NO870027L - Ekspresjon av htlv-iii gag-gen. - Google Patents

Description

Retrovlrus HGTLV-III og de nært beslektede varianter av dette virus, LAV og ARV, synes å være årsakene til sykdommen Erhvervet Immunsviktssyndrom (AIDS) [se Barré-Sinoussi et al., Science 225, 840-842 (1984); Montagnier et al., i Human TG-Cell Leukemia/Lymphoma Virus, R.C. Gallo, M. Essex og L. Gross, eds. (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory) s. 363-370 (1984); Popovic et al., Science 224. 497-500 (1984); Gallo et al., Science, 224 500-503 (1984); Schupbach et al., Science 224»503-505 (1984)].-Det er en sterk sammenheng mellom aids og tilstedeværelsen av antistoff til HTLV-III. Videre bærer 85--95$ av pasienter med lymfadenopati-syndrom og en signifikant del av asymptomatiske homoseksuelle men i AIDS endemiske områder sirkulerende antistoff til HTLV-III [se Schupbach et al., supra]. HTLV-III antistoffer har også i stort omfang blitt påvist i pasienter som var eksponert til denne sykdom gjennom intravenøse stoffinjeksjoner med kontaminerte nåler og i blødere som mottok intravenøse blodprodukter. Beregninger indikerer for tiden at ca. 1 million amerikanere er blitt smittet med dette virus, og ca. 10 $ av denne smittede populasjon ventes å erhverve denne dødelige sykdom.

Molekular kloning og nukleotid sekvensanalyse av HTLV-III og dens varianter har vist at dette virale genom oppviser mange av de strukturelle trekk til fugler og pattedyr retrovirus-[se Ratmer et al., Nature 313, 277-284 (1985); Sanchez-Pescador et al., Science 227, 484-492 (1985); Wain-Hobson, et al., Cell 40»9-17 (1985)]; og Muesing, M. et al., Nature 313.450-458 (1985)]. Således inneholder det virale genom de tre gener (gag, pol og env) karakteristiske for alle retrovirus. I tillegg inneholder HTLV-III genomet to korte åpne leserammer hvis funksjon er ukjent.

Effektiv bekjempelse av AIDS avhenger av utvikling av sensitive og raske metoder for å idenfisere personer eksponert til eller infisert med HTLV-III og terapeutiske midler som innvirker på den virale replikasjon. En av de virale gener kan kode for en prekursor som proteolytisk dannes til kjerneproteiner under virionutvikling. Fra DNA sekvens data og analyse av isolerte virale proteiner følger det at HTLV-III gag prekursor omfatter ca. 56 kd og utvikles til enheter på ca. 24, 16 og 14 kd (Råtner et al., supra; Sanchez-Pescador et al., supra; Wain-Hobson et al., supra; og Muesing et al., supra). Proteasen som er ansvarlig for denne utvikling kodes typisk av det retrovirale genom. Den er innbefattet i 3' enden av gag-genet i fugleretrovirus og i 5' enden av pol-genet i pattedyr virus [for en oversikt se Dickson et al., "Protein Biosynthesis and Assembly", i Molecular Biology of Tumor Virues, R. A. Weiss, N.M. Teich, H.E. Varmus og J.M. Coffin, utg. (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY) s. 513-648 (1982)]. I minst ett pattedyrretrovirus, Moloney murine leukemia virus (MuLV), er proteasen et gag-pol gjennomlesningsprodukt. Et terapeutisk middel som kunne hemme denne protease kunne blokkere virusspredningen. Det er derfor viktig å identifi-sere området av HTLV-III fenomet som koder for denne protease og å utvikle et in vitro system hvori proteolysen av gag-genprekursoren kan studeres.

HTLV-III genomer har blitt klonet molekylært. Shaw et al., Science 226, 1165-1171 (1984). Også den fullstendige nukleotid-sekvens til det provirale genom av HTLV-III er blitt bestemt [Råtner et al., supra; og Sanchez-Pescador, et al., supra].

Én grunn for vanskeligheten for bestemmelse av den etiologiske enhet for AIDS var på grunn av reaktiviteten av forskjellige retrovirale antigener med serumprøver fra AIDS-pasienter. F.eks. har serumprøver fra AIDS pasienter blitt vist å reagere med antigener av HTLV I og HTLV III (HTLV-I; Essex et al., "Antibodies to Cell Membrane Antigens Associ-ated with Human T-Cell Leukemia Virus in Patients with AIDS", Science 220, 859-862 (1983); HTLV-III: Sarngadharan et al., "Antibodies Reactive With Human T-Lumphotropic

Retrovirus (HTLV-III) in the Serum of Patients With AIDS", Science 224, 506-508 (1084)). Genprodukter av HTLV viste antigenisiteter som var kryssreaktive med antistoff i sera fra voksne TG-celle leukemipasienter [Kiyokawa, T. et al., "Envelope proteins of human TG-cell leukemia virus: Expression in Escherichia coli and its application to studies of env gene functions", PNAS (USA) 81»6202-6206 (1984)]. T-celle leukemi hos voksne (ATL) er forskjellig fra erhvervet immunsvikt-syndrom (AIDS) ved at HTLV-I forårsaker T-celle maligniteter, dvs. ukontrollerte vekst av T-celler. I AIDS er det i stedet for cellevekst celledød. Faktisk var dette cytopatiske særtrekk til THLV III kritisk for å bestemme endelig den spesifikke retrovirale opprinnelse til sykdommen. Således ble den etoiologiske enhet til AIDS isolert ved bruk av udødeliggjorte humane neoplastiske T-cellelinjer (HT) infisert med det cytopatiske retrovirus særpreget for AIDS, isolert fra AIDS-smittedepasienter. Seroepidemiologi-ske forsøk som brukte dette virus viste en fullstendig korrelasjon mellom AIDS og tilstedeværelsen av antistoffer til HTLV III antigener [Sarngadharan et al., supra ((1984); Schupbach et al., supra]. I tillegg ble nesten 85$ av pasienter med lymfadenopati-syndrom og en signifikant del av asymptomatiske homoseksuelle menn i AIDS endemiske områder også funnet å bære sirkulerende antistoff til HTLV III. Tatt sammen indikerer alle disse data at HTLV III er den etiologiske enhet for AIDS.

Inntil det lykkes å dyrke AIDS virus ved å bruke H-9 celle-linje hadde ikke gag AIDS proteiner av AIDS viruset blitt isolert,karakteriserteller syntetisert. Dette er for en stor del grunnet at viruset er cytopatisk og således var isolering av viruset ikke mulig [Popovic, M. et al., supra]. Da den humane AT-celle-1inje motstandsdyktig for de cytopatiske efekter av viruset ble oppdaget kunne en molekylær klon av det provirale DNA dannes.

Behovet for en sensitiv og rask metode for diagnose av AIDs i humant blod og dets forebyggelse ved vaksinasjon er meget stor. Nesten alle av assay/testene for tiden tilgjengelige er belastes med feilkilder. Faktis har Center for Desease Control (CDC) indikert at for tiden tilgjengelige tester skal brukes kun for å undersøke enheter av blod for antistoff til HTLV III. CDC gikk videre ved å hevde at for tiden tilgjengelige ELISA tester ikke kan brukes for generell undersøkelse av høyrisiko populasjoner eller som en diagnostisk test for AIDS [Feral Register 50(48), 9909, 12.mars 1985). Feilkildene har blitt funnet å være svikten i å bruke et spesifikt antigenprotein til den etiologiske enhet for AIDS. Tidligere brukte proteiner var avledet fra et viralt lysat. Siden lysatet lages fra humane celler infisert med viruset, dvs. celler brukt for å dyrke viruset, vil lysatet inneholde humane proteiner såvel som virale proteiner. Således er fremstilling av et rent antigen av viral protein meget vanskelig. Det brukte antigen dannet både falske positive og falske negative resultater [Budiansky, S.,AIDS Screening, False Test Results Raise Doubts, Nature 312,583(-1984). Feilene forårsaket ved bruket av slike lysatprotei-ner/peptider kan unngås ved å bruke en blanding for å binde AIDS antistoff som i hovedsak er fri for de ikke-AIDS spesifikke proteiner. Blandinger som er i hovedsak rene AIDS gag-proteiner kan anvendes som antigener.

