸配列の多重コピーをコードし得る。合成遺伝子は、担体タンパク質をコードする核酸配列とオープンリーディングフレームのなかにあるか又は融合した、選択されるアミノ酸配列をコードし得る。合成遺伝子のさらなる特徴は、免疫原をコードする各配列の間及び/又は免疫原をコードする配列と担体タンパク質をコードする配列との間にあるスペーサーをそれがコードすることであり得る。
【0072】
本発明の合成遺伝子はまた合成又は組換え分子の一部であり得る。この合成分子は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質又は、プロモーター、終止コドン等のような調節要素をコードする核酸配列の機能的コントロール下にある融合タンパク質をコードする合成遺伝子を含有する、ベクター又はプラスミドのような核酸構築体であり得る。そのような合成分子は、ポリペプチド/ペプチド免疫原組成物を組換え的に生産するために使用され得る。
【0073】
合成遺伝子又は合成分子は、化学的な合成法の使用又は、好ましくは組換え技術によって製造され得る。例えば、合成遺伝子又は分子は、指定される宿主細胞の種に選好されるあるコドンを含有し得る。
【0074】
好ましくはDNAの形態をした、合成遺伝子又は分子は、多種多様なやり方で使用され得る。例えば、これらの合成核酸配列はin vitroの宿主細胞培養において本発明のペプチド/ポリペプチドを発現させるために使用され得る。発現された免疫原は、適切な精製の後に、医薬用の試薬又はワクチンへ組み込まれ得る。
【0075】
別のやり方では、本発明の合成遺伝子又は合成分子は、哺乳動物、好ましくはヒト被検者へ、いわゆる「裸のDNA」として患者においてin vivoでタンパク質/ペプチド免疫原を発現させるために、直接投与され得る。例えば、J.Cohen,Science,259:1691〜1692(1993年3月19日);E.Fynanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:11478〜11482(1993年12月);及びJ.A.Wolffら、Biotechniques,11:474〜485(1991)を参照のこと。これらはすべて参照により本明細書に組み込まれている。合成分子、例えばベクター又はプラスミドは、哺乳類の宿主への直接注入のために使用され得る。このことが宿主細胞によるタンパク質の発現及び引き続くin vivoでの抗体形成を誘導する免疫系への表出をもたらす。
【0076】
G.合成遺伝子を発現する微生物
本発明のさらに別の態様では、本発明の合成遺伝子又は分子は非病原性の微生物へ取込まれ得る。得られた微生物は、哺乳類の宿主へ投与されるとき、in vivoで本発明の発現される組成物を発現して増加させ、特定の抗体形成を誘導する。例えば、本発明の組成物又は合成遺伝子を担い、哺乳類の患者への投与に有用である非病原性の組換えウイルス又は共生細菌は、従来法の使用により製造され、既知の非病原性微生物のなかから選択され得る。
【0077】
合成分子を患者へ体外デリバリーする及び/又は合成遺伝子を患者へin vivoで運び込むのに有用であり得る共生細菌は、例えば、様々な菌株のStreptococcus(例、S.gordonii)、又はE.coli、Bacillus、Streptomyces及びSaccharomycesを包含する。
【0078】
宿主の細胞へ合成遺伝子を運び込むように工学処理され得る適切な非病原性のウイルスは、ワクシニアのようなポックスウイルス、アデノウイルス、カナリア痘、レトロウイルス等を包含する。そのような数多くの非病原性ウイルスがヒト遺伝子治療のために、及び他のワクチン薬の担体として一般に使用され、当業者によって知られていて、選択可能である。
【0079】
H.本発明の組成物の調製又は製造
本発明の組成物、及びエピトープI、II、III又はエピトープIV又は本発明の所望の免疫原を含有する個々のポリペプチド/ペプチド、本発明の合成遺伝子及び合成分子は、Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.,85:2149〜2154(1963)によって記載されるような既知の化学合成技術の手段による従来のやり方で製造され得る。別のやり方では、本発明の組成物は、宿主微生物又は細胞の内部で、エピトープI及び/又は所望の免疫原及び所望の担体タンパク質を含有するペプチド/ポリペプチドをコードする配列を担うDNAフラグメントをクローニングして発現させることによる既知の組換えDNA技術によって製造され得る。エピトープI及び所望の免疫原のコード配列は、合成的に[W.P.C.Stemmerら、Gene,164:49(1995)]製造され得るか又は既知の技術によってウイルスRNAからか又は入手可能なcDNA含有プラスミドから派生され得る。
【0080】
連続した免疫原を従来の分子生物学の技術でアセンブリーすること、及び免疫原の所望の配列を提供する部位特異的突然変異誘発を必要とし得る合成遺伝子の生産のような場合、これらの技術の組み合わせが使用され得る。従って、合成遺伝子の産物は組換え的に産生される。これらの操作のすべては従来の方法により実施され得る。
【0081】
合成遺伝子又は分子を使用して本発明のペプチド/ポリペプチド組成物をクローニングして発現させるためのシステムは、組換え技術においてよく知られている様々な微生物及び細胞を包含する。これらは、例えば、様々な菌株のE.coli、Bacillus、Streptomyces及びSaccharomyces、並びに哺乳類、酵母及び昆虫細胞を包含する。そのための好適なベクターが知られていて私的及び公的な研究所及び保管所から及び市販ベンダーから入手可能である。現在、最も好ましい宿主は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)又はCOS−1細胞のような哺乳類細胞である。これら宿主は、ワクシニア又は豚痘のようなポックスウイルスベクターと連結して使用され得る。他の適切な宿主及び形質転換、培養、増幅、スクリーニング及び生成物の生産及び精製の方法に関する選択は既知の技術を参考にして当業者によって達成され得る。例えば、GethingとSambrook,Nature,293:623〜625(1981)を参照のこと。
【0082】
他の好ましいシステムはバキュロウイルスの発現系及びベクターを包含する。 従来の組換え手段によって生産されるとき、本発明の組成物、即ちエピトープI免疫原及び所望の免疫原の指定されたコピーを含有するポリペプチド/ペプチドは、従来の溶解技術により細胞内容物から、又はクロマトグラフィーのような従来法により細胞培地から単離され得る。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning. A Laboratory Manual,第2版、Cold Spring Harbor Laboratory,ニューヨーク(1989)を参照のこと。
【0083】
DNAワクチンとしてペプチド/ポリペプチドの生産のために使用される適切なプラスミド及びウイルスベクターは当業者によく知られていて、本発明の限定項目ではない。Sambrookら、上記及びタンパク質の生産に関する上記の参考文献を参照のこと。また、国際特許出願PCTWO94/01139(1994年1月20日公開)も参照のこと。
【0084】
簡略に言うと、選択されるペプチド/ポリペプチドをコードするDNAは、他の所望のフランキング配列、プロモーター、mRNAリーダー配列、開始部位及びin vivo又はin vitroでその配列の増殖及び発現を指令し得る他の調節配列を含有するベクター又はプラスミドへ挿入される。これらベクターは、患者細胞の感染及び合成遺伝子配列のin vivoでの発現又はそのタンパク質/ペプチドとしての又は融合したタンパク質/ペプチドとしてのin vitroでの発現を可能にする。
【0085】
得られた組成物は、任意数の所望免疫原を有するエピトープI組成物へ製剤化され、in vivoアッセイにより効力をスクリーニングされる。そのようなアッセイは、動物、例えばウサギ又はサルを本組成物で免疫化すること、及びHIV−1のTatタンパク質又は(以下の実施例に示されるような)変異体のTat配列に対応する合成の検出ペプチドに対する抗体力価の評価を利用する。
【0086】
I.本発明の抗体組成物
上記のように本発明のペプチド又はポリペプチドに対して向けられる哺乳類の単離された抗体組成物も本発明の側面である。そのようなポリクローナル抗体組成物は、上記のようなエピトープI、II、III及び/又はIV免疫原及び所望の免疫原の組み合わせを含有するペプチド/ポリペプチド組成物で哺乳動物を免疫化することによって産生される。
【0087】
適切な哺乳動物は、サルのような霊長類、ウサギやマウスのような小型の実験動物、並びにウマ、ヒツジ、ウシのような大型動物を包含する。そのような抗体はトランスジェニック動物においても産生される。しかしながら、本発明の組成物に対するポリクローナル抗体を産生するのに望ましい宿主はヒトを包含する。
【0088】
本組成物にさらされた哺乳動物で産生されるポリクローナル抗体は、免疫化された哺乳動物の血漿又は血清から従来技術によって単離されて精製される。従来の採取技術は、いくつかあるなかで、血漿分離法を包含し得る。
【0089】
そのようなポリクローナル抗体組成物それ自身が本発明の医薬組成物として利用され得る。別のやり方では、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び完全なヒト抗体を包含する他の抗体の形態が従来技術を使用して創出され得る。例えば、Harlowら、Antibodies A Laboratory
Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1988);Queenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029〜10032(1989);Hodgsonら、Bio/technology,9:421(1991);国際PCT出願PCT/GB91/01554、公開番号第WO92/04381号及び国際PCT出願PCT/GB93/00725、公開番号第WO93/20210号を参照のこと。他の抗Tat抗体は、ハイブリドーマ又はコンビナトリアルライブラリー、又は本発明により産生されるポリクローナル又はモノクローナル抗体及びエピトープI、II、III、IVのアミノ酸配列又は所望の免疫原を使用して抗体ファージディスプレイ[W.D.Huseら、Science,246:1275〜1281(1988)]をスクリーニングすることによって創出され得る。
【0090】
これらの抗体組成物は既知のHIV−1Tatタンパク質変異体の95%以上、及び好ましくは99%以上に結合し、Tatタンパク質がさらなるHIV−1増殖を支えることを防止する。従って、これらの抗体は以下に記載される医薬品の方法及び製剤において有用である。
【0091】
J.本発明の医薬組成物
本発明のもう1つの側面として、既知HIV−1Tatタンパク質の95%以上、好ましくは99%以上と反応し、HIV−1の増殖を抑える抗体を誘導するのに有用な医薬組成物は、その活性薬剤として、エピトープI、II、III又はIVの1つ又はそれより多くのペプチド又はポリペプチドを含み得る。いくつかの望ましい組成物は以下の上記成分を包含する:
(a)エピトープIのアミノ酸配列SEQ ID NO:6〜9の少なくとも1つ、及び好ましくは4つすべてを含有するペプチド/ポリペプチド免疫原;
(b)エピトープIIアミノ酸配列の少なくとも1つを含有するペプチド/ポリペプチド免疫原;
(c)少なくとも1つ、及び好ましくは3つのエピトープIIIアミノ酸配列を含有するペプチド/ポリペプチド免疫原;
(d)少なくとも1つのエピトープIVアミノ酸配列をを含有するペプチド/ポリペプチド免疫原;
(e)上記のようなエピトープI、エピトープII、エピトープIII又はエピトープIVの1つ又はそれより多くをコードする合成遺伝子;
(f)上記の合成分子;
(g)合成遺伝子又は分子を担う組換えウイルス、及び
(h)合成遺伝子又は分子を担う共生細菌。
【0092】
選択される活性成分は製剤的に許容される担体のなかに存在し、この組成物は追加的な構成成分を含有し得る。本発明の組成物を含有する医薬製剤は、タンパク質/ペプチド組成物のために、MAPに対するT細胞刺激剤のような他の活性成分、アジュバント及び、IL−12及び他の知られたサイトカインのような免疫刺激性サイトカインを含有し得る。これら医薬組成物のすべては哺乳動物のウイルスレベルを低下させるために機能し得る。
【0093】
エピトープI及び/又はII、及び/又はIII、及び/又はIVのアミノ酸配列を所望の免疫原性アミノ酸配列とともに含むこれら組成物は、医薬組成物として、ウイルス感染の予防又は治療用のタンパク質組成物としての投与に適した製剤的に許容される担体とともに混合される。これらのタンパク質は投与のための単一な医薬調製物において複合され得る。本発明の免疫原性タンパク質様組成物における使用に適した製剤的に許容される担体は、当業者によく知られている。そのような担体は、例えば、塩類溶液、緩衝化した塩類溶液、水酸化アルミニウム及びマグネシウムの水性懸濁液のような選択されるアジュバント、リポソーム、水中油型の乳剤、等を包含する。適切なアジュバントはまた本発明のタンパク質含有組成物においても利用され得る。本発明は、担体又はアジュバントの選択によって制限されない。
【0094】
DNA、プラスミド核酸又は組換えベクターの直接投与に適した担体は、限定しないが、塩類溶液、又はスクロース、プロタミン、ポリブレン、ポリリジン、ポリカチオン、タンパク質、CaPO4又はスペルミジンを包含する。例えば、PCT出願WO94/01139及び上記の参考文献を参照のこと。
【0095】
ペプチド/ポリペプチド組成物及び合成遺伝子又は分子は、免疫化した宿主の哺乳動物、例えばヒトにおいて、既知HIV−1由来の細胞外Tatタンパク質変異体の約95%〜約99%以上を駆逐し得る免疫応答をin vivoで誘発し、それによってウイルスレベルを低下し得る。
【0096】
HIV−1の増殖を抑えるのに有用なさらにもう1つの組成物は、上記に詳しく記載された抗体組成物を含む。ある医薬組成物では、抗体は、塩類溶液又は他の適切な担体において担われ得る。この抗体組成物は、Tatに対して体外から提供された即時性の阻止を提供し得る。
【0097】
上記成分から成る、適切なpH、等張性、安定性及び他の従来特性を有するこれらの製剤的に許容される組成物の製造は、当技術分野のなかにある。
【0098】
K.HIV−1の増殖を抑制する本発明の方法
本発明によれば、HIV−1のウイルスレベルを低下させる方法は、上記Tat抗体誘導性の医薬組成物へヒトをさらすこと、既知HIV−1Tatタンパク質の95%以上、好ましくは99%以上と反応する抗体を能動的に誘導すること、及びウイルスの増殖をin vivoで阻止することを含む。この方法は、十分な免疫系を有するHIV−1感染患者、又は非感染又は最近感染した患者に対して適切である。この方法はHIV−1Tatタンパク質と反応する抗体を誘導し、この抗体がHIV−1初期急性感染時のウイルス増殖を減少させ、AIDSに導く慢性のウイルス血症を最少化する。この方法はまた感染患者における慢性のウイルス増殖を低下させ、やはりAIDSへの進行を最少化する。
