JPH02150283A - 発現プラスミドおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、成人ＴＪｆＢ胞白血病ウィルス（以下、ＨＴ
ＬＶ−１と略称することがある。）のｇａｇ抗原性を有
する蛋白質の製造のための組換えＤＮＡに関する。

より具体的には、ＨＴＬＶ−１ｇａｇ抗原性を有する蛋
白質の発現プラスミド、該プラスミドにより形質転換さ
れた酵母、および該形質転換酵母を用いるＨＴＬＶ−１
ｇａｇ抗原性を有する蛋白質の製造法に関する。

従来の技術 ＨＴＬＶ−１は成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）［Ｔ。

ｔｌｃｈｉｙａｍａら、ＢＩｏｏｄ、５０，４８１（１
９７７）］の原因ウィルスとして分離されたヒトレトロ
ウィルスであるＣＢ、　Ｐｏ１ｅｓｚら、Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７７．６８１５（１９８０）；Ｙ、　Ｈｉｎｕ
ｍａら。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ
　Ａ、７８．６４７６（１９８１）］。該ウつルスの遺
伝子としては、通常のレトロウィルスにみられるｇａｇ
（ｇｒｏｕｐｓｐｅｃｉｆｉｃ　　ａｎｔｉｇｅｎの略
）　、　ｐｏ　１（ｐｏ　Ｉｙｍｅｒａｓｅの略）。

ｅｎｖ（ｅｎｖｅ　ｔｏｐｓの略）遺伝子以外に、ｐＸ
遺伝子が存在することが明らかにされている［Ｌ　Ｙｏ
ｓｈｉｄａ。

Ｇａｎｎ、７４．７７７（１９８３）；Ｍ、　５ｅｉｋ
ｉら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８０．３
６１８（１９８３）］。

遺伝子構造の解析から、ＨＴＬＶ−１抗原分子の由来が
決定されている。すなわち、ｇａｇ遺伝子には内部コア
抗原の前駆体蛋白ｐ５３がコードされ、これがプロセス
されて最終的にｐｌ９．ｐ２４゜ｐｌ５の３種類のコア
抗原となる。ｅｎｖ遺伝子によってコードされたエンベ
ロープの前駆体蛋白ｐ４６は、糖鎖の付加によって前駆
体糖蛋白ｇｐ６２を生成し、プロセスを受けて最終的に
２種類のエンベロープ糖蛋白ｇｐ４６とｇｐ２１どなる
。ｐＸ遺伝子には４つのオープン・リーディング・フレ
ーム（ｏｐｅｎ　　ｒｅａｄｉｎｇ　　ｆｒａｍｅ）が
存在し、ｐＸ−ｍからｐ２７とｐ２１が、ｐＸ−ＩＶか
らｐ４０が生成する。

一方、ＨＴＬＶ−１感染者およびＡＴＬ患者の血清中に
は、上記ウィルス抗原［ＡＴＬ関連の抗原群（ＡＴＬＡ
）］に対する抗体が存在しており［Ｙ。

Ｈｉｎｕｍａら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　　Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７８　。

６４７６（＋９８１）］、ＡＴＬＡを用いればＨＴＬＶ
−１に対する抗体の検出は可能であることが知られてい
る。該抗体の検出に用いられる抗原として、ＨＴＬＶ−
１の産生細胞から分離精製された該ウィルス抗原（特開
昭５８−１８７８６１号公報）、ざらには遺伝子組換え
技術によって作製された４３ＫＤａ（ｌのＬａｃＺ’−
ｇａｇ融合蛋白［Ｓ。

ｌ　Ｌａｍｕｒａら、Ｇｅｎｅ、３８．５７（１９８５
）］や１ＯＯＫ　ＤａＱのｇａｇ　−ｅｎｖ−ｐＸ　−
ＩＶ遺伝子産物（特開昭６２−２９６８８９号公報）が
利用されている。

しかしながら、上述の方法で得られる抗原量は、細胞培
養による場合はもちろん、組換え技術によっても微量で
あり（大腸菌組換え体による４３ＫＤａＱ　ＬａｃＺ　
’−ｇａｇ融合蛋白の生産量は総可溶性蛋白の０．３％
）、高い遺伝子発現レベルにあるとは言えない。