I samsvar med oppfinnelsen er det nå dannet ved rekombinant teknologi den immunologisk aktive del av prekursoren av HTLV-III gag-protein såvel som den immunologisk aktive del av de naturlige proteolytlske prekursorproteiner som resulterer fra dette gag-protein (heretter også betegnet som polypeptider immunologisk ekvivalente til gag-proteinprodukter av HTLV-III). I tillegg er det dannet en rekombinant organisme som er i stand til å uttrykke disse proteiner/peptider ved å bruke forskjellige ekspresjonsvektorer som er i stand til å uttrykke alle disse proteiner. Ved rekombinant teknologi i henhold til denne oppfinnelse dannes prekursoren gag 56 kd proteinet med modifikasjoner som kommer fra fjerningen av N-terminale kodoner ved dets aminoterminal, men som har samme immunologiske aktivitet som det naturlige prekursor gag-protein. I betraktning av denne modifikasjon i prekursoren er det 14 kd gag-proteinet som proteolytisk dannes derfra også modifisert ved sin aminoterminal i forhold til det naturlige 14kd gag-protein. Imidlertid har dette modifiserte gag-protein også samme immunologiske aktivitet som sin naturlige form. Også i samsvar med denne oppfinnelse fremstilles et nytt p48 protein med samme immunologiske aktivitet til det naturlige prekursor gag-protein. 16 kd proteolytiske gag-proteiner dannet ved fremgangsmåten til denne oppfinnelse har en variasjon i sin aminosyrestruktur i forhold til de proteolytiske 16 kd gag-proteiner rapport i Shaw et al., supra. Det 24 kd proteolytiske protein er det samme som det naturlig forekommende 24 kd proteolytiske protein.

De 56 kd, 24,16 og 14 kd gag proteiner dannet ved foreliggende oppfinnelse har samme immunologiske aktivitet som deres tilsvarende naturlige gag-proteiner. De har samme epitoper som reagerer med samme antistoff som deres tilsvarende naturlige proteiner.

I henhold til foreliggende oppfinnelse anvendes rekombinante DNA teknikker f»or å danne HTLV-III gag-proteinet med 56 kd såvel som de proteolytiske proteiner fremstilt fra dette, dvs. proteinene med 24,16 ogl4 kd, henh.. I det første trinn av foreliggende oppfinnelse isolerer man fra det kjente genom for HTLV-III retroviruset en del som inneholder DNA sekvensen som koder for gag-proteinet til HTLV-III og denne del dannes til et gen som inneholder denne DNA sekvens som koder for gag-proteinet av HLTV-III som er operativt forbunnet med en promotor som er i stand til å fremskaffe ekspresjon av denne DNA sekvens og dette gen settes inn i en ekspresjonsvektor eller -plasmid og en slik vektor eller plasmid innsettes i en passende mikroorganisme, fortrinnsvis en gjærcelle, for å danne en mikroorganisme som er i stand til å uttrykke den aktive del av gag-proteinet av HTLV-III. I henhold til foreliggende oppfinnelse uttrykker den rekombinante organisme ikke bare et protein som er immunologisk ekvivalent til det naturlige prekursor gag-protein, men uttrykker også protein typene som utvikles ved proteolytiske enzymer uttrykt med prekursorproteinet.

Innbefattet i foreliggende oppfinnelse er også de aminosyre-substi tus j oner i sekvensen til 56, 48, 24,16 og 14 kd gag-proteinerne som dannes ved mutasjon av de rekombinante mikroorganismer ifølge oppfinnelsen. Disse aminosyresubsti-tusjoner i sekvensen av disse proteiner danner modifiserte proteiner som er immunologisk ekvivalente til proteinene fra hvilke de er modifisert. Disse aminosyresubstitusj oner er beskrevet i faget [H. Neurath og R.L. Hill "The Proteins", Academic Press, New York (1979)] spesielt i fig. 6 på side 14. De vanligste observerte aminosyresubstitusj oner er Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly og vice versa.

Et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse omhandler en diagnotisk metode for undersøkelse av humant blod for tilstedeværelse av antistoff til gag-proteinet og dets proteolytiske proteiner. Dette aspekt av oppfinnelsen overvinner problemene med tidligere brukte blodtester for AIDS. Ett av problemene ved in vitro påvisning av AIDS virus er å fremskaffe en blanding som ikke inneholder proteiner eller peptider som ikke er avledet direkte fra den etiologiske AIDS enhet. En blanding som bruker enten den aktive del av gag-proteinet eller dets forskjellige proteolytisk avledete proteiner overvinner ikke-spesifisiteten til de tidligere tester eller assays. Enda et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse er en diagnostisk metode for å påvise og/eller bestemme tilstedeværelsen av antigenet i humant blod.

Et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse er å bruke enten det rekombinante gag-protein eller dets proteolytisk avledete proteiner som antigener ved fremskaffelse av antistoff som er aktive i å påvise AIDS i prøver av

kroppsvæsker.

Også et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse er å bruke enten det rekombinante gag-protein eller dets proteolytisk avledete proteiner som en vaksine som er i stand til å gi beskyttende immunitet mot AIDS viruset. Tilføringsruter, antigendoser, antall og hyppighet av injeksjoner vil variere fra individ til individ og kan være parallelle med de som for tiden brukes til å fremskaffe immunitet ved andre virale infeksjoner. Vaksinene kan fremstilles i samsvar med kjente metoder. Vaksineblandingene vil passende være kombinert med fysiologisk akseptable bærematerialer. Vaksineblandingene kan inneholde hjelpestoffer eller andre økende midler for immunrespons. Videre kan vaksineblandingene omfatte andre antigener for å gi immunitet mot andre sykdommer i tillegg til AIDS.

Metodene for undersøkelse av humant blod for tilstedeværelse av AIDS virus eller antistoff mot AIDS virus kan utføres i passende test-sett omfattende i en beholder et rekombinant gag-protein eller dets proteolytisk avledete proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse eller antistoff mot AIDS virus avledet fra disse proteiner ifølge foreliggende oppf innelse.

Kort Beskrivelse av Tegningene

Fig. 1-A illustrerer restriksjonssetene i AhXB-3, en kjent genklon for HTLV_III viruset, med gag-regionen til dette gen ekspandert for å vise prekursoren (p 56) og dets naturlig proteolytisk dannete proteiner (p 24, p 16 og p 14) såvel som dets mutantprotein (p 48). Fig. 1-B illustrerer konstruskjonen av et gen inneholdende gag-genet for HTLV-III og en promotor for senere innsetning i et plasmid. Fig. 2 er en immunblot analyse av gjærlysater erholdt fra gjær dyrket med pYE72/gag 1. Kolonne 1 er resultatene tatt celler dyrket 1 høyfosfatmedium og kolonne 2 er resultatene fra celler dyrket i et fosfatfritt medium. De indikerte molekylvektmarkører indikerer størrelsene av de respektive bånd. Fig. 3 er et autoradiografi av en SDS gel ved forskjellige tider etter immunopresipiterte lysater dannet fra gjærceller inneholdende gag-plasmidet pYE72/gag 1 dyrket med<35>S-metionin. Kolonnene A til G i fig. 3 representerer forskjellige "chase" tider. Kolonne H representerer resultater fra lysater av gjærceller inneholdende pYE 72/gag 1 dyrket med<32>P04og så høstet etter 45 minutter, og kolonne I representerer lignende resultater som kolonne G bortsett fra at det innskutte plasmid ikke hadde noe gag-gen. Fig. 4 er en immunoblotanalyse av gjærlysater fremstilt ved forskjellige mutasjoner av gag-genet. Immunoblottene ble utviklet enten med kanin-antistoff mot ødelagt HTLV-III (del A i fig. 4) eller med AIDS pasientserum (del B i fig. 4). I delene A og B er kolonne 1 resultatet fra lysater fra celler indusert med pYE72/gag 1, mens kolonne 2 er resultatene fra lysatene fra celler indusert med pYE72/gag 2 og kolonne 3 er resultatene fra cellelysater indusert med pYE72/gag 3. Fig. 5 er DNA sekvensen av den del av XHXB-3 genet som viser gag/pol overlappingen. Den karboksy-terminalkodende region av gag og den amino-terminalkodende region av pol er vist. Regionen som er homolog til andre gag-1 proteaser [Toh et al., Nature 315. 691 (1985) er streket under. Leserammen til hvilken pol-genet er skiftet ved Bell innfyllingen er vist ved pilen. Dvs. "." i denne figuren indikerer et translasj onsavslutningssete. Fig. 6-A er en ammunoblot analyse som bruker antigen dannet fra gjærcellelysater indusert med pYE72/gag 1, hvor hver av kolonnene representerer blodprøver tatt fra forskjellige AIDS pasienter fra østkysten av USA. Fig. 6-B er den samme som fig. 6-A bortsett fra at pasien-tene ble tatt fra Vestkysten av De Forenete Stater. Fig. 7 er DNA sekvensen som koder for 56 kd gag-proteinpre-kursoren dannet i henhold til foreliggende oppfinnelse. Fig. 8 er aminosyresekvensen til 56 kd gag-proteinprekurso-ren dannet i samsvar med denne oppfinnelse. Fig. 9 er DNA sekvensen som koder for det proteolytiske 24 kd gag-protein dannet i henhold til foreliggende oppfinnelse . Fig. 10 er aminosyresekvensen til det 24 kd proteolytiske gag-protein dannet i henhold til foreliggende oppfinnelse. Fig. 11 er DNA sekvensen som koder for det proteolytiske 16 kd gag-protein dannet i henhold til foreliggende oppfinnelse . Fig. 12 er aminosyresekvensen til det 16 kd proteolytiske gag-protein dannet i henhold til foreliggende oppfinnelse. Fig. 13 er DNA sekvensen som koder for det 14 kd proteolytiske gag-protein dannet i henhold til foreliggende oppfinnelse . Fig. 14 er aminosyresekvensen for det 14 kd proteolytiske gag-protein dannet i henhold til foreliggende oppfinnelse. Fig. 15 er DNA sekvensen som koder for det 48 kd proteolytiske gag-protein dannet i henhold til foreliggende oppfinnelse . Fig. 16 er aminosyresekvensen til det 48 kd proteolytiske gag-protein dannet i henhold til foreliggende oppfinnelse.