【0099】
1つの態様では、医薬組成物は、十分な免疫系を有するHIV−1感染者に対し、ウイルス感染の処置又はコントロールのために治療的に投与され得る。そのような感染者は無症候性であり得る。同様の態様では、医薬組成物は予防のために非感染者へ投与され得る。
【0100】
上記2つの例では、医薬組成物は、好ましくはペプチド/ポリペプチド組成物、合成遺伝子又は分子、組換えウイルス又は共生組換え細菌を含有する。この医薬組成物のこれら活性成分のそれぞれは、さらされたヒトにおいて、Tatが感染細胞から他の感染又は非感染細胞へ移動することを阻止する抗Tat抗体の形成を能動的に誘導する。この作用はウイルスの増殖を抑え、HIV−1のウイルス爆発を阻止し、それによってウイルスレベルを低下させる。すでに感染した患者においては、ウイルスレベルを低下させるこの方法は、慢性ウイルス血症及びAIDSへの進行を抑制し得る。非感染者においては、本発明の組成物のこの投与は急性感染を減少させ、それによりAIDSへの進行につながる慢性のウイルス血症を最少化する。
【0101】
本発明のさらに別の側面は、HIV−1感染に対して有効又は迅速な免疫応答を発動し得ないヒトへ、上記抗体組成物を含有する医薬組成物を投与することによってHIV−1のウイルスレベルを低下させる方法である。この方法は組成物を慢性的に投与することを含み得る。この方法で処置するのに適したそのような患者には、疾患によって免疫力が低下して強い免疫応答を発動することができないHIV−1感染患者がいる。HIV−1感染の後期では、この疾患による免疫損傷によって、有効力価の抗体を産生する可能性がより低くなっている。そのような患者のなかにはまたHIV−1に感染した妊娠女性、感染した母親からの新生児、及び推定感染した免疫されていない患者(例、HIV−1感染者が使用した針でうっかり「刺して」しまったヒト)がいる。
【0102】
そのような患者に対しては、本発明の方法は、好ましくは医薬組成物として、他の哺乳動物、好ましくは正常人において製造されたポリクローナル抗体組成物である本発明の抗体組成物を利用する。別のやり方では、上記抗体の他の形態が利用され得る。これら抗体組成物はウイルス増殖を阻害してウイルス負荷を低減するために受動免疫療法として投与される。HIV−1由来の既知Tatタンパク質の95%以上、好ましくは99%以上と反応する外来の抗体は、ウイルス感染細胞から他の感染又は非感染細胞へのTatの移動を即時的に阻止することを患者において提供する。この方法によれば、患者は、長期治療法のための抗体組成物で慢性的に治療され得る。
【0103】
上記方法のそれぞれにおいて、本発明のこれら組成物は適切な経路、例えば皮下、経口、静脈、腹腔内、筋肉内、経鼻又は吸入の経路によって投与される。当面好ましい投与経路は、免疫化(能動誘導)組成物に対しては筋肉内であり、抗体(受動療法)組成物に対しては静脈又は筋肉内である。組換えウイルスベクター又は裸のDNAは、好ましくは筋肉内注射されるが、ある種の他の組換えウイルスベクター及び/又は生きた共生細菌は経口でデリバリーされ得る。
【0104】
各ワクチン投与に存在する本発明のタンパク質、ペプチド又は核酸配列の量は、患者の年齢、体重、性、全般的な身体状況等の考察に関して選択される。免疫応答、好ましくは防御的な応答を誘導するか又は患者に重篤な副作用を起こすことなく体外からの効果を産生するのに必要とされる活性成分の量は、利用される医薬組成物及び(タンパク質含有組成物のための)アジュバントの所望の存在に依存して変化する。
【0105】
一般に、タンパク質/ペプチド、融合タンパク質、MAP又は結合したタンパク質、又は抗体組成物を含有する組成物に対しては、各投与量は、無菌溶液1mLあたりペプチド/ポリペプチド免疫原を約50μg〜約2mg含むものである。より好ましい投与量は免疫原約500μgであり得る。他の投与量の範囲も当業者によって考察され得る。望ましい場合は、所望により初期の投与量を追加免疫によって繰り返し得る。
【0106】
本発明の抗体組成物は、針刺し又は母子感染による急性感染のリスクがある患者に対する慢性治療において利用され得る。そのような「急性」感染に対する投与頻度は、約6週間、連日〜週1回又は2回の静脈又は筋肉内投与の範囲をとり得る。本発明の抗体組成物は、感染患者又は進行したHIVの患者に対する慢性治療にも利用され得る。感染患者では、慢性投与の頻度は連日〜週1回又は2回の静脈又は筋肉内投与の範囲をとり得て、免疫原の半減期(例えば、約7〜21日)に依存し得る。しかしながら、そのような感染患者に対する慢性治療の期間は、不定であるが長期化した期間であると予測される。
【0107】
別のやり方では、本発明の組成物は「裸のDNA」としての本発明の合成遺伝子又は分子を直接投与するために設計され得る。タンパク質の免疫原性組成物と同様に、DNA及びベクター組成物における成分の量及び投与の形式(例えば、注射又は鼻腔内)は当業者によって選択及び調整され得る。一般に、各投与量は、無菌溶液1mLあたり免疫原をコードするDNAを約50μg〜約1mg含むものである。
【0108】
合成遺伝子又は分子を含有する組換えウイルスに対しては、投与量は、本発明の組換えウイルス約1x107〜1x1010pfu/mlの濃度を含有する塩類溶液の約20〜約50mlの範囲をとり得る。ヒトへの好ましい投与量は上記の濃度で約20mlの塩類溶液である。しかしながら、組換えウイルスの同一性及び宿主へデリバリーされる免疫原の構成によって、当業者はそのような投与量を変更し得ることが理解される。
【0109】
患者へデリバリーされる合成遺伝子又は分子を担う共生細菌の量は一般に約103〜約1012細胞/kgの範囲であろう。これらの投与量は、当然ながら、使用される細菌及びこの生菌によってデリバリーされるエピトープI又はエピトープII又はエピトープIII又はエピトープIV及び所望の免疫原を含有する特定の組成物に依存して、当業者により変更され得る。
【0110】
従って、本発明の組成物は、非感染の哺乳動物、例えばヒトの選択されたウイルスによる感染を遅延又は最少化するために設計されている。従って、そのような組成物はワクチンとしての用途を有する。抗Tatタンパク質抗体は、感染後の血清変換を検出する診断アッセイにおいて使用されるHIV−1タンパク質とは反応しない。従って、本発明の組成物で処置された被検者はHIV−1感染の偽陽性テストで誤診されず、処置された被検者が実際にHIV−1に感染したとしても血清変換を検出することは依然として可能であろう。
【0111】
本発明の組成物をタンパク質/ペプチド含有組成物として、又は免疫原をコードする新規核酸配列の投与により哺乳動物へ提供することがAIDS予防接種にとっての根本的に異なる戦略となるのは、本発明の組成物が既知HIV−1のTatタンパク質変異体の約95%以上、及び好ましくは99%以上を生物学的に阻止してウイルスレベルを低減させ、HIV−1の増殖を抑えることを可能にするからである。
【0112】
Tat免疫原含有組成物の使用は、そのようなウイルスに対して利用されている他の治療及び予防方法に比較して特に望ましい利点を有する。Tatタンパク質の阻止はHIV類似の全種又は全株の増殖を区別なく体外から阻害するので、突然変異するウイルス変種を選別する方向に親ウイルスそのものへ選択圧力をもたらすことはない。従って、患者の細胞によるTatタンパク質の取込みを妨害することは、ウイルス血症のレベルを低下させるだけでなく、「エスケープ変異体」の選択を除外するやり方でもそうするのである。
【0113】
追加的に言うと、細胞外のTatタンパク質は、疾患の経過において、この段階のHIV−1感染に存在する持続感染及び免疫異常に貢献する可能性があるので、本発明はウイルス血症のある無症候性のHIV−1感染患者を能動的に処置する方法を含む。本発明による免疫化によって誘導される抗体によって細胞外のTatタンパク質が阻止されれば、より有効な免疫コントロールでウイルス血症を低減し、AIDSへの進行の遅延又は予防を結果的にもたらし得る。
【0114】
上記のような本発明の機序は、ウイルス感染の経過を妨害して望ましい臨床結果をもたらす上で有用である。より特定すると、本発明の組成物は、非感染細胞によるTatタンパク質のさらなる取込みを阻止することによって、すでにこのウイルスに感染した患者のウイルス血症を低減することができる。本発明の組成物は、HIV感染患者に対して単独か又は他の治療法と一緒かのいずれかで使用され、ウイルス血症の低減及び臨床的な悪化の予防に役立つことが期待される。
【0115】
そのような治療上の使用に対しては、投与の製剤及び形式は上記に特別に記載したものと実質的に同一であり、特定のウイルス感染に対する他の従来治療薬と同時又は一緒に投与され得る。治療用の使用又は予防用の使用のためには、この免疫化組成物を、毎年の追加免疫又は他の間隔での追加免疫のように、繰り返し投与することが所望され得る。
【0116】
L.本発明の診断キット
上記ペプチド及びポリペプチドは、上記組成物を用いた予防接種によって誘導される抗体の力価及び特異性の測定及び検出に有用なキットの試薬としても利用され得る。本発明のキットはエピトープI〜IVの1つ又はそれより多くのペプチドを包含し得る。1つの態様では、各ペプチドはそのN末端にタンパク質ビオチン及び、例えば−Ser−Gly−Ser−Gly−[SEQ ID NO:30]のようなスペーサーを有する。別のやり方では、ペプチドはそのC末端に、例えば−Gly−Ser−Gly−Ser−[SEQ ID NO:90]のようなスペーサー及びタンパク質ビオシチンを有する場合がある。これらの態様はペプチドがアビジン被覆された固体支持体(例、プレート又はビーズ)に結合されることを可能にする。当然ながら、診断アッセイ技術の分野で当業者により知られている他の結合剤も同様の目的のために利用され得る。このキットにまた提供されるのは、ヤギの抗ヒト免疫グロブリン等のような、固定化エピトープペプチドへの抗体の結合を検出する標識化された試薬である。試薬上のラベルは、放射活性化合物、蛍光化合物及びタンパク質、比色定量用の酵素等のような、多くの既知診断ラベルから選択され得る。従ってキットはまた、酵素ラベルと相互作用して色シグナル等を発するある種の基質、血液サンプルを採取する装置、並びに適切なバイアル及び他の診断アッセイ成分のような、様々な試薬及びラベル読み取り用の装置も含有する。当業者はこのキットのために他の従来の診断成分も容易に選択し得る。
【0117】
そのようなキット及び試薬は、本発明の組成物で予防接種された被検者の抗体の力価及び反応性パターンを検出するための方法において利用され得る。Tat免疫原に対する免疫化により誘導された抗体の存在及び力価を決定する方法は、免疫化した被検者由来の生物学的サンプル(例、体液、好ましくは血液、血清又は血漿、また可能ならば尿、唾液及び他の体液又は組織)を好ましくはプレート又はビーズのような固体支持体に固定化されたエピトープI、II、III又はIVの結合する配列の1つ又はそれより多くと接触させる工程を包含する。この方法に利用されるエピトープI、II、III又はIVの結合配列は、非修飾で、最少の結合領域であり得る。従って、そのような配列は、−Val−Asp−Pro−Y−Leu−Glu−Pro−[SEQ ID NO:86]又は−Glu−Pro−Val−Asp−Pro−Y−Leu−Glu−Pro−[SEQ ID NO:124](ここでYはArg、Lys、Ser及びAsnからなる群から選択される)及び/又は−Lys−X−Leu−Gly−Ile−Ser−Tyr−Gly−Arg−Lys−Lys−[SEQ ID NO:87](ここでXはGly又はAlaからなる群から選択される);及び/又は−Arg−Arg−X−Z−A−Y−Ser−[SEQ ID NO:88](ここでXはAla、Pro、Ser及びGlnからなる群から選択され、YはAsp、Asn、Gly及びSerからなる群から選択され、ZはPro及びHisからなる群から選択され、AはGln及びProからなる群から選択される);及び/又は−Ser−Gln−X−His−Gln−Y−Ser−Leu−Ser−Lys−Gln−Pro−[SEQ ID NO:89](ここでXはAsn及びThrからなる群から選択され、YはAla及びValからなる群から選択される)を包含する。
【0118】
生物学的サンプルを十分な時間固定化ペプチドにさらした後で、支持体を洗浄してペプチドに結合しない生物学的サンプル由来の物質をすべて除去する。そのような洗浄工程は診断アッセイでは従来的であり、塩類溶液を用いて実施される。エピトープI又はII又はIII又はIV又はそれらの組み合わせに対する抗体が上記の処置によって被検者に誘導されていれば、この生物学的サンプルに由来する抗体が固定化ペプチドに結合している。その後、標識試薬を支持体上の物質に加え、固体支持体上のペプチドと前記生物学的サンプル間の結合を検出する。好ましくは、そのような試薬は、ヤギ抗ヒト免疫グロブリンのような抗ヒト免疫グロブリンである。ラベルは、すでに論じたように、従来から利用されている様々な診断用ラベルから選択される。1つの態様ではこのラベルは比色定量用の酵素であり得て、これは基質と接触すると検出可能な色シグナルを発する。この色の存在及び/又は強度が処置された被検者における抗体の誘導の証拠を提供する。このアッセイは免疫化の効果を決定するとともに患者の免疫状態を監視するために利用され得る。
【0119】
また、多種多様な検出ラベルシステムだけでなく特定のアッセイ工程を選択することは、当技術分野内に十分ある。そのような選択は定常的であり、本発明を制限しない。
【0120】
M.本発明の利点
本発明の組成物の利点の1つは、共通BサブタイプHIV−1の既知Tatタンパク質変異体の95%以上〜99%以上と交叉反応するのに必要とされる、本発明の組成物に包含される免疫原の数が少ないことにある。すでに述べたように、YがLysであるエピトープI[SEQ ID NO:7]は4種のY位変異体すべてに対する交叉反応性が十分にあり、単独で免疫原性組成物において使用され得る。別のやり方では、以下の実施例で説明されるように、4種のエピトープIアミノ酸配列すべてを含有するエピトープI免疫原性組成物は、共通BサブタイプHIV−1の399種あるTatタンパク質の387種と、並びにそれほど頻発性ではないHIV−1非Bサブタイプ由来の全18種のTatタンパク質と交叉反応する。従って、ある単一の組成物でも、遭遇し得る大部分のHIV−1株によって引き起こされる感染に対する防御又は治療において有用に利用され得る。
【0121】
さらに、結合することが所望されるTat上の正確なエピトープ(即ち、SEQ ID NO:1のアミノ酸2〜10、アミノ酸41〜51又はアミノ酸56〜62)を同定したので、新たに発生するHIV−1株又は新たに発見される株由来の新たな望ましいTatペプチド免疫原が、本明細書に記載される方法を使用して容易に同定され、本組成物のなかに包含され得る。この融通性により本発明の組成物は将来同定される任意の新しいHIV−1株に対して予防的に使用され得る。本明細書の教示に照らせば、当業者にはTat免疫原(及びそれをコードする核酸の構築体)の新しい組み合わせを組成物のなかへ容易に取り込むことができると期待される。