発明が解決しようとする課題 上記のように、ＨＴＬＶ−１のｇａｇ抗原性を有する蛋
白質を大量に生産する技術の開発が望まれていた。

課題を解決するための手段 本発明者らは、遺伝子組換え技術によってＨＴＬＶ−１
ｇａｇ抗原性を有する蛋白質を大量にうることを目的に
鋭意研究した結果、（１）ＨＴＬＶ−Ｉ　　ｇａｇ遺伝
子がクローニングされたプラスミドからｇａｇ遺伝子ま
たはその一部を調製し、（２）該遺伝子を酵母用の発現
ベクターに挿入してｇａｇ抗原性を有する蛋白質発現プ
ラスミドを作製し、（３）該プラスミドで酵母を形質転
換し、（４）該形質転換体の培養物中にｇａｇ抗原性を
有する蛋白質またはその誘導体を生成、蓄積せしめてこ
れを採取することにより、ｇａｇ抗原性を有する蛋白質
（以下、ｇａｇポリペプチドと略称することがある。）
を大量に生産することに成功し、さらに研究を進め本発
明を完成した。

すなわち、本発明は （１）　　成人Ｔ細胞白血病ウィルスのｇａｇ抗原性を
有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有し、酵母内で複
製可能であることを特徴とする該蛋白質の発現プラスミ
ド、 （２）上記（１）項のプラスミドを用いて形質転換させ
た酵母、および （３）上記（２）項の酵母を培地に培養し、培養物中に
成人Ｔ細胞白血病ウィルスのｇａｇ抗原性を有する蛋白
質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とす
る該蛋白質の製造法である。

本発明のｇａｇ抗原性を有する蛋白質は、前述のｐｉ　
９　、ｐ２４　、ｐｉ　５の３種類のコア抗原に対する
抗体の少なくとも一つに反応するものであればいずれで
もよく、例えばｇａｇ蛋白質（ｇａｇ前駆体）、その抗
原性を有する誘導体（例、ｐｌ　９　、ｐ２４　、ｐｌ
　５など）などが挙げられる。

本発明に用いるＨＴＬＶ−Ｉｇａｇ遺伝子またはその一
部は、ＨＴＬＶ−１プロウイルス［Ｓ、Ｈ９Ｎａｎ＋ら
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃ
ｏｍｍｕｎ、、　１３９　。

１２９（１９８６月から適当な制限酵素を用いることに
よって調製することができ、該遺伝子がサブクローン化
されたプラスミドを大腸菌内で増幅することにより、大
量にｇａｇ遺伝子またはその一部を調製することができ
る。

本発明に用いるベクター（例、プラスミド）としては、
酵母で複製可能なものであれば何でもよく、例えばｐＳ
　Ｈｌ　９　（Ｓ、　Ｈａｒａｓｈｉｎｅａら、Ｍｏ１
．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、４．７７１　（１９８４）　）　、ｐＳＨ
ｌ　９−ｌ（ヨーロッパ特許出願公開ＥＰ−Ａ−０２３
５４３０）などが挙げられ、これらにプロモーターを挿
入することによって外来遺伝子発現用ビークルが得られ
る。

発現に用いられるプロモーターは酵母で機能しうるもの
であればいかなるものであってもよいが、タトエばＧＬ
Ｄ（ＧＡＰＨ）プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、
ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＰＨ０８１
プロモーター、ＧＡＬＩＯプロモーターなどが好ましく
用いられる。

プロモーターは対応する遺伝子より酵素的に調製するこ
とができる。また、化学合成することもできる。

ｇａｇポリペズチドをコードするＤＮＡを発現させる発
現プラスミドは上記の発現用ベクターのプロモーターの
下流にｇａｇポリペプチドをコードするＤＮＡを、ある
いはｇａｇポリペプチドをコードするＤＮＡの５′末端
側に酵母で作動するシグナルペプチドのすべてまたは一
部をコードするＤＮＡを結合させたＤＮＡを挿入するこ
とによって得られる。発現用ベクターとしては、たとえ
ばｐＰＨｏ　　１７．ｐＧＬＤ　　９０６．ｐＧＬＤ　
　９０６−１　　（Ｙ、Ｉｔｏｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、。