I beskrivelsen er følgende betegnelser anvendt:

Nukleotid: En monomer enhet av DNA bestående av en sukker-forbindelse (pentose), et fosfat, og enten en purin- eller pyrimidinbase (nitrogenholdig heterocyklisk ring). Basen er bundet til sukkerenheten via det glykosidiske karbon (1' karbon av pentosen). Denne kombinasjon av en base og et sukker er kalt et nukleotid. Hvert nukleotid er særpreget ved sin base. De fire DNA baser er adenin ("A"), guanin ("G"), cytosin ("C") og tymin ("T").

DNA Sekvens: En liniær følge av nukleotider bundet til hverandre via fosfordiesterbindinger mellom 3' og 5' karbon-atomene av hosliggende pentoser.

Kodon: En DNA sekvens av tre nukleotider (en triplett) som via mRNA koder for en aminosyre, et translasjonsstartsignal eller et translasjonsstoppsignal. F.eks. koder nukleotide triplettene TTA, TTG, CTT, CTC, CTA og CTG for aminosyren leucin ("Leu"). TAG, TAA og TGA er translasjonsstoppsignaler og ATG er et translasjonsstartsignal.

Leseramme. Grupperingen av kodoner under translation av mRNA til aminosyresekvenser. Under translasjon må riktig leseramme opprettholdes. F.eks. kan sekvensen GCTGGTTGTAAG translateres i tre leserammer eller faser, hvor hver gir en forskjellig aminosyresekvens:

GCT GGT TGT AAG-- Ala-Gly-Cys-Lys

G CTG GTT GTA AG--Leu-Val-Val

GC TGG TTG TAA G--Trp-Leu-(STOP)

Polypeptid: En liniær følge av aminosyrer bundet til hverandre via peptidbindinger mellom a-amino og karboksy-gruppene av hosliggende aminosyrer.

Genom: Det totale DNA til en celle eller en virus. Dette innbefatter bl.a. de strukturelle gener som koder for polypeptidene for stoffet, såvel som operator, promotor og ribosombindingen og interaksjonssekvenser, innbefattende sekvenser såsom Shine-Dalgarno sekvenser.

Strukturelt gen. En DNA sekvens som via sitt templat eller messenger RNA ("mRNA") koder for en sekvens av aminosyrer som er karakteristiske for et spesielt polypeptid.

Transskrips. 1 on: Prosessen å danne mRNA fra et strukturelt gen.

Translas. 1 on: Prosessen å danne et polypeptid fra mRNA.

Ekspres. 1 on: Prosessen undergått av et strukturelt gen for å danne et polypeptid. Dette er en kombinasjon av transkrip-sjon og translasjon.