【0122】
例えば、PCR及び高密度オリゴヌクレオチドアレイ[M.J.Kozalら、Nature Med.,2:753(1996)]のような従来技術の使用は、臨床的に単離されるHIV−1株及びサブタイプの変異体を代表する数多くのHIV−1Tatタンパク質のアミノ酸配列を得ることを当業者に可能にする。そのような技術を使用すれば、今日まであまり研究されてこなかった、HIV−1Bサブタイプの他の変異体並びに低開発諸国の他のサブタイプを決定することが可能になる。新しいTat配列が決定されれば、対応するペプチドを免疫原として本発明の組成物へすぐに包含することが可能になり、他の稀なHIV−1Tatタンパク質に対する抗体応答を誘導することが可能になる。
【0123】
各Tat変異体に対応する合成ペプチドに対して産生される抗体に関する交叉反応性試験は、配列変化が免疫学的にサイレントであるTat変異体で免疫化することの必要性をなくすために利用され得る。これらペプチドがコンセンサス配列又は他の変異体と抗体によって強く結合するからである。
【0124】
以下の実施例は、本発明の組成物を製造すること及びこれらの組成物を利用して免疫化した宿主においてこのウイルスのTatタンパク質に対する抗体を誘導することの好ましい方法を説明する。これら実施例は説明するだけであって、本発明の範囲を限定しない。
実施例1−HIV−1Tatタンパク質のエピトープIに対する抗体に結合するのに必要なTatタンパク質の最少アミノ酸配列に関する免疫学的試験
図1に示したSEQ ID NO:1のアミノ酸4〜16に対応するペプチドを以下に記載するようにして合成した。この配列は、NIAID・HIVデータベースに報告された共通Bサブタイプの31種のTatタンパク質配列においてこれらの位置で最も頻繁に現れる配列の1つである。この配列を推定免疫原として選択し、エピトープIと命名した。
【0125】
A.ペプチド合成−免疫化ペプチド
この免疫原のアミノ酸配列−Val−Asp−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−Trp−Lys−His−Pro−Gly−Ser−[SEQ ID NO:28]をH.M.Geysenら、J.Immuol.Meth.,102:259(1987)の方法により、担体タンパク質へのカップリングを促進するためにN末端システイニルを取込んで、ポリプロピレン・ぺグ(peg)上で固相法により合成した。以下の表2にデータが報告されている実験のほとんどでは、免疫化ペプチドのN末端はフリーのアミンとして残し、C末端はアミド化した。免疫化ペプチドは一般に逆相HPLCによって95%以上の純度へ精製され、純度は質量分析法(MS)によってさらに確認された。
【0126】
A.C.J.Leeら、Molec.Immunol.,17:749(1980)の方法により、ジフテリアトキソイド(DT)1モルにつき6〜8モルのペプチドという比率を使用して、システイニル側鎖を介して、免疫化ペプチドをDT担体タンパク質に共有結合させた。
【0127】
B.ペプチド合成−検出ペプチド
反応性及び交叉反応性を検出するELISAアッセイでの使用のために、免疫原ペプチドのアミノ酸配列に対応するペプチドを、上記のようにGeysenの方法により合成した。N及びC末端を切断した追加的なペプチドも合成した。
【0128】
以下の表2及び3に報告される実験のほとんどでは、検出ペプチドはN末端に−Ser−Gly−Ser−Gly−[SEQ ID NO:30」を付加し、この新たなN末端をビオチニル化し、C末端はフリーの酸のままであった。この実験のいくつかに対しては、このC末端検出ペプチドが不注意にもC末端がアミド化されて合成され、このために以下の表2及び3に報告されるSEQ ID NO:32−Asp−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−Trp−Lys−His−Pro−Gly−Ser−に対する見かけ上高い結合性につながった可能性がある。従って、いくつかのペプチドは適切なC末端基を有して再合成し、実験の肝要な部分は−Val−Asp−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−Trp−Lys−His−Pro−Gly−Ser−[SEQ ID NO:28]に対する抗体を用いて繰り返し、この結果を以下の表3に報告した。これらの検出ペプチドは質量分析では70%を超える純度を有し、それ以上は精製しなかった。
【0129】
C.ウサギの免疫化
このペプチド結合体を精製水に取り、完全フロイントアジュバント(CFA)又は不完全フロイントアジュバント(IFA)と1:1で乳化した[ANTIBODIES−A LABORATORY MANUAL,E.HarlowとP.Lane編、Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]。ウサギ1匹につき全量は1mlであり、これはDTに結合したペプチド100μgを含有した。
【0130】
免疫化ペプチドのために2兎を使用し、初めはCFAの結合体で筋肉内(IM)注射し、次いで2週目にIFAの結合体でIM注射により追加免疫した。第1回目の注射の前に前採血をして、追加免疫の注射後3及び5週目により大量の採血をした。
【0131】
D.ビオチニル化ペプチドに対する抗血清結合のELISAによる定量
これらのアッセイは、H.M.Geysenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:3998(1983)に記載されるようにして実施した。簡略に言うと、Nunc Immuno MaxisorbTM96穴プレートを使用して、ビオチニル化ペプチドをストレプタビジン被覆プレートへ結合させ、各工程間でリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄し、抗血清の希釈液及び西洋ワサビペルオキシダーゼの結合した抗ウサギ免疫グロブリンとともに連続インキュベーションを実施し、結合した抗体を検出した。プレートをABTSで発色させ、405nmでO.D.を読み取った。O.D.1.0以上の吸光度を陽性とみなし、各抗血清の倍々希釈から力価を定量した。一定の免疫原に対する各抗血清対の幾何平均力価(GMT)を算出した。
【0132】
【表2】
【0133】
【表3】
【0134】
表2及び3に報告されたELISAの結果は、第一の免疫原に対する抗体が配列−Asp−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro[SEQ ID NO:1のアミノ酸5〜10]と反応していることを示した。これらの配列のN又はC末端を切断すると、ELISAの力価が低下した。表2及び3の結果をまとめると、エピトープIペプチドのN末端Valは抗体結合に対してわずかに貢献している(欠失すると結合性が65%になる)。従って、HIV−1Tatの第一の抗体結合領域の定義は、本明細書でエピトープIとして言及され、−Val−Asp−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−[SEQ ID NO:34]である。
【0135】
E.HIV−1TatエピトープIの最少配列分析
以下の実験は、免疫化ペプチド配列としてVal−Asp−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−Trp−Lys−His−Pro−Gly−Ser−NH2[SEQ ID NO:28]を使用して実施した。表3の結果で示されるように、抗体の最大結合を有するエピトープIの最少配列は、Val−Asp−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−[SEQ ID NO:34]として確かめられる。C末端を延長したときの結合性の変化は有意でない。N末端のVal又はC末端のProを切除すると結合力価がやや減少するが、これ以上の切断は特異的な結合をほとんど完全に消失させる。このことは、Asp−Pro−Arg−Leu−Glu(SEQ ID NO:1のアミノ酸5〜9)が特異抗体との相互作用を創出する最も重要なアミノ酸であることを示す(例えば、図3を参照のこと)。GMTは、免疫原配列を含有する検出ペプチドに関するGMTの比率(%)として報告される。
【0136】
F.エピトープI免疫原の延長が抗体力価に及ぼす効果
免疫原のエピトープ配列のN末端を延長しても免疫原性に影響しない。対照的に、C末端をVal−Asp−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−Trp−Lys−His−Pro−Gly−Ser−NH2[SEQ ID NO:28]まで延長すると10倍力価が増強される。現在の最適な免疫化配列はSEQ ID NO:28であるらしい。SEQ ID NO:28に関するGMTは、表4に示すように、このペプチドに関するSEQ ID NO:28への抗血清のGMT%として報告されている。
【0137】
【表4】
【0138】
G.N末端が延長された免疫原によって誘導される抗体の結合パターン
エピトープI免疫原に対する抗血清の、N末端Metを介してN末端配列を延長した配列との結合性を、完全長の検出ペプチド及びN又はC末端が切除された検出ペプチドを用いて試験した。これらの例では、免疫化ペプチドのいくつかは、担体タンパク質にカップリングするためのC末端Cysアミドが付いて合成され、対応する検出ペプチドは、アビジン被覆プレートに結合するC末端−Gly−Ser−Gly−Ser−ビオシチン−アミド[SEQ ID NO:91]が付いて合成された。
【0139】
【表5】
【0140】
【表6】
【0141】
上記のデータから、免疫化エピトープIペプチドのN末端延長は、抗体結合領域をHIV−1Tatタンパク質配列のGlu2まで拡張することが明らかである。
【0142】
【表7】
【0143】
これらのデータは、N末端が様々であるが結合領域はわずかに異なる免疫原から、非常に似た抗Tat抗体の全力価が得られることを示す。
実施例2−HIV−1Tatタンパク質のエピトープIにおける配列変異とこれらの配列に対する抗血清の免疫学的な交叉反応性
Los Alamos National Laboratory,ロスアラモス、NMのTheoretical Biology and Biophysicsグループによって公表されたHUMAN RETROVIRUSES and AIDS 1996で入手される配列、及びこのLos Alamos LaboratoryのEsther Guzmanの厚意によりGenBankから入手された追加的な配列で、SEQ ID NO:1のTatタンパク質アミノ酸5〜10の配列における変異を分析した。
【0144】
A.配列における変異
HIV−1の共通Bサブタイプ399種の5〜10アミノ酸Tatヘキサペプチド配列、及び非Bサブタイプから18種(サブタイプAから6種、サブタイプCから2種、サブタイプDから7種、サブタイプFから2種、サブタイプUから1種)を入手した。
【0145】
Bサブタイプについては、このヘキサペプチド内の唯一の変異として3位に、全399種のヘキサペプチドのうち386種(97%)がArg(289,74%)又はLys(45,11%)又はSer(36,9%)又はAsn(16,4%)のいずれかを有していた。残りの変異(3%)は、
−Gly−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−(4)[SEQ ID NO:11]、
−Asp−Pro−Gly−Leu−Glu−Pro−(2)[SEQ ID NO:14]及び単独例の
−Asp−His−Arg−Leu−Glu−Pro−[SEQ ID NO:41]、
−Ala−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−[SEQ ID NO:12]、
−His−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−[SEQ ID NO:13]、
−Asp−Pro−Arg−Ile−Glu−Pro−[SEQ ID NO:15]、
−Asp−Pro−Arg−Leu−Gly−Pro−[SEQ ID NO:16]、
−Asp−Pro−Arg−Leu−Glu−Ala−[SEQ ID NO:17]及び
−Asn−Pro−Ser−Leu−Glu−Pro−[SEQ ID NO:18]を含んでいた。
【0146】
18種の非Bサブタイプの配列については、ヘキサペプチドアミノ酸5〜10の3位に、2つがArgを有し、1つがLysを有し、2つがSerを有し、9つがAsnを有していた。他の変異体は、
−Asp−Pro−Asn−Leu−Asp−Pro−(2)[SEQ ID NO:42]、及び単独例の
−Asp−Pro−Asn−Ile−Glu−Pro−[SEQ ID NO:43]及び
−Asp−Pro−Asn−Leu−Glu−Ser−[SEQ ID NO:44]であった。
【0147】
B.4種の主要免疫原の免疫学的反応性及び交叉反応性の評価
以下の配列[順に、SEQ ID NO:28及び45〜47]につき、実施例1に記載されたようにして、免疫化及び検出の配列を合成した。
−Val−Asp−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−Trp−Lys−His−Pro−Gly−Ser−、
−Val−Asp−Pro−Lys−Leu−Glu−Pro−Trp−Lys−His−Pro−Gly−Ser−、
−Val−Asp−Pro−Ser−Leu−Glu−Pro−Trp−Lys−His−Pro−Gly−Ser−、
−Val−Asp−Pro−Asn−Leu−Glu−Pro−Trp−Lys−His−Pro−Gly−Ser−。
【0148】
ウサギを免疫化し,実施例1に記載されたようにして、ELISAによって反応性及び交叉反応性をテストした。自己反応性を表8にまとめる。
【0149】
【表8】
【0150】
エピトープIの3位のアミノ酸残基が変化しているこれらの主要免疫原間の交叉反応性を表9に示す。以下に報告される結果が反応性の低い抗血清を用いた平均値であることに留意すること。
【0151】
【表9】
【0152】
表8及び9は、各変異体は有効な免疫原であるが、変異体間には全体的にはごくわずかな交叉反応性しかないことを示している。最高の交叉反応性が得られるのはLys3含有の免疫原である。このことは、最適のカバレッジのためには、上記のような主要組成物において免疫原として4種の変異体すべてを包含する必要があることを示唆する。
【0153】
C.他の変異体の交叉反応性の評価
残るすべてのエピトープ変異体のために検出ペプチドを合成し、適当な3位主要ヘキサペプチド免疫原に対する抗血清との交叉反応性を試験した。適当な3位主要免疫原との交叉反応性対自己反応性を表10に示す。
【0154】
【表10】
【0155】