１３８．２６８（１９８６））などがあげられる。

この場合、ｇａｇポリペプチドをコードするＤＮＡの下
流にターミネータ−を挿入することによって該ＤＮＡの
発現量を高めることができる。このターミネータ−とし
ては、例えばフォスフォグリセレートキナーゼ遺伝子（
ＰＧＫ）、２μＤＮＡのＦＬＰ遺伝子、インベルターゼ
遺伝子（ＳＵＣ２）などのターミネータ−が挙げられる
。

本発明における発現プラスミドを構築するための方法は
公知であり、文献たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ（１９８２）、Ｃｏ１ｄ　　　Ｓｐｒｉｎｇ　　
　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙに記載されている
。

発現プラスミドにより形質転換される宿主としては酵母
があげられ、なかでもサツカロミセスセレビシェ（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が
好ましい。特に、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの呼吸欠
損株（Ｐ−）が宿主として適している。

呼吸能を有する酵母（親株Ｐつから呼吸欠損株（Ｐ−）
を得る方法自体は公知であり、例えば、Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　　Ｃｏｕｒｓｅ　　Ｍａｎｕａｌ　　ｆｏｒ　
　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　１ｎＹｅａｓｔ　　Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８６）に記載されている
。即ち、親株をエチジウムブロマイドを含む培地で培養
したのち、炭素源としてグルコースを含む培地では生育
できるが、グリセロールを含む培地では生育できない菌
株を分離することによって呼吸欠損株を容易に得ること
ができる。また頻度は低いが親株の単一コロニーの中か
ら呼吸欠損株を得ることができる。ここで言う親株が、
発現プラスミドを有する形質転換株（組換え体）の場合
には、その呼吸欠損株を得ることによって目的とする遺
伝子発現量が高い組換え体を直接に得ることが出来る。

また親株が発現プラスミドを保持しない場合には、その
呼吸欠損株を得たのち、これに発現プラスミドを導入す
ることによって目的の組換え体が得られる。

組換えＤＮＡ（プラスミド）を用いて酵母を形質転換す
る方法は自体公知の方法、たとえばリチウム法団、Ｉｔ
ｏら山Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　、　、±５３．１６３（１
９８３）］、プロトプラスト法［Ａ、　Ｈｉｎｎｅｎら
。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ
、７５　、１９２７（１９７８）］などが挙げられる。

このようにして得られた形質転換株（組換え体）をそれ
自体公知の方法で培養する。

培地としては、例えばパークホルダー（Ｂｕｒｋ　−ｈ
ｏｌｄｅｒ）最少培地　［Ａｍ、　Ｊ、　Ｂｏｔａｎｙ
、　３０　、２０６（１９４３）］あるいはその改変培
地［Ａ、　Ｔｏｈ−ｅら。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、ｌ　１３．７２７　（１
９７３）　］または低リす酸培地［Ａ、　Ｔｏｈ−ｅら
、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。

１１３．７２７　（１９７３）］などが挙げられる。

培養は通常１５°Ｃ〜４０℃、好ましくは２４°Ｃ〜３
７℃で１０〜１６８時間、好ましくは７２〜１４４時間
行う。振とう培養でも静置培養でも良いが、必要に応じ
て通気や撹拌を加えることもできる。

本発明によればｇａｇポリペプチドは通常の蛋白質抽出
・精製法１例えばガラスピーズによる菌体破砕、遠心分
離、塩析１等電点沈澱、ゲルろ過、イオン交換クロマト
グラフィー、高速液体クロマトグラフィー、アフイニイ
テイ・クロマトグラフィーショ糖グラジェント超遠心、
塩化セシウムグラジェント超遠心などの精製工程を適当
に組み合わせることによって容易に精製することができ
る。

（作　用） 本発明で得られるｇａｇポリペプチドは、ＨＴＬＶ−！
感染細胞を原料にして製造されるｇａｇ蛋白質と同様の
抗原性を有し、診断用キ・ソトの材料およびＨＴＬＶ−
１ワクチンとして用いることができる。