Plasmid: Et sirkulært dobbelt-kjedet DNA molekyl som ikke er en del av hovedkromosomet til en organisme som inneholder gener som overfører motstandsdyktighet for spesielle antibiotika. Når plasmidet plasseres inne i en en-cellet organisme kan særtrekkene til denne organisme forandres eller transformeres som et resultat av DNA til plasmidet. F.eks. transformerer et plasmid som bærer genet for tetracyklinresistens (Tet*) en celle som tidligere var sensitiv for tetracyklin til en celle som er motstandsdyktig for dette. En celle transformert med et plasmid kalles en "transformant". ;Kloningsenhet: Et plasmid, fag DNA eller andre DNA sekvenser som er i stand til å replisere i en vertscelle, og som er særpreget ved ett eller et lite antall endonukleasegjen-kj enningsseter ved hvilke slike DNA sekvenser kan spaltes på en bestemt måte uten følgende tap av en essensiell biologisk funksjon av DNA, såsom replikasjon, dannelse av kappeprotei-ner eller tap av promoter eller bindende seter, og som ;inneholder en markør passende for bruk ved identifikasjon av transformerte celler, f.eks. tetracyklinresistens eller am- ;picillinresistens. En kloningsenhet kalles ofte en vektor. ;Kloning: Prosessen å erholde en populasjon av organismer eller DNA sekvenser avledet fra én slik organisme eller sekvens ved aseksuell reproduksjon. ;Rekombinant DNA molekyl eller Hybrid DNA: Et molekyl omfattende segmenter DNA fra forskjellige genomer som er blitt spleiset ende mot ende utenfor levende celler og som har muligheten til å infisere enkelte vertsceller og opprettholdes deri. ;Nomenklaturen brukt for å definere peptidene eller proteinene er den brukt i samsvar med vanlig representasjon slik at aminogruppen ved N-terminalen ligger til venstre og karboksylgruppen til C-terminalen til høyre. Ved en naturlig aminosyre menes en vanlig naturlig forekommende aminosyre funnet i proteiner og som omfatter Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp og His. Hvor aminosyreresidiet har isomer form er det L-formen til aminosyren som er representert med mindre noe annet er uttrykkelig indikert. I tillegg har aminosyrer blitt betegnet ved spesifikke bokstaver i alfabetet slik at: A=alanin; D=aspartinsyre; N=asparagin; C=cystein; D=aspar-tinsyre; E=glutaminsyre; F=fenylalaniln; G=glycin; H=histi-din; I=isoleucin; K=lysin; L=leucin; M=metionin; N=aspara-gin; P=prolin; Q=glutamin; R=arginin; S=serin; T=treonin; V=valin; W=tryptofan; Y=tyrosin; Q=glutamin; E=glutaminsyre. ;I henhold til foreliggende oppfinnelse har letingen etter proteinet av den etiologiske enhet for erhvervet immunsviktsyndrom (AIDS) ført til isolering og sekvensering av det provirale gen av AIDS viruset. Det har nå blitt funnet for hva som antas å være første gang at de postulerte etiologiske enheter til AIDS lymfadenopati-assosiert virus (LAV), AIDS-assosiert retrovirus (ARV) og humant T-celleleu-kemi/lymfom/lymfotropisk virus (HTLV III) faktisk er varianter av samme virus. For formålene til foreliggende oppfinnelse og krav vil viruset som forårsaker AIDS heretter bli referert som HTLV-III virus. HTLV-III virus vil være underforstått å innbefatte variantene som er blitt postulert som forårsakende enheter til AIDS, nemlig LAV og ARV. ;Som det fremgår av fig. I, er genomet for HTLV-III kjent, dvs./\HXB-3, og inneholder regioner som koder for gag-proteinet, pol proteinet, sor-proteinet og kappe(env)-proteinet. Regionen av genomet som koder for gag-proteinet er funnet innenfor den 5,5 kb EcoRl fragmentregion og mere spesielt innenfor Cia I til Bel I regionen. ;I henhold til foreliggende oppfinnelse og for å erholde proteinene ifølge oppfinnelsen spaltes HTLV-III genet med ett eller flere restriksjonsenzymer for å erholde fragmentet som inneholder genet som koder for gag-proteinet. Dette fragment blir så spleiset med en promotor for å danne et gen inneholdende promotoren operativt forbundet til en DNA sekvens som koder for gag-proteinet. Det er via denne binding at modifisering ved aminoterminalen av proteinet dannet derfra inkluderes når den uttrykkes i en organisme. I neste trinn blir genet inneholdende promotoren og DNA sekvenser som koder for gag-proteinet av HTLV-III skutt inn i et plasmid eller ekspresjonsvektor som kan replisere i en passende mikrobiologisk vertsorganisme for å danne et plasmid eller eksprejsonsvektor som inneholder promotoren operativt forbundet til NA sekvensen som koder for gag-proteinet for HTLV-III. ;For tiden innenfor faget er det et antall promotorsystemer og passende mikrobielle vertsorganismer som er tilgjengelige og som er passende for foreliggende oppfinnelse. Det er også mange typer plasmider inn i hvilke genet som koder for gag-proteinet av HTLV-III kan settes inn. Generelt er plasmid-ekspresjonsvektorer inneholdende replikajson og kontrollse-kvens, som er avledet fra den art som er kompatibel med vertscellen brukt i forbindelse med disse vertsorganismer. F.eks. blir E. coli typisk transformert ved å bruke plasmid pBR322, et plasmid avledet fra en E. coli stamme. For bruk med gjær, såsom S. cerivisiae, anvendes vanligvis et plasmid slik som pYE7. ;I henhold til foreliggende oppfinnelse kan enhver vanlig promotor som er kompatibel med vertsorganismen og det utvalgte plasmid bli anvendt. Promotorer brukt for rekombinant DNA konstruksjon i E. coli omfatter p-laktamase (penicillinase) og laktosepromotor slik som beskrevet av Chang et al., Nature 275. 615; (1978); Itakura et al., Science, 198; 1056 (1977); promotorsystemer slik som beskrevet av Andersen et al., Mol. Cel., Bol. 3, 562-569 ;(1983) og tryptofan-promotorsystemer slik som beskrevet av Goeddel et al., Nucleic acids Res. 8, 4057 (1980) og også EPO søknadsnummer 0036776. I gjær har promotorer innbefattende, men ikke begrenset til de fra ADC1, GALI, GAL10, PH05, PGK1 og GAPI blitt anvendt som beskrevet av Broach et al. (1983) i Experimental Manipulation of Gene Expression, M. Inouye, ed., Academic Press: New York, N.Y., s. 83-117. Selv om disse vanligvis er brukt har andre mikrobielle promotorer blitt oppdaget og anvendt og detaljer omhandlende deres nukleotidsekvenser er blitt publisert, noe som gjør en dyktig arbeider i stand til å ligere dem funksjonelt i opererbart forhold til genene i transformasjonsvektorer [Sibelist et al., Cell 20, 269 (1980). ;Mange vert/kloningsenhetkombinasjoner kan anvendes ved kloning av dobbelt-kjedet DNA. F.eks. kan anvendlige kloningsenheter omfatte segmenter av kromosomale, ikke-kromosomale og syntetiske DNA sekvenser, slik som forskjellige kjente bakterielle plasmider, f.eks. plasmider fra E. coli slik som pBR322, fag DNA og vektorer avledet fra kombinasjoner av plasmider og fag DNA'er slik som plasmider som er blitt modifisert for å bruke fag DNA eller andre ekspresjonskontrollsekvenser eller gjærplasmider. Anvendelige vertsorganismer kan innbefatte mikroorganismer, pattedyrceller, planteceller og lignende. Blant disse er mikroorganismer og pattedyrceller spesielt brukt. Som foretrukne mikroorganismer kan det nevnes gjær, såsom S. cerevisiae og bakterier slik som Eschrichia coli, Bacillus subtillis, Bacillus stearothermophilus og Actinomyces. De ovenfor nevnte vektorer og vertorganismer kan også anvendes for produksjon av et protein fra et gen erholdt biologisk som ved foreliggende oppfinnelse. Selvfølgelig, behøver ikke alle verts/vektorkombinasjoner være like effektive. Den spesielle utvelgelse av vert/kloningsvektorkombinasjoner kan foretas av fagmannen etter passende vurdering av prinsippene som er beskrevet uten å fravike bredden av oppfinnelsen. ;Videre kan innenfor hver spesiell kloningsvektor, forskjellige seter velges ut for innsetning av det dobbelt-kjedete DNA. Disse seter er vanligvis betegnet ved restriksjonsen-donukleasen som spalter dem. F.eks. er i pBR322 EcoRI setet lokalisert like utenfor genet som koder for ampicillinresi-stens. Forskjellige seter er blitt anvendt av andre i deres rekombinante syntetiske planer. Flere seter er velkjente for fagmannen. Det er selvfølgelig underforstått at en kloningsvektor anvendelig i foreliggende oppfinnelse ikke behøver å ha et restriksjonsendonukleasesete for innsetning av det valgte DNA fragment. I stedet kunne vektoren kobles til fragmentet ved hjelp av alternative metoder. ;Vektoren eller kloningsenheten og spesielt setet valgt deri for tilkobling av et utvalgt DNA fragment for å danne et rekombinant DNA molekyl er bestemt ved et antall faktorer, f.eks. antall seter som kan angripes av et spesielt restrik-sjonshensyn, størrelse av proteinet som skal uttrykkes, tilbøyelighet av det ønskete protein for proteolytisk nedbrytning av vertscelleenzymer, forurensning