表8〜10の結果は、4種の主要免疫原で免疫化すれば共通BサブタイプのHIV−1Tatタンパク質の97%以上と反応する抗体を産生し得ることを示した。興味深いことに、データベースにある18種の非Bサブタイプはすべて主要免疫原に対する抗体と反応するエピトープI配列を有していた。
【0156】
D.ある種のエピトープI変異体の免疫原性
以下の2種のエピトープIペプチド変異体について免疫化ペプチド及び検出ペプチドを合成し、実施例1のように免疫化及びELISA試験をした。自己力価(GMT)を表11に示す。
【0157】
【表11】
【0158】
これらのデータは、この一次免疫原に加えて稀な変異体を包含することで、抗体カバレッジがそのような稀なエピトープ変異体へ拡張することを示す。
【0159】
4種の一次エピトープI配列で免疫化すると、全HIV−1株の97%以上のTatタンパク質と反応する高力価の抗体を誘導し得る。このカバレッジは、所望により免疫化組成物にさらに稀なエピトープI変異体を包含して拡張され得る。
【0160】
E.免疫原のN末端延長が免疫学的保存性及び交叉反応性に及ぼす結果
すでに試験したエピトープI配列を検討すると、Glu−Pro−延長における主要な変異は、配列の9%で起こっているGluのAspへの置換である。しかしながら、表12で示されるように、Glu含有ペプチドに対する抗体は対応するAsp含有ペプチドと実質的に交叉反応し、逆もまた真である。
【0161】
【表12】
【0162】
Glu及びAsp間の変異の他には、この2つの位置には7つしか他の変異がなく(Lys/Gluが5つ、Leu−Pro置換が2つ)、BサブタイプHIV−1Tatタンパク質における拡張エピトープIの免疫学的保存性を95%にしている。18種の非Bサブタイプ配列については、16種だけがGlu−Pro延長に対応する配列を含有し、Glu/Asp変異とは異なり、2つのFサブタイプ配列(Glu−Leu)を除くすべてがGlu−Pro又はAsp−Proであり、88%の免疫学的保存性をもたらした。従って、N末端配列が拡張したペプチドで免疫化することは、既知HIV−1Tatタンパク質配列の広汎なサンプルに対して高率の免疫反応性をやはり提供する。
実施例3−HIV−1Tatタンパク質のCYS 37 に続く直線状18アミノ酸配列の内部に抗体結合性アミノ酸配列(エピトープII)を決定すること
図1に示されるSEQ ID NO:1のアミノ酸35〜55に対応するペプチドを実施例1に記載されるようにして合成した。実施例1に記載される方法を使用して、低力価の抗体応答をウサギに検出した。この抗体結合に関わる配列を決定する試験を表13に要約する。幾何平均力価(GMT)は自己力価の比率として報告されている。
【0163】
【表13】
【0164】
このELISA試験の結果は、誘導された低力価の抗体が配列Leu−Gly−Ile−Ser−Tyr−Gly−Arg−Lys−Lys(SEQ ID NO:1のアミノ酸43〜51)と結合することを確定した。従って、この配列及び配列Lys−Gly−Leu−Gly−Ile−Ser−Tyr−Gly−Arg−Lys−Lys(SEQ ID NO:1のアミノ酸41〜51)を合成し、ウサギを免疫化するために使用した。
【0165】
最小のエピトープ、Leu−Gly−Ile−Ser−Tyr−Gly−Arg−Lys−Lys(SEQ ID NO:1のアミノ酸43〜51)で免疫化すると、低力価の抗体(GMT1,000)しか産生しなかったが、驚くべきことに、Lys−Gly−Leu−Gly−Ile−Ser−Tyr−Gly−Arg−Lys−Lys(SEQ ID NO:1のアミノ酸41〜51)で免疫化すると、検出ペプチドPhe−Ile−Thr−Lys−Gly−Leu−Gly−Ile−Ser−Tyr−Gly−Arg−Lys−Lys−Arg−Arg−Gln−Arg[SEQ ID NO:105]に対して高力価の抗体(GMT20,000)が誘導された。
【0166】
ほとんどのエピトープII配列と反応する抗体を誘導する免疫原の設計を可能にするためにエピトープII内部で起こる配列の変異を分析した。共通BサブタイプのHIV−1Tatタンパク質アミノ酸41〜51について441種の変異、及び非Bサブタイプから21種(サブタイプAから7種、サブタイプCから4種、サブタイプDから7種、サブタイプFから2種、サブタイプUから1種)を入手した。Bサブタイプについては、441種のうち422種(96%)が正常な配列を有していたが、134種(32%)でAlaがGlyに置換されていた。非Bサブタイプの配列については21種のうち20種(95%)が正常な配列を有していた。
【0167】
Lys−Gly−Leu−Gly−Ile−Ser−Tyr−Gly−Arg−Lys−Lys(SEQ ID NO:1のアミノ酸41〜51)によって誘導される抗体の反応性を、以下のようにリストした検出ペプチドに基づいて、Lys−Gly−Leu−Gly−Ile−Ser−Tyr−Gly−Arg−Lys−Lys(SEQ ID NO:1のアミノ酸41〜51)に対する抗血清の力価を検定して試験した。
【0168】
【表14】
【0169】
上記のデータは、Ala変異体について完全な免疫学的交叉反応性があること、及びLys−Gly−Leu−Gly−Ile−Ser−Tyr−Gly−Arg−Lys−Lys(SEQ ID NO:1のアミノ酸41〜51)への抗体応答が先に同定したエピトープLeu−Gly−Ile−Ser−Tyr−Gly−Arg−Lys−Lys(SEQ ID NO:1のアミノ酸43〜51)に対して依然残っていることを示す。従って、Lys−Gly−Leu−Gly−Ile−Ser−Tyr−Gly−Arg−Lys−Lys(SEQ ID NO:1のアミノ酸41〜51)での免疫化は、既知HIV−1Tatタンパク質の96%以上と反応する高力価の抗体を誘導する。
実施例4−HIV−1Tatタンパク質のエピトープIIIの抗体に結合するのに必要なTatタンパク質の最少アミノ酸配列に関する免疫学的試験
図1に示したSEQ ID NO:1のアミノ酸53〜62に対応するペプチドを以下に記載するようにして合成した。この配列は、NIAID・HIVデータベースに報告された共通Bサブタイプの31種のTatタンパク質配列においてこれらの位置で最も頻繁に現れる配列の1つである。この配列を第二の推定免疫原として選択した。
【0170】
A.ペプチド合成−免疫化ペプチド
この免疫原のアミノ酸配列−Arg−Gln−Arg−Arg−Arg−Ala−Pro−Gln−Asp−Ser−[SEQ ID NO:29]をエピトープIの実施例1に記載されているようにして合成した。データが報告されている実験の結果は以下の表15〜16に表されている。免疫化ペプチドは一般に逆相HPLCによって95%以上の純度へ精製され、純度は質量分析法(MS)によってさらに確認された。実施例1AのエピトープIについて記載したように、システイニル側鎖を介して、免疫化ペプチドをジフテリアトキソイド(DT)担体タンパク質に共有結合させた。
【0171】
B.ペプチド合成−検出ペプチド
反応性及び交叉反応性を検出するELISAアッセイでの使用のために、免疫原ペプチドのアミノ酸配列に対応するペプチドを、上記のようにGeysenの方法により合成した。N及びC末端を切断した追加的なペプチドも合成した。
【0172】
以下の表15に報告される実験のほとんどでは、検出ペプチドはN末端に−Ser−Gly−Ser−Gly−[SEQ ID NO:30」を付加し、この新たなN末端をビオチニル化し、C末端はフリーの酸のままであった。これらの検出ペプチドは質量分析では70%を超える純度を有し、それ以上は精製しなかった。
【0173】
C.ウサギの免疫化
このペプチド結合体を精製水に取り、実施例1Cに記載されているように、CFA又はIFAと1:1で乳化した。ウサギ1匹につき全量は1mlであり、これはDTに結合したペプチド100μgを含有した。免疫化ペプチドのために2兎を使用し、初めはCFAの結合体で筋肉内(IM)注射し、次いで2週目にIFAの結合体でIM注射により追加免疫した。第1回目の注射の前に前採血をして、追加免疫の注射後3及び5週目により大量の採血をした。
【0174】
D.ビオチニル化ペプチドに対する抗血清結合のELISAによる定量
これらのアッセイは、H.M.Geysenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:3998(1983)に記載されるように、及びエピトープIの実施例1Dに記載されるようにして実施した。表15の結果から、HIV−1Tatのもう1つの抗体結合領域の定義は、本明細書でエピトープIIIとして言及され、−Arg−Arg−Ala−Pro−Gln−Asp−Ser−[SEQ ID NO:19]である。
【0175】
E.HIV−1TatエピトープIIIの最少配列分析
以下の実験は、免疫化ペプチド配列としてArg−Gln−Arg−Arg−Arg−Ala−Pro−Gln−Asp−Ser−NH2[SEQ ID NO:29]を使用して実施した。以下の表15の結果は、抗体の最大結合を有するエピトープIIIの最少配列が、Arg−Arg−Ala−Pro−Gln−Asp−Ser[SEQ ID NO:19]であることを示す。検出ペプチドのN末端又はC末端を延長しても有意に異なる結合性は生まれない。N末端のArgを切除すると結合力価がやや減少するが、次のN末端Arg又はC末端Serの切断は特異的な結合をほとんど完全に消失させる。このことは、Arg−Ala−Pro−Gln−Asp−Ser(SEQ ID NO:1のアミノ酸57〜62)が特異抗体との相互作用を創出する最も重要なアミノ酸であることを示す(図4を参照のこと)。GMTは、免疫原配列を含有する検出ペプチドに関するGMTの比率(%)として報告される。
【0176】
【表15】
【0177】
F.HIV−1TatエピトープIII−抗体力価に対する免疫原の効果
C末端延長のどんな例も免疫原性を消失させ、力価を低下させる。対照的に、ある点までのN末端延長は免疫原性を高め、Gln−Arg−Arg−Arg−Ala−Pro−Gln−Asp−Ser(SEQ ID NO:1のアミノ酸54〜62)で最大力価が得られ、Arg−Arg−Gln−Arg−Arg−Arg−Ala−Pro−Gln−Asp−Ser(SEQ ID NO:1のアミノ酸52〜62)を免疫原とすると免疫原性が低下した。Arg−Gln−Arg−Arg−Arg−Ala−Pro−Gln−Asp−Ser(SEQ ID NO:1のアミノ酸53〜62)についてのGMTをこのペプチドに対する抗血清の、この検出ペプチドについてのGMT%として表16に報告する。
【0178】
【表16】
【0179】
実施例5−HIV−1Tatタンパク質のエピトープIIIにおける配列変異とこれらの配列に対する抗血清の免疫学的な交叉反応性
HUMAN RETROVIRUSES and AIDS 1996(上記)で入手される配列及び追加的な配列[GenBank]において、実施例4に記載されるようにして、Tatタンパク質のアミノ酸56〜72の配列における変異を分析した。
【0180】
A.エピトープIII配列における変異
HIV−1の共通BサブタイプのエピトープIII482種の配列を分析に供した。最も頻繁に見出された配列は式−Arg−Arg−X−Pro−Gln−Y−Ser−[SEQ ID NO:110]に一致し、ここでXはAla、Pro、Ser又はGlnであり、YはAsp、Asn、Gly又はSerである。この配列タイプは、免疫学的に交叉反応するようだが(以下を参照)、入手された482種のTat配列のうち292種(61%)に見出された。
【0181】
他の配列変異体はより低い率で起こり、これらは以下の表17にリストされるものに包含された。
【0182】
【表17】
【0183】
これらの配列は、一緒にするとエピトープIII変異体の85%を占め、そのバランスは大多数の低率変異からなる。
【0184】
18例のHIV−1非BサブタイプからだけエピトープIII配列が入手された。エピトープIと違って、それらはBサブタイプ配列からの逸脱を示した。追加的な非BサブタイプエピトープIII配列が決定され、本発明の免疫原性組成物に望まれるならば、所望により数多くの配列も本発明の組成物へ包含されるために選択され得る。
【0185】
B.選択されたエピトープIII配列の免疫学的反応性及び交叉反応性の評価 表18の配列について、実施例1に記載されるようにして、免疫化及び検出の配列を合成した。実施例4に記載されるようにして、ウサギを免疫化し、抗血清の反応性及び交叉反応性をELISAによって試験した。様々な抗血清及び検出ペプチドを利用して、様々な配列の免疫原性及び免疫学的な交叉反応性を決定した。式−Arg−Arg−X−Pro−Gln−Y−Ser−[SEQ ID NO:10](上記参照)のエピトープIII配列の範囲及び免疫学的反応性を表18に示す。以下の表18では、Cys−Arg−Gln−Arg−Arg−Arg−Ala−Pro−Gln−Asp−Ser−[SEQ ID NO:74],自己力価=46,115に対する抗血清について、交叉反応性比率を測定した。表18は、−Arg−Gln−Arg−Arg−Arg−Ala−Pro−Gln−Asp−Ser−[SEQ ID NO:29]を用いた免疫化が、HIV−1株の61%に代表される、これら変異体のほとんどと有効な交叉反応性を提供することを示している。
【0186】
【表18】
【0187】
−Arg−Arg−Ala−Pro−Pro−Asp−Asn−[SEQ ID NO:50]及び−Arg−Arg−Ala−Pro−Pro−Asp−Ser−[SEQ ID NO:20]を用いた免疫化では、表19に示されるように、いずれの検出ペプチドとも交叉反応する抗体を生じた。従って、いずれかの配列を本発明の免疫化組成物に包含すれば、482種のHIV−1株のさらに41種(8.5%)におけるTatタンパク質エピトープIII変異体に対する抗体が提供される。
【0188】
−Arg−Gln−Arg−Arg−Arg−Ala−His−Gln−Asn−Ser−[SEQ ID NO:52][20/482(4%)]で免疫化すると、自己力価が209,286で、−Arg−Arg−Ala−His−Gln−Asn−Ser−[SEQ ID NO:21][17/482(3.5%)]との交叉反応性が5,356(2.5%)である抗体が誘導された。従って、この配列を免疫原に包含するとHIV−1株のさらに27/482(7.5%)がカバーされる。
【0189】
従って、3種のエピトープIII変異体、
−Arg−Arg−Ala−Pro−Gln−Asp−Ser−[SEQ ID NO:19]、
−Arg−Arg−Ala−Pro−Pro−Asp−Asn−[SEQ ID NO:50]及び
−Arg−Arg−Ala−His−Gln−Asn−Ser−[SEQ ID NO:22]での免疫化は、HIV−1株の77%のTatタンパク質と反応する抗体を提供する。
【0190】
【表19】
【0191】
実施例6−HIV−1Tatタンパク質のエピトープIVの抗体に結合するのに必要なTatタンパク質の最少アミノ酸配列に関する免疫学的試験