なお、本願明細書および図面において、塩基やアミノ酸
などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣＩ　Ｕ　Ｂ　　
Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ　　ｏｎ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌＮｏｍｅｎｅｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を次
にあげる。またアミノ酸に関して光学異性体がありうる
場合は、特に明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＲＮＡ ＲＮＡ ＲＮＡ ＡＴＰ ＴＴＰ ＧＴＰ ＣＴ　Ｐ ＴＰ ＤＴＡ ＤＳ ＴＴ ｌｙ ｌａ ａｌ ｅｕ ｉｅ デオキシリポ核酸 リボ核酸 メツセンジャーＲＮＡ アデニン チミン グアニン シトシン デオキシアデノシン三リン酸 デオキシチミジン玉リン酸 デオキシグアノシン三リン酸 デオキシシチジン玉リン酸 アデノシン三リン酸 エチレンジアミン四酢酸 ドデシル硫酸ナトリウム ジチオスレイトール グリシン（Ｇ） アラニン（Ａ） バリン（Ｖ） ロイシン（Ｌ） イソロイシン（１） ｅｒ ｈｒ ｙｓ １／２Ｃｙｓ ｅｔ ｌｕ ｓｐ ｙｓ ｒｇ ｉｓ ｈｅ ｙｒ ｒｐ Ｐｒ。

ｓｎ ｌｎ ｐｒ Ｔｃ’ Ｒ３１ セリン（Ｓ） スレオニン（Ｔ） システィン（Ｃ） ハーフシスチン メチオニン（Ｍ） グルタミン酸（Ｅ） アスパラギン酸（Ｄ） リジン（Ｋ） アルギニン（Ｒ） ヒスチジン（Ｈ） フェニルアラニン（Ｆ） チロシン（Ｙ） トリプトファン（Ｗ） プロリン（Ｐ） アスパラギン（Ｎ） グルタミン（Ｑ） アンピシリン耐性遺伝子 テトラサイクリン耐性遺伝子 オートノマス・レプリケーション・ シーフェンス　ｌ （ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　
　５ｅｑｕ　−ｅｎｃｅ　　ｌ） 本発明で用いられるプラスミドおよび微生物の寄託機関
の受託番号は以下に示すとおりである。

なお、ＩＦＯは財団法人発酵研究所（ＩｎｓｔｉＬｕｔ
ｅｆｏｒ　　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ、０ｓａｋａ）
を、ＦＲＩは日本国工業技術院微生物工業技術研究所（
ＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ　　Ｉｎ５
ｔｉｔｕｔｅ、Ａｇｅｎｃｙ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ａｌＳｃｉｅｎｃｅ　　ａｎｄ　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ、Ｊａｐａｎ）を示す。

ＮＡ７４−３Ａ（Ｐ’−）／ｐＨＴｌ　５０１Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　　１
０４４１　　　　ＢＰ−１９６２ＮＡ７４−３Ａ（Ｐつ
／ｐ）ＩＴＩ　５１１Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＮＡ７４−３Ａ ＢＰ−１９４７ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＮＡ７４−３Ａ（ｐ　−） ＢＰ−１９４８ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＢＰ−１０５９ Ｓａｅｅｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
　　Ｎ　Ａ　７４　　３　Ａ（ρつ／ｐＨＴ　Ｉ　　５
０１はプラスミドｐＨＴｌ５０１を、Ｓａｃｅｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｎ　Ａ　７４３
　Ａ（Ｐ−）／ｐＨＴ　！　　５１．１はプラスミドｐ
ＨＴｌ５１１を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅＡＨ２２Ｒ−／ｐＧＬＤ　　Ｐ３１−
ＲｃＴはプラスミドｐＧＬＤ　　Ｐ３１−ＲｃＴを保持
する。