av proteinet som skal uttrykkes med vertscelleproteiner som er vanskelig å fjerne under opprenskning, ekspresjonskarakteristika, så som beliggenheten av stopp- og startkodoner relativt til vektorsekvenser, og andre faktorer som er kjente for fagmannen. Valget av en vektor og et innskuddssete for et spesielt gen bestemmes av en balanse av disse faktorer, og ikke alle utvelgelser er like effektive for et gitt til- ;felle.;Det er flere kjente metoder for å sette inn DNA sekvenser i kloningsvektorer for å danne rekombinante DNA molekyler som er slike anvendelige ifølge oppfinnelsen. Disse innbefatter f.eks. direkte ligering, syntetiske linkere, eksonuklease og polymerase-forbundne reparasjonsreaksjoner fulgt av ligering, eller ekstensjon av DNA kjeden med DNA polymerase og et passende enkelt-kjedet templat fulgt av ligering. ;Det er selvfølgelig underforstått at nukleotidsekvensene til DNA fragmentet satt inn ved det utvalgte sete av klonings-vektoren kan innbefatte nukleotider som ikke er en del av det faktiske strukturelle gen for det ønskete polypeptid/- protein eller kan innbefatte kun et fragment av det fullstendige strukturelle gen for det ønskete protein. Det er kun krevet at den DNA sekvens som settes inn danner en transformert vertsorganisme som produserer et protein/peptid med en immuunologisk aktivitet overfor AIDS gag-proteinet eller at DNA sekvenser i seg selv er anvendelig som en hybridiseringssonde for å velge ut kloner som inneholder DNA sekvenser anvendelige ved produksjonen av polypeptider/proteiner med en immunologisk aktivitet mot AIDS gag-proteinet. ;Kloningsenheten eller vektoren inneholdende det fremmede gen brukes til å transformere en vertsorganisme for å tillate at vertsorganismen uttrykker proteinet eller en del derav for hvilken det hybride DNA koder. Utvelgelsen av en passende vertsorganisme er også kontrollert av et antall faktorer kjent av fagmannen. Disse innbefatter f.eks. kompatibilitet med den utvalgte vektor, toksisitet av proteiner kodet av hybridplasmidet, letthet av gjenvinning av det ønskete protein, ekspresjonskarakteristika, biosikkerhet og kostnad-er. En balanse av disse faktorer må finnes under hensyn til at ikke alle vertsorganismer kan være like effektive for ekspresjon av et spesielt rekombinant DNA molekyl. ;Når organismen som er i stand til å utføre ekspresjonen av gag-genet er blitt dannet kan fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnels utføres på et antall måter avhengig av egenskapene i konstruksjonen av ekspresjonsvektorene for gag-genet og av vekstbetingelsene for vertsorganismen. Typisk vil vertsorganismen dyrkes under betingelser som er gunstige for produksjon av et stor antall celler. Når et stort antall celler har akkumulert passende induserer eller derepressorer 1 vektsmediet forårsaker promotoren tilført med et slikt gen sekvensen å bli aktiv og tillate transkrip-sjon av den kodende sekvens. Proteinet dannet av den rekombinante celle kan lyseres på vanlig måte som er velkjent i faget. Det er tydelig at den spesielle lyserings-metode vil avhengig av den anvendte vertscelle. ;Ved en foreterukken utførelsesform av oppfinnelsen settes så HTLV-III gag-genet inn i en gjærekspresjonsvektor med en promotor som ikke aktiveres i et fosfatmedium. Denne promotor ble erholdt fra PH05 som beskrevet av Thill et al., Mol, Cell Biol. 3, 570-579 (1983). Gag-genet ble erholdt fra et 5,5 Kb EcoRl fragment fra HTLV-III klon^\HXB-3 [Shaw et al. Science 226, 1165-1171 (1984)]. Dette er Eco RI fragmentet illustrert i fig. 1-A. ;Fig. 1-B illustrerer dannelsen av hybridgenet som inneholder PH05 promotoren og gag-genfragmentet i fig. 1-A. Gjærpromo-toren og translasjonsinitieringssetet er på et 560bpBamHI til Ahalll restriksjonsfragment avledet fra genet for repressibel sur fosfatase, PH05. Enzymet Ahalll danner en butt ende like etter det andre kodon for PH05 som vist i fig. 1-B. Gag-genet inne i 5,5kd ExoRI fragment ligeres til promotoren erholdt fra BamHI til Ahalll restriksjonsfragmen-tet avledet fra PH05. ExoRI fragmentet fra HTLV-III klonen inneholder det fullstendige gag-gen og en stor del av pol-genet som overlapper med gag-genet i en forskjelig leseramme (Råtner et al., supra; og Muesing et al., supra). EcoRI fragmentet ble spaltet med Clal nær aminoterminalen til gag-genet og den resulterende 5' overlapping ble fylt inn med DNA polymenase stort fragment for å danne et butt-endet DNA molekyl som begynner med et argininkodon. Ligering av denne ende til Ahalll av PH05 fragmentet fuserte promotoren og de førsste to kodoner til PH05 til det femtende kodon av gag-genet. ;Det fuserte gen fremstilt ovenfor ble så satt inn i pYE72 vektoren, en vektor som både kan replisere i gjær og E. coli. Dette rekombinante plasmid ble kalt pYE72/gagl. Det resulterende plasmid ble deretter brukt for å transformere gjær. ;Ved å utføre denne ligering kan enhver vanlig metode for ligering anvendes for å fusere promotoren til gag-genet. Enhver vanlig metode for å transformere en mikroorganisme slik at gjær med et plasmid kan anvendes for å danne den rekombinante organisme som vil uttrykke gag-genet. ;PH05 promotoren i plasmidet kalt pYE72/gagl ble indusert i gjærcellene ved vekst i et fosfatasefritt medium og ekstrak-ter av cellene ble analysert for tilstedeværelsen av gag-spesifikke proteiner ved immunoblottanalyse ved bruk av kanin-polykolonal antiserum til ødelagte virus som vist i fig. 2. Kolonnen merket 1, i fig. 2,representerer resultatene fra cellene med pYE72/gagl dyrket i høyt fosfatholdig medium, mens kolonne 2 representerer resultatene fra celler med pYE72/gagl dyrket i et fosfatfritt medium. De indikerte molekylvekter anvendes for å bestemme størrelsene av det reaktive bånd. Som vist i fig. 2, var det ingen ekspresjon av gag-genet i det fosfatholdige medium, hvor promotoren ikke var aktivert for å danne gag-genet. På den annen side, når de samme celler ble dyrket i et fosfatfritt medium dannet lysatene immunoreaktive proteiner som svarer til gag-proteinet og dets forskjellige kjente proteolytiske proteiner som er dannet derfra. ;Som det fremgår av kolonne 2 i fig. 2 tilsvarer et vesentlig Immunoreaktivt protein som er dannet størrelsen til HTLV-III p24gag-proteinet identifisert i virioner og ventet fra den kjente DNA sekvens. De reaktive stoff av de ventede størrel-ser for pl4 og pl6 proteinene ble også funnet. Et større protein på ca. 56kd som tilsvarte det fullstendige gag-protein såvel som flere stoff på ca. 40 kd som representerer et proteolytisk nedbrytningsintermediat ble også dannet. ;For å bestemme om det rekombinante HTLV-III gag-protein faktisk behandles ved proteolyse i gjær for å danne de faktiske virale spesifikke proteolytiske proteiner, ble proteinene erholdt fra lysatet av gjæren transformert med pYE72/gagl fulgt i et pulsoppfølgningseksperiment "pulse chase experiment" med S<3>^-metionin eller 32po^, Fig. 3 viser resultatene av dette eksperiment, hvor hver av kolonnene representerer en forskjellig oppfølgelsestid som følger: A) 0 min. B) 2 min. C) 5 min. D) 10 min..E) 20 min. F) 30 min. G) 45 min.. I alle henseender ble det fullstendige gag-gen på 56 kd funnet med radioaktivitet først. Proteinet på ca.25 kd sett i fig. 2 ble også funnet før 24 Kd proteinet og kan således være dets umiddelbare prekursor. Protein som beveget seg som ventet for 12 Kd ble også påvist. pl4 regionen av gag-genet har intet metionin. Derfor støtter umuligheten av å påvise dette protein dets foreslåtte opprinnelse. ;Fosforylering av de rekombinante gag-proteiner dannet i gjær ble undersøkt etter dyrkning av gjærcellene transformert med pYE72/gagl i et lavfosfatmedium inneholdende 3<2>P04. I fig. 3 viser kolonnene H og I resultatene av gelanalyse av merkete proteiner immunopresipitert med kanin HTLV-III antistoff. I kolonne H, hvor den transformerte gjær ble anvendt var 56 kd en av 40 kd intermediatene 25 kd, 24 kd og 16 kd delene alle reaktive. Ingen radioaktivitet ble funnet ved posisjonen til 14kd båndet når en høyere prosent av gelen ble kjørt. Således synes p24 og pl6 gag-proteinet å være fosforylert i gjær. Ingen gag-proteiner ble funnet når ikke-transformert gjær ble brukt som i kolonne I. ;Som det finnes fra fig. 1-A gir tilstedeværelsen av et Bglll restriksjonssete nær karboksyterminal-kodende region til gag-genet en mulighet for å eliminere ca. halvdelen av den pl6 kodende region såvel som mesteparten av pol-genet som er tilstede i 5 ,5 kd EcoRI fragmentet. Karboksyl-terminaldelen av gag-polyproteinet og/eller aminoterminal-regionen av pol-genet er blitt vist å kode for en behandlende protease i mange retrovirus (se