McPheeら、FEBS Letters 233:393(1988)の公表物は、HIV−1感染被検者のある血清が合成ペプチドSer−Gln−Thr−His−Gln−Val−Ser−Leu−Ser−Lys−Gln−Pro−Cys[SEQ ID NO:111]と反応することを示唆したが、誤ってHIV−1Tatタンパク質のアミノ酸71〜83として報告された(正しい位置はアミノ酸61〜73である)。ゆえに発明者は合成ペプチド−Ser−Gln−Thr−His−Gln−Val−Ser−Leu−Ser−Lys−Gln−Pro[SEQ ID NO:112]でマウスを免疫化し、このペプチドと反応する、幾何平均力価26,517の抗体が産生されることを確定した。
【0192】
最小のエピトープサイズを決定するために、一連の末端切断ペプチドを合成し、結合のために必要な最小の配列長さを決定するための検出ペプチドとして使用した。表20は、検出ペプチド及び、エピトープIについて実施例1で記載されたようにして決定された結合性比率を報告する。
【0193】
【表20】
【0194】
これらのデータから、エピトープIVへの完全な結合に12のアミノ酸がすべて必要であることは明らかであるが、1位及び2位におけるアミノ酸の貢献は主要ではない。
【0195】
エピトープI、II及びIIIに対する上記の方法に従って、エピトープIVにおける配列変異及び抗血清の免疫学的交叉反応性について以下のことを確かめた。この配列領域の444例がデータベースから入手された。最も一般的な変異は3位のThrがAsnであるものと6位のValがAlaであるものであった。
指定ペプチドに対する抗血清の、これら配列に対応する検出ペプチドに対する反応性を上記のように試験し、結合性比率に関する結果を以下の表21に報告した。
【0196】
【表21】
【0197】
従って、3位のアミノ酸がThrからAsnへ置換しても抗体結合性にほとんど影響しないが、6位のアミノ酸がValからAlaに置換することは、本質的に交叉反応性でない。この領域の配列が決定された444例のHIV−1Tatタンパク質では282/444(64%)が指定配列に似た配列を有していた。3位アミノ酸のThrとAsn間の変異を無視すると、199/444(45%)が6位アミノ酸にValを有し、83/444(19%)が6位アミノ酸としてAlaを有していた。Ala6ペプチドがVal6免疫原に対する抗血清との交叉反応性に乏しかったのに対し、Ala6ペプチドに対する抗血清は、Ala6ペプチドには力価26,000、Val6ペプチドには力価32,000をもたらし、完全な交叉反応性を示した。
【0198】
従って、アミノ酸配列−Ser−Gln−Thr−His−Gln−Ala−Ser−Leu−Ser−Lys−Gln−Pro−[SEQ ID NO:114]を含有するタンパク質で免疫化すると、HIV−1Tatタンパク質変異体の64%と反応する抗体を惹起する。
実施例7−本発明の合成遺伝子の構築
(本発明の4種の主要免疫原を包含する)8つのエピトープI変異体及び13のエピトープIII変異体をフレームで組込んだ合成遺伝子を構築した。これらは、上記の1996 HUMAN RETROVIRUSES and AIDS編集物に報告された31種のHIV−1Bサブタイプ株のTatタンパク質配列に見出されるエピトープI及びエピトープIII配列の全変異体を構成する。これらは、図1に示されるSEQ ID NO:1のナンバリングを使用する場合のエピトープIのアミノ酸4〜16及びエピトープIIIの53〜62を包含した。エピトープ配列はGly及び/又はSer残基を含有するジペプチドスペーサーによって分離されていた。
【0199】
本発明の1つの代表的な遺伝子の配列を図2A〜2C[SEQ ID NO:2及び3]に示す。遺伝子は、W.P.C.Stemmerら、Gene,164:49(1995)に記載されるようにして組み立てた。簡潔に言えば、20ヌクレオチド(nt)が重なった、11の上鎖60マーオリゴヌクレオチド(オリゴ)及び11の下鎖オリゴを、2つの末端50マーとともに合成した。この22の60マーをともにハイブリダイズ条件の下でインキュベートし、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して配列を埋め、それを増幅した。次いで末端50マーを加え、PCRによって組立てを完了し、アガロースゲルで完全長の遺伝しを単離した。
【0200】
この遺伝子の配列を決定し、136位でAlaがThrに置換されていることを除けば、実際のエピトープ内の正しい配列を有することを見出した(図2A〜2C参照)。この変化はエピトープIIIの抗体結合性に影響しないので、このことは許容された(実施例4参照)。
【0201】
次にこの遺伝子を制限酵素で切断し、グリーン蛍光タンパク質(GFP)[A.Crameriら、Nature Biotech,14:315(1996)]の配列をフレームで含有する発現ベクターpBAD[L−M.Guzmanら、J.Bacteriol,177:4121(1950)]の中へ挿入した。TG1・E.coliをトランスフェクトして、グリーン蛍光のコロニーを単離した。
【0202】
単離されたコロニーを生育させ発現を誘導した。3つのコロニーのそれぞれに由来するタンパク質は、ウエスタンブロットで、予想された分子サイズ(即ち、GFP単独の2倍)の蛍光バンドを有していた。得られたタンパク質は可溶性で、この配列に取込まれていたヘキサ−ヒスチジルを利用するニッケルカラムアフィニティー精製によって精製された。
【0203】
収量は上澄液1リットルあたりタンパク質約1mgで、2回のアフィニティー精製後90%以上の純度を得た。
実施例8−組換え融合タンパク質を発現するHIV−1Tatタンパク質エピトープ変異体の免疫学的特徴付け
A.エピトープI及び2種の変異体に対するウサギ抗血清に対する融合タンパク質の反応性
4つの主要エピトープI配列及び4つのエピトープIII配列(以下を参照のこと)に対応する合成ペプチドに対して産生されたウサギ抗血清を、実施例1及び4に記載された方法を使用してELISAによって試験した。ただし、プレートは最初から融合タンパク質に対する抗血清の100μg/ml溶液で直接被覆した。
【0204】
【表22】
【0205】
上記のデータは、直線状の組換え融合タンパク質として発現される変異体のエピトープ配列が対応する合成ペプチドに対する抗体によって認識されるコンホメーションで発現されていることを示す。
【0206】
B.融合タンパク質を用いたマウスの免疫化
マウス3匹に、実施例7の融合タンパク質を等量のフロイント完全アジュバントで乳化した水性溶液の各10μg相当量を腹腔内投与して免疫化した。2週間後、フロイント不完全アジュバントを使用して、同様に追加免疫した。3週間後に血清を採取した。
【0207】
C.融合タンパク質に組込まれたエピトープ変異体に対応する合成ペプチドに関しての、融合タンパク質に対する抗血清のELISA試験
抗体結合を検出するのに西洋ワサビペルオキシダーゼが結合した抗マウス免疫グロブリンを使用した他は、実施例1に記載されたようにしてELISA試験を実施した。この試験結果を以下の表23にまとめる。これらのデータは、エピトープI及びエピトープIIIの配列がいずれも直線状の融合タンパク質において発現し、合成ペプチド(上記参照)に対する抗体と反応することを示す。エピトープIに対する抗体が、マウスを用いたこの実験条件下で、組換え融合タンパク質によって検出可能なほどに誘導された。この直線状ペプチド内で発現されるエピトープIIIの失敗は、免疫原のC末端を延長すると得られる抗体の力価を低下させる(実施例4を参照)という合成ペプチドに関する知見に一致している。
【0208】
【表23】
【0209】
実施例9−霊長類の動物試験
幼若の雄アカゲザル10匹を使用して、本発明の合成ペプチドよって誘導されるTatタンパク質に対する抗体が免疫不全ウイルスによる感染の前に存在していれば、感染を弱めて血漿ウイルスレベルを低下させるかを確かめる研究を実施した。HIV−1はサルに感染しないが、対応するサル免疫不全ウイルス(SIV)は感染する。P.A.Luciwら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:7490(1995)は、サルに実際感染し、典型的には2週目にピークを迎えてその後8週目までには減退する急性ウイルス血症を引き起こす、SIVmac239及びHIV−1SF33の感染性組換えウイルス(キメラ)を構築した。SHIVSF33と命名されたこのキメラ構築体では、SIVmac239のtat、rev及びenv(gp160)をコードするSIVヌクレオチドがHIV−1SF33の対応する領域で置換された。
【0210】
A.サルの免疫化
上記のサルを2群に無作為化した。
【0211】
第1群(対照群)のサルそれぞれをジフテリアトキソイド(Commonwealth Scrum Laboratories,ビクトリア、オーストラリア)0.4mg、及びMF75アジュバント(Chiron Corp,エメリビル、CA)0.5mlで乳化した水0.5mlに溶けたスレオニルムラミルジペプチド(T−MDP)0.25mgで免疫化した。
【0212】
第2群(試験群)のサルそれぞれを、ジフテリアトキソイド0.4mgが結合した合成ペプチドCys−Val−Asp−Pro−Asn−Leu−Glu−Pro−Trp−His−Pro−Gly−Ser−アミド[SEQ ID NO:84]0.1mgで免疫化した[A.C.Leeら、Mol.Immunol.,17:749(1980)]。この結合体をT−MDP0.25mgを含有する水0.5mlに溶かし、MF75アジュバント0.5mlで乳化した。
【0213】
0日目及び28日(4週)目に、2つの異なる部位へ2回0.5ml筋肉内注射をしてそれぞれのサルを免疫化した。合成ペプチド免疫原は、サルへのチャレンジに使用されたSHIVSF33分子クローンのなかに組込まれているSF33HIV−1のTatタンパク質のB細胞エピトープI、Val−Asp−Pro−Asn−Leu−Glu−Pro−Trp−Lys−His−Pro−Gly−Ser−[SEQ ID NO:115]を含有していた(上記参照)。
【0214】
B.Tatタンパク質に対する抗体の試験
42日(6週)目、追加免疫の注射後2週目に、血清を採取し、上記実施例1に記載したようにして、ELISAによってSer−Gly−Ser−Gly−Val−Asp−Pro−Asn−Leu−Glu−Pro−Trp−Lys−His−Pro−Gly−Ser−OH[SEQ ID NO:85]に対する結合性を試験した。
【0215】
以下の表24に示されるように、対照群のサルが25〜44のバックグラウンド力価を有していたのに対し、試験群は1788〜9588の力価を有していた。
【0216】
【表24】
【0217】
C.ウイルスのチャレンジ
最初の免疫化後49日(7週)目、全部のサルへ動物滴定用SHIVSF33ストックの1/1000希釈液を1ml静脈内投与した(チャレンジ0日目)。これは50匹の動物の感染量50%(50AID50)、又は200の組織培養の感染量50%(200TCID50)に相当する。
【0218】
D.感染の評価
2、4及び8週目に血漿をEDTAと採取し、血漿1mlあたりのウイルスRNAコピーを、SHIVSF33のSIV成分に対するSIVプローブを使用して、QR−RT−PCRにより測定した[A.J.Conradら、J.Acq.Imm.Def.Syndrome and Hum.Retrovirol.,10:425(1995)]。この試験結果を以下のように表25及び26にまとめる。
【0219】
【表25】
【0220】
【表26】
【0221】
予期されたように、SHIVSF33は、ウイルスRNAのピークレベルが2週目にあり、8週までにはほとんどないか又は検出されないレベルになる、急性感染を引き起こした。チャレンジするSHIVSF33ウイルスのTatタンパク質に対する抗体を誘導する合成ペプチド結合体で免疫化されたサルは、対照の免疫化サルに比較して、ウイルスチャレンジ後2週目の血漿ピークウイルスレベルが71%減少し、血漿ウイルスレベルが減衰して依然検出される4週目では43%阻害した。このことは、SHIVのin vivo増殖が、ウイルスによって利用されるTatタンパク質に対する抗体の存在で阻害されたことを示し、同様の効果がHIV感染者にも有効であることを示唆する。
【0222】
E.血清変換の評価
HIVに感染した被検者はビリオン表面タンパク質に対する抗体を産生し、これがELISAにより検出されて感染を診断するために使用される。ウイルスチャレンジの前及びチャレンジ後8週目に、HIVAB HIV−1/HIV−2(rDNA)EIA(Abbott Labs,IL)を使用して、サルの血清を試験した。チャレンジ前の血清はすべて陰性であったが、チャレンジ後8週目の血清はすべて陽性であった。これらの知見は、Tatタンパク質に対する抗体がHIV血清変換の診断アッセイに向いていないという事実のさらなる裏づけを提供する。
実施例10−霊長類の動物試験
ジフテリアトキソイドに結合した合成ペプチドでの免疫化(サル9匹)又はジフテリアトキソイドで免疫化した対照(サル5匹)を使用して、さらにサルの試験をした。最初の免疫化はフロイント完全アジュバントで、3、6及び9週目の追加免疫は不完全フロイントアジュバントで実施した。免疫化ペプチドは、Cys−Val−Asp−Pro−Asn−Leu−Glu−Pro−Trp−Lys−His−Pro−Gly−Ser−アミド[SEQ ID NO:116](エピトープI)及びCys−Arg−Gln−Arg−Arg−Arg−Ala−Pro−Asp−Ser−Ser−Gln−Asn−His−Gln−OH[SEQ ID NO:117](エピトープIII)であった。
【0223】
上記のように、免疫原で最後の追加免疫をして2週後に、SHIV33の50AID50でサルをチャレンジした。免疫化した動物における11週(チャレンジの時間)目の幾何平均力価はエピトープIに対しては46,000であり、エピトープIIIに対しては5,000であった。
【0224】
ピーク時(2週目)の幾何平均血漿ウイルス負荷量は、試験群が456,000で、対照群が234,000であった。しかしながら、チャレンジ後4週以後、試験群のウイルス負荷量は対照群のそれより著しく低下した(表27)。
【0225】
【表27】
【0226】
SIV陽性への血清変換は4〜8週目に起こった。従って、血清変換後のウイルス負荷量(HIV−1感染の最も重要な予後マーカー)が、HIV−1Tatタンパク質に対する抗体の存在下で有意に低下したことになる。試験群における2週目のウイルス負荷量の高ピークを理解するために、ウイルスチャレンジの時点(最終免疫化から2週目)でELISAによりTNFαを試験した。免疫応答の間に放出されるTNFαは、細胞を活性化してTat介在性の活性化がHIV−1増殖を支えるための必要条件を無用にすることが知られている。発明者は、血清TNFαが免疫化前は検出されないのに対し、免疫化して2週目にはTatを免疫化したサルすべてにそれが平均レベル7pg/mlで検出されることを確認した。
【0227】
急性感染に対するTat阻止の効果が、免疫化に伴うTNFの活性化によって隠されたためであると結論された。これが減退するやTat免疫化群は有意に低いウイルス負荷量になり、その大部分が検出不能な血漿レベル(<100コピー/ml)になったのである。
実施例11−予防接種によって誘導される抗体の力価及び特異性を検出するための方法及びキット
本発明のワクチンでの免疫化後に誘導される抗体の力価及び特異性を追跡するために、アッセイ法が利用され得る。そのようなアッセイ法の1つの態様では、予防接種された被検者の抗体の力価及び反応性パターンを測定するキットを創出するために、表28に報告された配列を含有するペプチドが(免疫化ワクチンの組成物に応じて)使用される。
【0228】
【表28】
【0229】
これらのペプチドはN末端にビオチン−Ser−Gly−Ser−Gly−[SEQ ID NO:123」を付けて合成される。各ペプチドは別々のアビジン被覆プレート上で被覆され、−Ser−Gly−Ser−Gly−[SEQ ID NO:30]という配列は、関連するペプチド配列がアビジンのビオチン結合ポケットの外側になることを保証するスペーサーとして役立つ。次いでプレートを試験血清の希釈液とともにインキュベートして、洗浄し、抗体の結合をヒト免疫グロブリンに対する試薬(例えばビオチンに結合したウサギ抗ヒト免疫グロブリン)又は酵素で直接標識された試薬を用いて確認する。ビオチンラベルを検出するにはアビジン−酵素複合体を使用するか、又は酵素と反応して比色シグナルを発するのに利用される試薬(R&Dキットインサート)が使用される。
本発明の多くの変更及び変形は、上記の明細書に包含され、当業者に自明であることが予測される。本発明の組成物及び方法に対するそのような変更及び変形は本発明の特許請求の範囲内に包含されると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 共通Bサブタイプ[NIHロスアラモスデータベース]に見出される31の既知HIV−1株のTatタンパク質配列に基づいた、HIV−1Tatタンパク質のコンセンサス配列[SEQ ID NO:1]を図示する。変異が出現するアミノ酸の位置は小文字になっている。
【図2A〜2C】 以下の実施例5で詳細に記載される、本発明の融合タンパク質[SEQ ID NO:3]をコードする合成遺伝子を図示する。
【配列表】
Claims (35)
- 以下の式:
R1−Val−Asp−Pro−Y−Leu−Glu−Pro−R2 配列番号36のペプチド又はポリペプチドの少なくとも2つの変異体であって、
式中、それぞれの変異体がYに異なるアミノ酸残基を有し、
YがArg、Lys、Ser及びAsnからなる群から選択され、
R1が不在であるか、又は、1〜5の追加のアミノ酸配列であり、
R2が不在であるか、又は、1〜14の追加のアミノ酸配列である、
前記少なくとも2つの変異体を含む免疫原性組成物。 - R1が、−X−Pro−であり、XがGlu及びAspからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- R2が、−Trp−Lys−His−Pro−Gly−Ser− 配列番号10である、請求項1に記載の組成物。
- R1−Gly−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−R2 配列番号11;
R1−Ala−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−R2 配列番号12;
R1−His−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−R2 配列番号13;
R1−Asp−Pro−Gly−Leu−Glu−Pro−R2 配列番号14;
R1−Asp−Pro−Arg−Ile−Glu−Pro−R2 配列番号15;
R1−Asp−Pro−Arg−Leu−Gly−Pro−R2 配列番号16;
R1−Asp−Pro−Arg−Leu−Glu−Ala−R2 配列番号17;及び
R1−Asn−Pro−Ser−Leu−Glu−Pro−R2 配列番号18からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列をさらに含む、請求項1に記載の組成物。 - R1−Val−Asp−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−R2 配列番号6;
R1−Val−Asp−Pro−Lys−Leu−Glu−Pro−R2 配列番号7;
R1−Val−Asp−Pro−Ser−Leu−Glu−Pro−R2 配列番号8;及び
R1−Val−Asp−Pro−Asn−Leu−Glu−Pro−R2 配列番号9からなる群から選択される、3つ又は4つの前記変異体を含む、請求項1に記載の組成物。 - 以下の式:
R3−Lys−X−Leu−Gly−Ile−Ser−Tyr−Gly−Arg−Lys−Lys 配列番号37(式中、XはGly又はAlaからなる群から選択され;R3は不在であるか又は1〜5の追加のアミノ酸の配列である)
のペプチド又はポリペプチドをさらに含む、請求項1に記載の組成物。 - XがGlyである、請求項6に記載の組成物。
- XがAlaである、請求項6に記載の組成物。
- R3が不在である、請求項6に記載の組成物。
- 前記ペプチド又はポリペプチドが合成的に製造される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ペプチド又はポリペプチドが組換え的に製造される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ペプチドのそれぞれがアミノ末端のアミノ酸上で低級アルキル又は低級アルカノイルによって化学的に修飾される、請求項10に記載の組成物。
- 前記ペプチドのそれぞれのカルボキシ末端アミノ酸がアミドで修飾される、請求項10に記載の組成物。
- 前記ペプチドの1つ以上が担体タンパク質に結合した合成ペプチドとして発現される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ペプチドの1つ以上が、多重抗原性ペプチドとして発現される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ペプチドが担体タンパク質に結合している、請求項15に記載の組成物。
- 選択されるペプチドが、組換え的に製造されるタンパク質内又は融合タンパク質内に発現される、請求項1に記載の組成物。
- 選択された各ペプチドがスペーサーで分離されている、請求項15又は16に記載の組成物。
- 前記組換えタンパク質又は融合タンパク質が担体タンパク質に結合している、請求項17又は18に記載の組成物。
- 前記担体タンパク質がE.coliのDnaKタンパク質、GSTタンパク質、ミコバクテリアの熱ショックタンパク質70、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、ガラクトキナーゼ、ユビキチン、α−交配因子、β−ガラクトシダーゼ及びインフルエンザNS−1タンパク質からなる群から選択される、請求項14、16又は19のいずれか1項に記載の組成物。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物の前記変異体、ペプチド又はポリペプチドをコードする核酸を含む、組成物。
- 前記ペプチド又はポリペプチドをコードする前記核酸の配列が、宿主細胞においてその産物の発現を指令及び制御する調節的な核酸配列と作動可能に連結された、請求項21に記載の組成物。
- プラスミドである、請求項21に記載の組成物。
- 前記核酸の配列の多重コピーを宿主細胞内で発現し得る組換えウイルスであって、前記ウイルスがヒトに対して非病原性である、請求項21に記載の組成物。
- DNAワクチンである、請求項21に記載の組成物。
- 単離された複数の抗体を含む抗体組成物であって、各抗体が請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物の変異体、ペプチド又はポリペプチドに向けられており、ここで前記抗体組成物が多数のHIV−1株及びサブタイプ由来のHIV−1 Tatタンパク質と結合し得る抗体を含む、前記抗体組成物。
- 多重抗体を含み、各抗体が請求項5の組成物のペプチド及びポリペプチドの異なる変異体に結合する、請求項26に記載の抗体組成物。
- 請求項6の組成物のペプチド又はポリペプチドに結合し得る抗体を少なくとも1つ含む、請求項26に記載の抗体組成物。
- 各前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ハイブリドーマ若しくはコンビナトリアルライブラリー又は抗体ファージディスプレイをスクリーニングすることによって創出される抗体、及びそれらの混合物からなる群から独立して選択される、請求項26に記載の抗体組成物。
- 請求項1〜25のいずれか1項に記載の組成物を製剤的に許容される担体中に含む、多数の株及びサブタイプのHIV−1 Tatタンパク質と反応する抗体の誘導に有用な医薬組成物。
- さらにアジュバントを含む、請求項30に記載の医薬組成物。
- 請求項21〜25のいずれか1項に記載の組成物で感染又はトランスフェクトされた培養された哺乳類の宿主細胞。
- (a)請求項21〜25のいずれか1項に記載の組成物でin vitroで感染又はトランスフェクトされた宿主細胞を培養すること、及び
(b)前記培養物から、請求項1〜9のいずれか1項中に定義したペプチド又はポリペプチドを単離すること、
を含む、ペプチド又はポリペプチドを製造するための方法。 - HIV−1の多数の共通Bサブタイプ及び非Bサブタイプに由来するHIV−1 Tatタンパク質に結合するHIV−1 Tatタンパク質抗体を患者において能動的に誘導するための医薬の製造における、請求項1〜25のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- HIV−1感染への有効又は迅速な免疫応答を展開することができない患者における受動免疫治療に用いられる、請求項26〜29のいずれか1項に記載の組成物。
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---|---|---|---|---|
TW406454B (en) * | 1996-10-10 | 2000-09-21 | Berg Tech Inc | High density connector and method of manufacture |
US5891994A (en) * | 1997-07-11 | 1999-04-06 | Thymon L.L.C. | Methods and compositions for impairing multiplication of HIV-1 |
US20010008627A1 (en) * | 1999-01-22 | 2001-07-19 | Soll David R. | Hiv-encoded chemoattractant |
FR2792206B1 (fr) * | 1999-04-13 | 2006-08-04 | Centre Nat Rech Scient | Vaccin anti-vih-1 comprenant tout ou partie de la proteine tat de vih-1 |
AU4082300A (en) * | 1999-06-21 | 2001-01-09 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Hiv tat peptides and multiple peptide conjugate system |
US20050226890A1 (en) * | 1999-08-12 | 2005-10-13 | Cohen David I | Tat-based vaccine compositions and methods of making and using same |
US6399067B1 (en) * | 2000-04-28 | 2002-06-04 | Thymon L.L.C. | Methods and compositions for impairing multiplication of HIV-1 |
US20080044435A1 (en) * | 2004-03-16 | 2008-02-21 | Cohen David I | Tat-Based Tolerogen Compositions and Methods of Making and Using Same |
NO314587B1 (no) * | 2000-09-04 | 2003-04-14 | Bionor Immuno As | HIV regulatoriske- og hjelpepeptider, antigener, vaksinepreparater, immunoassay testsett og en metode for påvisning av antistoffer fremkaltav HIV |
FR2814958B1 (fr) * | 2000-10-06 | 2003-03-07 | Aventis Pasteur | Composition vaccinale |
AU2002331599A1 (en) * | 2001-08-16 | 2003-03-03 | The General Hospital Corporation | Epitopes of human immunodeficiency virus-1 |
BR0214350A (pt) | 2001-11-21 | 2005-05-10 | Univ Pennsylvania | Sequências de ácido nucleico e aminoácido de adenovìrus de sìmio, vetores contendo as mesmas e métodos de uso |
EP1944043A1 (en) | 2001-11-21 | 2008-07-16 | The Trustees of the University of Pennsylvania | Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use |
AU2003241103A1 (en) * | 2002-04-23 | 2003-11-10 | Umberto Dianzani | Compositions containing anti-hiv peptides and methods of use |
US20060104988A1 (en) * | 2002-12-18 | 2006-05-18 | Pauza C D | Vaccines against hiv-1 tat protein to generate neutralizing antibodies |
US7482016B2 (en) * | 2003-03-19 | 2009-01-27 | The J. David Gladstone Institutes | Immunogenic compositions comprising HIV-1 acetylated Tat polypeptides |