f.eks. Dickson et al., supra). ;For å fjerne proteasen fra det rekombinante gag-protein ble Bglll til EcoRI delen av EcoRI fragmentet av HTLV-III genomet fjernet (se fig. 1-B). Det er antatt at den fjernete del av gag-genet koder for proteaser som omdanner det store rekombinante gag-protein til dets forskjellige ferdigutvik-lete proteintyper. Derfor kan BamHl-EcoRI genet fremstilt i fig. 1-B spaltes ved enten å behandle genet eller plasmidet med Bglll for å fjerne BG1II til EcoRI fragmentet fra dette gen. Hvis ekspresjonsplasmidet pYEE72/gagl brukes åpnes dette plasmid med fordøying med BamHI og Bglll. Når BamHI til Bglll delen av dette ExoRI fragment erholdes kan denne delen settes inn i et passende plasmid, avhengig av mikroor-ganismen i hvilken den skal dyrkes. Ved å sette inn denne del av genet i et plasmid kan det være nødvendig å ligere denne del til serier av DNA baser som tillater innskudd i det ønskete plasmid. I tilfellet hvor pYE7 anvendes ligeres BamHI til Bglll fragmentet med 375bp BamHI-EcoRI fragment fra pBR322 til å danne et BamHI til ExoRI fragment som kan settes inn i pYE7 for å danne pYE72/gag2. ;I henhold til en annen utførelsesform av denne oppfinnelsen ble en annen mutasjon av gag-genet innført ved Bell restrik-sjonssetet i pol-genet like nedstrøms for gag, dvs. pYE72/- gag3. Denne mutasjon innbefatter å sette inn fire basepar ved Bell setet som forårsaker et rammeskift av pol-leserammen som vist i fig. 5. I fig. 5 er denkarboksyterminal-kodende region av gag-genet og den aminoterminal-kodende region for pol-genet vist. Regionen som er homolog til andre gag-proteaser er understreket i denne figur. Leserammen dannet av Bell innskuddet er vist av pilen. Et punktum indikerer et translasjonsterminalsete. Rammeskiftet forårsaket av innskuddet av basene deaktiverte genet fra å danne visse proteaser som proteolytisk kan spalte gag-proteinet. ;Produktene dannet av det fullstendige rekombinante gag-gen og de forkortede gag-gener er vist i figur 4. Kolonne 1 i figur 4 representerer immunoblots tatt fra lysater av celler indusert med pYE72/gagl. Kolonne 2 i figur 4 er rettet mot resultatet av immunoblots tatt fra lysater fra celler indusert med pYE72/gag2; og kolonne III representerer immunoblots tatt fra lysater fra celler indusert med pYE72/gag3. Som funnet dannet pYE72/gagl og 3 det store protein p56. For poYE72/gag3 var det vesentlige immunoreaktive proteinbånd ca. 56 kd og komigrert med presumptiv prekursorprotein funnet i cellene med indusert pYE72/gagl. Imidlertid synes mutasjonen også å forhindre behandling av denne rekombinante gag-prokursor. Som med delesjonsmutaten syntes en mindre mengde av p24 å være tilstede sammenlignet med proteinet funnet i cellene indusert med pYE72/gagl. I tillegg ble et stort 56 kd produkt og de mindre deler i et bånd ved ca. 60 kd funnet i rakkeskiftmutanten. Denne størrelse ville tilsvare gag/pol fusjonsproduktet som ble terminert som vist i fig. 5 som et resultat av Bell innfyl-1 ingen. ;Skjerming av aids sera;Fordi anti-HTLV-III- antistoff ble funnet i mere enn 90% av AIDS Cipasientene kan de mikrobielt syntetiserte gag gen produkter brukes som diagnostiske redskaper for påvisning av disse antistoff. For denne analyse som vist i figurene 6-A og 6-B ble totalt celleprotein fra gjærkultur indusert med pYE72/gagl fraksjonert med SDS-APGE og overført til et nitrocellulosefilter ved Western blotting teknikk. Filter-strimler inneholdende overførte proteiner ble omsatt med 1000 ganger fortynnet humant sera, og antigen-antistoffkom-pleksene som ble dannet ble påvist ved inkubring av strim-lene med<125->I-merket Staphylococcus aureus protein A fulgt av autoradiografi. Fremtredende bånd tilsvarende reaksjonen av antistoffet til 56 kd, 24 kd, 16 kd og 14 kd proteiner ble ganske riktig observert når det anvendte serum var fra pasienter med AIDS. Resultatene fra ett slikt assay med 11 humane sera fra pasienter på østkysten er vist i fig. 6-A. Lignende resultater med 11 serumprøver fra vestkyst-pasienter er vist i fig. 6-B. De negative kontroller (ikke vist) som var brukt var normale humane sera. Det ble ikke funnet noen reaksjon med sera fra friske individer. ;Det synes derfor som om de rekombinante gag-genprodukter kan brukes som diagnostiske reagenser for påvisning av AIDS assosierte antistoff. De rekombinante gag-genprodukter ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en stor del av proteinmolekylet og inneholder både de konserverende og divergente deler av molekylet. Til tross for divergensen observert mellom HTLV-III og ARV-2 sekvenser reagerer de rekombinante gag-proteinprodukter av foreliggende oppfinnelse syntetisert av bakteria med AIDS pasientsera avledet fra begge geografiske beliggenheter av USA. Et hundrede prosent (100 %) av AIDS pasientsera (22 individuelle prøver, 11 avledet fra Østkysten av De Forenede Stater og 11 avledet fra California) som var undersøkt vist høy reaktivitet. Dette er et sterkt bevis for tilstedeværelsen av konserverte epitoper inne i molekylet mot hvilke immunsystemet kunne danne en antistoffreaksjon. Det humane immunsystem kan således fremskaffe en immunresponse mot konserverte epitoper av gag-protein molekylene ved reaktiv!teten av AIDS pasientsera . ;Basert på disse oppdagelser er det foreslått at i praksis for erhvervet immunsviktsyndrom (AIDS) kan de rekombinante AIDS gag-proteinprodukter ifølge denne oppfinnelse brukes. Ved å bruke proteinproduktene ifølge foreliggende oppfinnelse kan humant blod undersøkes for tilstedeværelsen av antistoff mot AIDS virus. Denne og andre teknikker bestemmes lett. Foregående og andre mål, trekk og fordeler ved oppfinnelsen vil bli tydeliggjort fra de følgende eksempler ;på foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen.;I eksemplene var E. coli stamme MC1061 den samme som beskrevet av Casadaben et al., J. Mol. Biol. 138, 179-207 ;(1989). E. coli stamme GM119 anvendt for fremstilling av umetylert DNA var den beskrevet av Arraj et al., J. Bact. 153. 562-563 (1983). E. coli stammer MC 1061 og GM 119 ble innlevert ved American Type Culture Collection (ATCC) 26. nov. 1985 med henholdsvis tilgangsnumrene ATCC 53338 og ATCC 53339. Gjærekspresjonsplasmidet pYE7 brukt i eksempel 5 var det samme som beskrevet i eksemplene og fig. 6 til europei-ske patentansøkning publikasjons nr. 0124824 som er innbefattet ved referanse. Den anvendte gjær var S cerivisiae 20B-12 (ATCC nr. 20626). Gjærtransformasjon ble utført som beskrevet av Hinnen et al., Proe. Nat. Acad. Sei., USA, 75, 1929-1934 (1978). PH05 genet anvendt for å fremstille promotoren ble erholdt fra plasmidet pAP20 som beskrevet av Andersen et al., Mol. Cell Biol.3,562-569 (1983). <\ HXB-3 som var brukt var som beskrevet av Shaw et al., Science 226, 1165-1171 (1984). ;EKSEMPEL 1;Fremstilling av pYE72/ gagl;Restriksjons- og DNA modifiserende enzymer ble brukt som anbefalt av forhandler. Alle restriksjonsenzymfordøyelser ble utført vced 37°C i 1 time med 0,5-1,0 enheter enzym i 50 mM NaCl, lOmM tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2, ImM ditiotrei-tol (DTT). 560 bp BamHI til Ahalll fragment med PH05 promoter og translasjonsinitiasjonsregionen ble erholdt fra plasmidet pAP20, og Clal til EcoRi fragmentet med gag/pol-regionen ble erholdt fra (\HXB-3. 5,5 kb. Ecol fragmentet ble subklonet til pBR 322 og plasmidet dyrket i E. coli GM119. Clal 5' overhenget til Clal til EcoRI-fragmentet ble "fylt inn" ved behandling med 5 enheter av Klenow fragmentet av E. coli DNA polymerase I i nærvær av alle fire deoksyrib-onukleorider ved 50 pM (C,T,A, og G) ved 16°C i 2 timer i den samme buffer som den anvendt for restriksjonsenzymreak-sj onene. ;Omtrent like mengder av BamHI-Ahalll PH05 fragmentet og Clal (fylt inn)-EcoRI gag/pol fragmentet ble behandlet med 1,0 enheter av T4 DNA ligase i 16 timer ved 16°C i 50 mM tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 20 mM DTT, ImM aATP. Produktene ble spaltet med BamHI og EcoRi og PH05-gaq/pol fusjonen ble satt inn ved ligering i pYE7 som var litt spaltet med BamHI og EcoRI. Det resulterende ekpresjonsplasmid ble betegnet pYE72/gagl. ;EKSEMPEL 2;Fremstilling av pYE72/ gag2;Én delesjon som fjernet karboksyl-terminaldelen av gag og alt pol ble foretatt ved å fordøye pYE72/gagl med BamHI og Bglll og ved å isolere PH05-gag fragmentet. Dette ble omdannet til BamHI til EcoRi fragment ved ligering med 375 bp BamHI-EcoRI fragment fra pBR322 til Bglll setet via de identiske 5' overheng av Bglll og BamHI. Inkorporering av dette fragment i pYE7 ga PYE72/gag2. ;EKSEMPEL 3;Fremstilling av pYE72/ gag3;En annen mutasjon ble innført ved Bell setet i pol-genet like nedstrøms for gag. Siden Bell ikke spalter metylert DNA, ble pYE72/gagl satt inn i E. coli GM119, og DNA ble fremstilt og spaltet med Bell. 5' overhenget ble fylt inn med Klenow fragmentet som tidligere og plasmidet ble resirkularisert ved butt-ende ligering. Det resulterende plasmid med det 4 bp GTAC innskudd ved Bell setet ble betegnet pYE72/gag3. ;EKSEMPEL 4;Dyrkning og induksjon av gjærstammer;Separate kulturer av gjærstammen S cerevisiae 20B12 inneholdende gag-ekspresjonsplasmidene eller en vektor uten innskutt gen ble dyrket i mediet YCAD og indusert i fosfat-fritt medium som beskrevet av Kramer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 367-370 (1984). Ca. 6 timer etter overføring til fosfat-fritt medium ble celler samlet opp ved sentrifugering og sferoplaster fremstilt med Zymolyase 60,000 [Kaneko, TG., Kitamura, K., og Yamamoto, Y., Ågr. Biol. Chem., 37, 2295 (1973] og samlet opp. Sferoplaster ble vanligvis lagret ved -20°C før analyse. For proteinopp-renskning samles hele celler i stedet for sferoplaster og f ryses. ;EKSEMPLEL 5;Opprensning av de rekombinante gag proteinprodukter.;Et homogent rekombinant gag-protein og dets proteolytiske produkter kan renses i henhold til følgende fremgangsmåte. De induserte gjærceller brekkes opp ved hjelp av standard mekaniske prosedyrer. Disse innbefatter gjennomgang gjennom en French Pressure Cell eller rask blanding med glassperler I en blanding, så som en Bead Beater, en Dyna-Mill eller en Braun Homogenizer. For enhver av de ovenfor resuspendert i ca. 2 volumdeler (relativt til celleklumpen) 50 mM NaPC"4, pH 7,4 buffer. For glassperlerlysis tilsettes et likt volum av 0,5 mm glassperler. Lysis oppnås ved enten tre passasjer ved 20,000 p.s.i. gjennom French Pressure Cell eller som anbefalt av forhandleren av mikseren. Lysis kan følges ved mikroskopi. ;Etter cellebrudd fjernes cellematerialet (og glassperder) ved to 10 minutters sentrifugering ved 600 x g. Nok en sentrifugering ved 12.000 x g i 20 minutter fjerner mito-chondria. Proteinene fraksjoneres deretter ved sentrifugering ved 100.000 x g i 1 time for å erholde en pellett (mikrosomal fraksjon) og supernatant (løselig fraksjon). Hvis gag-proteinene er i den mikrosomale fraksjon er oppløsning ved å bruke enten forskjellige ioniske og/eller ikke-ioniske detergenter eller denaturerende midler, slik som urea eller guanidin HC1, nødvendig før ytterligere opprenskning. ;Ytterligere opprenskning kan oppnås ved standard flytende kromatograferingsmetoder. Forskjellige kromatografimedia kan anvendes for å erholde fraksjonering ved gelfiltrering, ionebyttekromatografi, og/eller affinitetskromatografi. For gag-proteiner bør enkelt-kjedet DNA celluloseaffinitetskro-matografi være anvendelig siden gag-proteiner binder til nukleinsyrer. ;Endelig opprenskning kan oppnås ved revers fase høy effekti-vitetsvæskekromatografi (HPLC). HPLC trinnet gir prekursor-gag-proteinet og de naturlige proteolyseproteiner avledet fra dette i hovedsak i 100 % ren form. Det er også tenkelig at monoklonale antistoff affinitetskromatografikolonner som bruker gag-polyklonale eller monoklonale antistoff til prekursor-gag-proteinet og de naturlige proteolyseproteiner kan brukes som et alternativ til HPLC. ;Ved ovenfor nevnte opprensningsprosedyre erholder man følgende produkter: ;56 kd proteinet med strukturen gitt i fig. 8,;24 kd proteinet med strukturen gitt i fig.10; 16 kd proteinet med strukturen gitt i fig.12; ;14 kd proteinet med strukturen gitt i fig.14; og;48 kd proteinet med strukturen gitt i fig.16.;EKSEMPEL 6;Polyakrylamid gel elektroforese og Western Blott Analyse For immunoblott analysen i figurene 2, 3, 4, 6-A og 6-B ble celler lysert ved resuspensjon av sferoplastpellets (ca.10<8>celler) i et likt volum av2 x prøvebufferen til Laemmli (Laemmly "Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriopohage T4". Nature 227. 68-685, 1970) og inkubert ved 95°C i fem (5) minutter. Avfallsmaterialet ble pellettert ved sentrifugering og de klarete lysater ble underkastet SDS-PAGE analyse, Id. For Western blott analyse ble proteinene fra akrylamidgelen elektroblottet på en 0,1 pm nitrocellulosemembran (Schlei-cher and Schuell) i 16 timer ved 50V, i 12,5 mM tris, 96 mM glycin, 20$ metanol, 0,01$ SDS ved pH 7,5. Behandling av blottet ble utført ved å bruke metodene beskrevet av Towbin et al., "Electrophoretic Transfer of Proteins From Polyacry-lamide Gels to Nitrocellulose Sheet: Procedure and Some ;applications," Proe. Natl.,Acad. Sei. U.S.A., 76, 4350-4354, ;(1979). For behandling med humant sera ble blottene inkubert med 1000 gangers fortynning av sera i antistoff buffer (20 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,5 inneholdende 0,5 M NaCl, 1$ BSA og 0,05$ Tween 20) i 2-6 timer. Blottene ble deretter vasket to ganger med fosfatbufret saltoppløsning inneholdende 0,05 $ Tween 20 og deretter inkubert med 125_I_merlie"t: Staphylococcus aureus protein A i en ytterligere tid på 1 time. Blottet ble så vasket to ganger i PBS-Tween 20 buffer, tørket og autoradiografert. ;EKSEMPEL 7;Merking av Cellene;Cellene ble merket enten med<35>S-metionin pulsforfølgelse eller<32>P04for pulsforfølgelse-immunoutfelling ifølge fig. 3 ved følgende fremgangsmåte. For<3>^S-metionin pulsforføl-gelsen ble 500 mCi<35>D-metionin pulsforfølgelse, 500 mCi<35>S-metionin tilsatt kulturmediet. Etter en 2 minutters merkeperiode ble umerket metionin tilsatt. Ved forskjellige tider ble cellene høstet, lysert og behandlet ved immunout-felling med kaninantistoff, og lysatene ble analysert med SDS-PAGE og autoradiografi. Forfølgelsestidene er som følger: A) 0 min. B) 2 min. C) 5 min. D) 10 min. E) 20 min. F) 30 min. G) 45 min.. For<35>P04~merkingen i kolonnene H og I ble 1 mCI<32>P0<4>tilsatt til kulturmediet. Merking ble fortsatt i 30 minutter ved 30°C, deretter ble celler høstet, og lysater behandlet for immunoutskilling som beskrevet ovenfor. Lysater var fra celler inneholdende pYE72/gagl (H), og celler inneholdende et lignende plasmid uten gag-gen (I). ;EKSEMPEL 8;t;Diagnostisk test for AIDS;Det er klart at det rekombinante prekursor-gag-protein og de naturlige proteolyseproteiner avledet derfra ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes som diagnostiske reagenser for påvisning av AIDS-assosiert antistoff. Det er også tydelig for den vanlige fagmann at et diagnostisk assay for AIDS som bruker polyklonale eller monoklonale antistoff til det AIDS rekombinante gag-prekursorprotein eller de proteolytiske produkter kan anvendes for å påvise tilstedeværelse av AIDS virus i humant blod. I én utførelsesform brukes et konkurrerende immuno assay hvor den antigene substans, i dette tilfelle AIDS viruset, konkurrerer i en blodprøve med en kjent mengde merket antigen, i dette tilfelle merket AIDS rekombinant prekursor-gag-protein, eller proteolyseproteinene avledet derfra for en begrenset mengde av antistoff bindende seter. Således er mengden merket antigen bundet til antistoffet inverst proporsjonalt med mengden antigen i prøven. I en annen utførelsesform kan et immunometrisk assay brukes, hvori et merket AIDS gag-antistoff som fleksbinder med det antigen-bundne antistoff er direkte proporsjonal med mengden antigen (AIDS virus) i blodprøven. I et enkelt ja/nei assay for å bestemme hvorvidt AIDS viruset er tilstede i blod undersøkes en solid støtte for å påvise tilstedeværelsen av merket antistoff. I en annen utførelsesform kan monoklonale antistoff til rekombinant prekursor AIDS gag-protein, eller de naturlige proteolyseproteiner avledet derfra, anvendes i et immunometrisk assay. Slike monoklonale antistoff kan erholdes ved velkjente metoder i faget, spesielt fremgangsmåten til Milstein and Kohler beskrevet i Nature 256, 495-497 (1975). Antige-nene i dette assay kan være det rekombinante gag-prekursorprotein eller proteolyseproteinene avledet deri enten i ren form eller som en blanding av disse proteiner. ;Den immunometriske assaymetode er som følger: Dobbelte ;prøver foretas i hvilke IOOjjI av en suspensjon av antistoff immobil i sert på agarosepartikler blandes med IOOjjI av serum og IOOjjI av oppløselig<125>I-merket antistoff. Denne blanding ligger for spesielle tider mellom en kvart time til 24 timer. Etter Inkuberingsperiodene vaskes agarosepartiklene ved tilsetning av buffer og sentrifugeres deretter. Etter fjerning av vaskevæsken ved apsirasjon blir derpå den resulterende pellett av agarosepartikler tellet for bundet<125>l-merket antistoff. De erholdte tellinger for hver av kompleksene kan så sammenlignes med kontroller. ;Forskjellige trekk av oppfinnelsen er fremstilt i de følgende krav. *