WO2005062871A2 (en) * | 2003-12-19 | 2005-07-14 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Tat linear epitope peptides and conjugates thereof for use in therapeutic compositions and assays |
US20060205070A1 (en) * | 2004-01-13 | 2006-09-14 | The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | HIV TEV compositions and methods of use |
WO2005087793A2 (en) | 2004-02-05 | 2005-09-22 | The Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Acting On Behalf Of Arizona State University | Immunostimulatory compositions and uses thereof |
US20050208482A1 (en) * | 2004-03-16 | 2005-09-22 | Cohen David I | Tat-based immunomodulatory compositions and methods for their discovery and use |
FR2868318B1 (fr) * | 2004-04-01 | 2012-11-16 | Commissariat Energie Atomique | Antigene tat stabilise et ses applications pour la vaccination anti-vih |
WO2006063028A2 (en) * | 2004-12-07 | 2006-06-15 | The Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Acting On Behalf Of Arizona State University | Immunostimulatory compositions and uses thereof |
WO2006088740A2 (en) * | 2005-02-15 | 2006-08-24 | Thymon, L.L.C. | Methods and compositions for impairing multiplication of hiv-1 |
WO2006088739A1 (en) * | 2005-02-15 | 2006-08-24 | Thymon, L.L.C. | Assays for detecting the tat protein in hiv-1 infection |
WO2006089678A2 (en) * | 2005-02-22 | 2006-08-31 | Bioinvent International Ab | Antibodies and peptides binding to hiv tat, and uses thereof |
US7943140B2 (en) * | 2006-08-14 | 2011-05-17 | Thymon, Llc | Compositions and methods for the treatment and prophylaxis of multiple strains and subtypes of HIV-1 |
US7838497B2 (en) * | 2006-12-13 | 2010-11-23 | Susavion Biosciences, Inc. | Pro-angiogenic peptides |
USRE46425E1 (en) | 2006-12-13 | 2017-06-06 | Susavion Biosciences, Inc. | Pro-angiogenic peptides and uses thereof |
US8496942B2 (en) * | 2006-12-13 | 2013-07-30 | Susavion Biosciences, Inc. | Therapeutic peptides and uses thereof |
US7811995B2 (en) * | 2006-12-13 | 2010-10-12 | Susavion Biosciences, Inc. | Therapeutic and diagnostic peptides |
US8460697B2 (en) * | 2006-12-13 | 2013-06-11 | Susavion Biosciences, Inc. | Pro-angiogenic peptides and uses thereof |
US20110027315A1 (en) * | 2007-09-07 | 2011-02-03 | Allen Harmsen | Protein cages and their uses |
ES2607029T3 (es) | 2007-11-28 | 2017-03-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adenovirus que comprende una proteína hexónica de la cápside del adenovirus E de simio SAdV-39 y usos de la misma |
EP2220217A2 (en) | 2007-11-28 | 2010-08-25 | The Trustees of the University of Pennsylvania | Simian subfamily c adenoviruses sadv-40, -31, and-34 and uses thereof |
US8470310B2 (en) | 2008-03-04 | 2013-06-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Simian adenoviruses SAdV-36, -42.1, -42.2, and -44 and uses thereof |
EP2774985B1 (en) | 2008-10-31 | 2016-12-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Simian adenovirus SAdV-43 and uses thereof |
BRPI1009215B1 (pt) | 2009-03-23 | 2019-10-29 | Nanirx Inc | composição farmacêutica compreendendo uma sequência de aminoácidos modificada da proteína trans-ativadora de transcrição (tat) do vírus da imunodeficiência humana (hiv) e uso de um polipeptídeo derivado de tat para tratar câncer |
EP2435559A1 (en) | 2009-05-29 | 2012-04-04 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Simian adenovirus 41 and uses thereof |
US20100322943A1 (en) | 2009-06-17 | 2010-12-23 | Thomas Cantor | Therapeutic and diagnostic affinity purified specific polyclonal antibodies |
EP2550362B1 (en) | 2010-03-25 | 2017-01-04 | Oregon Health&Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
WO2012071318A2 (en) | 2010-11-23 | 2012-05-31 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Subfamily e simian adenoviruses a1321, a1325, a1295, a1309, a1316 and a1322 and uses thereof |
CA2832109C (en) | 2011-06-10 | 2021-07-06 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
AU2012216792A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-28 | International Aids Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing HIV-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
US9402894B2 (en) | 2011-10-27 | 2016-08-02 | International Aids Vaccine Initiative | Viral particles derived from an enveloped virus |
WO2013173702A2 (en) | 2012-05-18 | 2013-11-21 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Subfamily e simian adenoviruses a1302, a1320, a1331 and a1337 and uses thereof |
EP2679596B1 (en) | 2012-06-27 | 2017-04-12 | International Aids Vaccine Initiative | HIV-1 env glycoprotein variant |
NZ708836A (en) * | 2012-12-06 | 2020-07-31 | Pin Pharma Inc | Treatment of inflammation, autoimmune, and neurodegenerative disorders with immunosuppressive tat derivative polypeptides |
US20150065381A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-05 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel hiv-1 immunogens |
US9663556B2 (en) | 2013-10-04 | 2017-05-30 | Pin Pharma, Inc. | Treatment of cancers with immunostimulatory HIV tat derivative polypeptides |
EP2873423B1 (en) | 2013-10-07 | 2017-05-31 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
CN106470736B (zh) | 2014-05-13 | 2021-05-28 | 宾夕法尼亚州大学信托人 | 包括表达双抗体构建体的aav的组合物及其用途 |
EP3069730A3 (en) | 2015-03-20 | 2017-03-15 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
EP3072901A1 (en) | 2015-03-23 | 2016-09-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
US20240226324A1 (en) | 2021-04-27 | 2024-07-11 | Generation Bio Co. | Non-viral dna vectors expressing therapeutic antibodies and uses thereof |
WO2023177655A1 (en) | 2022-03-14 | 2023-09-21 | Generation Bio Co. | Heterologous prime boost vaccine compositions and methods of use |
Family Cites Families (53)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4405712A (en) * | 1981-07-01 | 1983-09-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | LTR-Vectors |
US4531167A (en) * | 1983-08-25 | 1985-07-23 | Pioneer Research, Inc. | Servowriter system for magnetic disc drives |
US4738922A (en) * | 1984-05-25 | 1988-04-19 | Dana Farber Cancer Institute | Trans-acting transcriptional factors |
US6610476B1 (en) * | 1984-08-22 | 2003-08-26 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Detection of HIV-1 DNA |
US4871488A (en) * | 1985-04-22 | 1989-10-03 | Albany Medical College Of Union University | Reconstituting viral glycoproteins into large phospholipid vesicles |
US5801056A (en) * | 1985-05-24 | 1998-09-01 | Dana-Farber Cancer Institute | Nucleic acid encoding HIV-1 tat protein |
US4735896A (en) * | 1986-03-04 | 1988-04-05 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptide and process of using same for the detection and diagnosis of AIDS and pre-AIDS conditions |