Claims (41)

1. Polypeptid, karakterisert ved immunologisk ekvivalent til gag-proteinproduktene av HTLV-III med aminosyresekvens som gitt enten i fig. 8 eller fig.16, eller 14 kd, 16 kd eller 24 kd proteolytiske polypeptid fragmenter derav eller polypeptider relatert til ethvert av disse polypeptider ved aminosyresubstitusjon(er) som opptrer ved mutasjoner av en rekombinant vertsorganisme som danner disse polypeptider.

2. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at polypeptidet er 56 kd prekursoren med aminosyresekvensen:

3. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at polypeptidet er et 14 kd proteolytisk fragment med aminosyresekvens:

4. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at polypeptidet er det 48 kd proteolytiske fragment med aminosyresekvensen:

5. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at polypeptidet er det 16kd proteolytiske fragment med aminosyresekvensen:

6. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at polypeptidet er det 24 kd proteolytiske fragment med aminosyresekvensen:

7. Polypeptid, karakterisert ved at det er immunologisk ekvivalent til gag-proteinproduktene av HTLV-III uttrykt i gjær.

8. Gen, karakterisert ved at det inneholder en gendel med en DNA sekvens som koder for et polypeptid ifølge ett av kravene 1 til 6 operativt forbundet til en promotor som er i stand til å fremskaffe ekspresjonen av denne DNA sekvens.

9. Gen ifølge krav 8, karakterisert ved at gendelen er Clal til EcoRI restriksjonssetefragmentet til r\. HXB-3 genomet.

10. Gen ifølge krav 9, karakterisert ved at promotoren er BamHI til Ahalll restriksjonssetefragment til PH05.

11. Gen ifølge krav 8, karakterisert ved at gendelen er Clal til Bglll restriksjonssetefragment til Clal til EcoRI fragmentet til ^HXB-3genomet.

12. Gen ifølge krav 11, karakterisert ved at promotoren er BamHI til Ahalll restriksjonssetefragmentet til PH05.

13. Gen ifølge krav 8, karakterisert ved 'at gendelen er Clal til EcoRI restriksjonssetefragmentet til A HXB-3, hvor Clal til EcoRI fragmentet er fylt inn ved dets Bell restriksjonssete med basesekvensen GATC.

14. Gen ifølge krav 13, karakterisert ved at promotoren er BamHI til Ahalll restriksjonsse-tef ragmentet av PH05.

15. Gen, karakterisert ved at det inneholder en gendel med en DNA sekvens som koder for et immunologisk ekvivalent polypeptid til gag-proteinproduktene til HTLV-III operativt forbundet til en promotor som er i stand til å fremskaffe ekspresjon av denne DNA sekvens i gjær.

16. Rekombinant ekspresjonsvektor, karakte risert ved at den er i stand til å fremskaffe ekspresjon av et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1 til 6 og som inneholder en gendel med en DNA sekvens som koder for dette polypeptid operativt forbundet med en promotor som er i stand til å fremskaffe ekspresjon av denne DNA sekvens.

17. Vektor ifølge krav 16, kararakteri sert ved at gendelen er ClaAI til EcoRI restrik-sjonsfragmentet av A HXB-3 genomet.

18. Vektor ifølge krav 17, karakterisert ved at promotoren er BamHI til Ahalll restriksjonssetefragmentet av PH05.

19. Vektor ifølge krav 16, karakterisert ved at gendelen er Clal til Bglll restriksjonssetefragmentet av Cia I til EcoRI restriksjonssetefragmentet til A HXB-3 genomet.

20. Vektor ifølge krav 19, karakterisert ved at promotoren er BamHI til Ahalll restriksjonssetefragment av PH05.

21. Vektor ifølge krav 16, karakterisert ved at gendelen er Clal til EcoRI restrik-sj onssetef ragmentet av HXB-3, hvori Clal til EcorRI fragmentet er fylt inn ved Bell restriksjonsseteet med basesekvens GATC.

22. Vektor ifølge krav 21, karakterisert ved at promotoren er BamHI til Ahalll restriksjonssetefragment av PH05.

23. Vektor ifølge krav 18, karakterisert ved at den er pYE72/gagl.

24. Vektor ifølge krav 20, karakterisert ved at den er pYE72/gag2.

25. Vektor ifølge krav 22, karakterisert ved at den er pYE72/gag3.

26. Rekombinant ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den er i stand til å fremskaffe ekspresjon av et polypeptid som er immunologisk ekvivalent til gag-proteinproduktene av HTLV-III i gjær og som inneholder en gendel med en DNA sekvens som koder for gag-proteinet av HTLV-III operativt forbundet til en promotor som er i stand til å fremskaffe ekspresjon av denne DNA sekvens.

27. Polypeptid ifølge ethvert av kravene 1- 7, karakterisert ved at det foreligger som en vaksine.

28. Polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-7, karakterisert ved at det foreligger som et antigen.

29. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-6, karakterisert ved at den omfatter: å transformere en vertscelle med en ekspresjonsvektor ifølge ethvert av kravene 16 - 25; dyrke vertscellen slik at proteinproduktene uttrykkes; og ekstrahere og isolere nevnte proteinprodukter.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 29, karakterisert ved at vertscellen er en gjærcelle.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 30, karakterisert ved at gjærcellen er en S. cerevisiae celle.

32. Fremgangsmåte for å danne et polypeptid som er immunologisk ekvivalent til gag-proteinproduktene av HTLV-III, karakterisert ved at den omfatter: å transformere en gjærcelle med en ekspresjonsvektor ifølge krav 26, dyrke gjærcellen slik at proteinproduktene uttrykkes; og ekstrahere og isolere disse proteinprodukter.

33. Fremgangsmåte for å teste humant blod for tilstedeværelsen av antistoff til den virale etiologiske enhet for AIDS, karakterisert ved at den omfatter å blande en løsning inneholdende et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-7 eller blandinger derav med en prøve av humant blod og bestemme hvorvidt dette protein eller ethvert av dets naturlige proteolytiske proteiner eller blandinger derav binder til AIDS antistoffene som er tilstede i blodprøven.

34. Vaksine, karakterisert ved at den inneholder et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1 - 7 samt et fysiologisk akseptabelt bæremlddel.

35. Antistoff, karakterisert ved at det reagerer mot et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-7.

36. Antistoff ifølge krav 35, karakterisert ved at de er monoklonale antistoff.

37. Anvendelse av et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-7 for fremstilling av en beskyttende immunise-ringsvaksine.

38. Anvendelse av et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-7 for fremstilling av antistoff mot AIDS virus.

39. Anvendelse av et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-7 for å undersøke humant blod for tilstedeværelsen av AIDS virus.

40. Testsett for bestemmelsen av antistoff mot AIDS virus, karakterisert ved at det omfatter i en beholder et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-7.

41. Testsett for bestemmelse av AIDS virus, karakterisert ved at det omfatter i en beholder antistoff mot AIDS virus fremstilt ved et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-7.