PT83682B (en) * | 1985-11-06 | 1988-12-05 | Smithkline Beckman Corp | Process for the expression of an aids virus gene |
CS256960B1 (en) * | 1985-11-16 | 1988-04-15 | Viktor Krchnak | Peptides with properties of antigenic determinants and method of their production |
US4812929A (en) * | 1985-11-19 | 1989-03-14 | Rodime Plc | Head positioning mechanism for rotating disk data storage system |
US4839288A (en) * | 1986-01-22 | 1989-06-13 | Institut Pasteur | Retrovirus capable of causing AIDS, antigens obtained from this retrovirus and corresponding antibodies and their application for diagnostic purposes |
US5306614A (en) * | 1986-01-22 | 1994-04-26 | Institut Pasteur | Methods and kits for diagnosing human immunodeficiency virus type 2(HIV-2) |
US4983387A (en) * | 1986-05-19 | 1991-01-08 | Viral Technologies Inc. | HIV related peptides, immunogenic antigens, and use therefor as subunit vaccine for AIDS virus |
US5030714A (en) * | 1986-06-23 | 1991-07-09 | Institut Pasteur | Variant of LAV viruses |
US5166050A (en) * | 1986-08-20 | 1992-11-24 | Bristol-Myers Squibb Company | Monoclonal antibodies and peptides useful in treating and diagnosing HIV infections |
US5476765A (en) * | 1987-01-09 | 1995-12-19 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptide compositions with immunoreactivities to antibodies to HTLV and as vaccines |
US5026635A (en) * | 1987-05-19 | 1991-06-25 | Du Pont Merck Pharmaceutical | Stable human cell lines expressing an indicator gene product under virus-specific genetic controls |
US5110802A (en) * | 1987-07-14 | 1992-05-05 | City Of Hope | Oligonucleotide phosphonates and method of inhibiting a human immunodeficiency virus in vitro utilizing said oligonucleotide phosphonates |
US5019510A (en) * | 1987-10-28 | 1991-05-28 | Institut Pasteur | Isolation, molecular cloning and sequencing of an HIV-1 isolate from a Gabonese donor |
US4888290A (en) * | 1987-11-06 | 1989-12-19 | Coulter Corporation | Monoclonal antibody specific to HIV antigens |
US5831034A (en) * | 1987-11-13 | 1998-11-03 | Hermann Katinger | Human monoclonal anti-HIV-I-antibodies |
US5606026A (en) * | 1988-03-25 | 1997-02-25 | The Institute For Human Genetics And Biochemistry | Natural human IgM antibodies immunoreactive with the Tat protein of HIV-1 |
GB8808892D0 (en) * | 1988-04-15 | 1988-05-18 | British Bio Technology | Gene synthesis |
US5043262A (en) * | 1988-05-12 | 1991-08-27 | Dana Farber Cancer Institute | Protein, sequences containing the VPU gene therefore, vectors, methods of preparation and use |
DE3934366A1 (de) * | 1989-10-14 | 1991-04-18 | Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus | Vakzine zum schutz vor hiv-virusinfektionen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als diagnostikum und immuntherapeutikum |
US5674980A (en) * | 1989-12-21 | 1997-10-07 | Biogen Inc | Fusion protein comprising tat-derived transport moiety |
WO1991009958A2 (en) * | 1989-12-21 | 1991-07-11 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Method of delivering molecules into eukaryotic cells |
US5804604A (en) * | 1989-12-21 | 1998-09-08 | Biogen, Inc. | Tat-derived transport polypeptides and fusion proteins |
KR0148782B1 (ko) * | 1990-01-18 | 1998-08-17 | 더글라스 제이. 캠피온 | 유전자 발현에 영향을 주는 다수의 표적반응요소를 가진 벡터 |
GB9003010D0 (en) * | 1990-02-09 | 1990-04-04 | Glaxo Group Ltd | Gene expression in yeast cells |
US5527894A (en) * | 1990-06-11 | 1996-06-18 | Nexstar Pharmacueticals, Inc. | Ligands of HIV-1 tat protein |
GB9016973D0 (en) * | 1990-08-02 | 1990-09-19 | Medical Res Council | Viral growth inhibition |
DE69123754T2 (de) * | 1990-10-24 | 1997-04-03 | Allelix Biopharma | Peptidische hemmer der hiv-replikation |
US5646120A (en) * | 1990-10-24 | 1997-07-08 | Allelix Biopharmaceuticals, Inc. | Peptide-based inhibitors of HIV replication |
EP0571549A4 (en) * | 1991-02-14 | 1995-03-15 | Jolla Cancer Res Found | INNOVATIVE INTEGRIN SPECIFICITY FOR THE HIV-TAT PROTEIN. |
US5350835A (en) * | 1991-11-05 | 1994-09-27 | Board Of Regents, University Of Texas | Cellular nucleic acid binding protein and uses thereof in regulating gene expression and in the treatment of aids |
EP0570357B1 (en) * | 1992-05-14 | 1997-06-25 | Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH | Peptides that induce antibodies which neutralize genetically divergent HIV-1 isolates |
WO1993024632A1 (en) * | 1992-05-22 | 1993-12-09 | Dana Farber Cancer Institute | Hybrid siv/hiv-1 viral vectors and monkey model for aids |
WO1994015634A1 (en) * | 1992-12-30 | 1994-07-21 | Matthias Rath | Tat and rev oligopeptides in hiv treatment |
FR2700169B1 (fr) * | 1993-01-04 | 1995-03-24 | Transgene Sa | Nouveaux variants trans-dominants TAT du virus de l'immunodéficience humaine. |
DE4405810A1 (de) * | 1994-02-23 | 1995-08-24 | Behringwerke Ag | Von einem Retrovirus aus der HIV-Gruppe abgeleitete Peptide und deren Verwendung |
US5421412A (en) * | 1994-03-10 | 1995-06-06 | North Carolina State University | Methods and compositions for fracturing subterranean formations |
EP0767678A1 (en) * | 1994-05-23 | 1997-04-16 | Gideon Goldstein | Compositions of transactivating proteins of human immunodeficiency virus |
US5793559A (en) * | 1996-02-27 | 1998-08-11 | Quantum Corporation | In drive correction of servo pattern errors |
US5875064A (en) * | 1996-07-09 | 1999-02-23 | International Business Machines Corporation | Method and system for accurate self-servowriting with normalization in a disk drive |
SG52990A1 (en) * | 1996-07-09 | 1998-09-28 | Ibm | Improvements to radial self-propagation pattern generation for disk file servowriting |
US6024965A (en) * | 1996-10-18 | 2000-02-15 | Erasums University Rotterdam | Induction of REV and TAT specific cytotoxic T-cells for prevention and treatment of human immunodeficiency virus (HIV) infection |
US5891994A (en) * | 1997-07-11 | 1999-04-06 | Thymon L.L.C. | Methods and compositions for impairing multiplication of HIV-1 |
US6023145A (en) * | 1999-04-21 | 2000-02-08 | Guzik Technical Enterprises | Head and disk tester with a thermal drift-compensated closed-loop positioning system |
US6507450B1 (en) * | 1999-06-11 | 2003-01-14 | Western Digital Technologies, Inc. | Method of continuously recording servo bursts along one continuous, single helix spiral |
US6519107B1 (en) * | 1999-09-24 | 2003-02-11 | Maxtor Corporation | Hard disk drive having self-written servo burst patterns |
US6399067B1 (en) * | 2000-04-28 | 2002-06-04 | Thymon L.L.C. | Methods and compositions for impairing multiplication of HIV-1 |
WO2006088740A2 (en) * | 2005-02-15 | 2006-08-24 | Thymon, L.L.C. | Methods and compositions for impairing multiplication of hiv-1 |
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