実施例 以下に、参考例および実施例をもって本発明を更に詳し
く説明するが、本発明はこれに限定されることはない。

参考例１ 呼吸欠損株の調製 ラボラトリ−・コース・マニュアル・フォー・メソッズ
・イン・イースト・ジェネティクス（Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　　Ｃｏｕｒｓｅ　　Ｍａｎｕａｌ　　ｆｏｒ　　
Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　　Ｙｅａｓｔ　　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ）［コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−
（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）、　１９８６　］に記載されている方法
に従って、エチジウムブロマイドを用いてサツカロミセ
スセレビシ−ｃ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＡ７４−３Ａからその呼吸欠損株
（ρ−）を分離しｔ：。

参考例２ 発現用ベクターｐＧＬＤ９０７Ｔの作製。

発現用ベクターｐＧＬＤ９０７Ｔは、発現用ベクターｐ
ＧＬＤ　　９０６−１　［１ｔｏｈ、　Ｙら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　１３
８　、２６８　（１９８６）１のＸｈｏ１部位に、プラ
スミドｐＧＬＤＰ３１ＲｃＴＣヨーＣｌ　ツバ出ｆＢ公
開０２３５４３０）カら得られる２　８７ｂｐ　Ｄｒａ
ｌ　−５ａＱＩ　　ＤＮＡ断片（ＰＧＫターミネータ−
）にＸｈｏｌリンカ−（ＣＣＴＣＧＡＧＧ）を付加させ
たＤＮＡ断片を、ＧＬＤプロモーターと順方向に挿入し
て作製された（第１図参照）。

実施例１　　ｇａｇ遺伝子の調製 公知のＨＴＬＶ−１プロウイルスＨＴＬＶＩ　Ｃ［Ｓ、
　Ｈ，Ｎａｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　、上３９．＋　２９（１９
８６）］から、Ｒｓａｌ及びＰｓｔｌを用いた部分分解
により３′側ＬＴＲ（一部）　−ｇａｇ−ｐｒｔ　　ｐ
ｏｐ　（一部）の領域を含有する２　、　３　ｋｂのＤ
ＮＡ断片を調製した。この断片をＳｍａｌとＰｓｔｌで
分解したｐＵＣ１１８（宝酒造製）に挿入した。次にこ
の組換えＤＮＡをＥｃ。

Ｒ１と　ＨｉｎｄＩＩ［で分解して２　、３　ｋｂのｇ
ａｇ遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製し、さらにこの断片
をＨ４ｎｃｌＩで分解して３′側ＬＴＲ（一部）−ｇａ
ｇ−ｐｒｔ（一部）を含有する１、５ｋｂのＤＮＡ断片
を調製した。次にこの断片をＤＮＡポリメラーゼ■・ラ
ージフラグメント（宝酒造製）で処理した後、Ｘｈｏｌ
リンカ−（ＮＥＢ社製）をＴ４ＤＮＡリガーゼで付加し
、ざらにＸｈｏｌで消化して、Ｘｈｏｌ　　５ｉｔｅを
露出させた（第２図参照）。なお、この断片に含まれる
　ｇａｇ遺伝子のＤＮＡ塩基配列は第３図に示した如く
である。

実施例２　発現プラスミドの構築−１ 実施例１で得られた両末端にＸｈｏｌ　　５ｉｔｅをも
つｇａｇ遺伝子を、Ｘｈｏｌで消化した酵母用発現プラ
スミドｐＧＬＤ　　９０６　１［Ｙ、Ｉｔｏｈら、　Ｂ
　１ｏｃｈｅｓ＋。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、４３８
．２６８　（１９８６）］に挿入して発現プラスミドｐ
ＨＴｌ５０１を作製した（第４図参照）。

実施例３　発現プラスミドの構築−２ 実施例１で得られた両末端にＸｈｏｌ　　５ｉｔｅをも
つｇａｇ遺伝子を、Ｘｈｏｌで消化した酵母用発現プラ
スミドｐＧＬＤ　　９０７Ｔ（参考例２に記載）に挿入
して発現プラスミドｐＨＴｌ５１１を作製した（第５図
参照）。

実施例４　酵母形質転換体の取得とその培養およびｇａ
ｇ蛋白質の発現 実施例２および３で得られたプラスミドｐＨ”ｒ１５０
１およびｐＨＴｌ５１１を用いて、酵母Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｎ　Ａ　７４　
３　Ａ　（ρ−）（参考例１に記載）をプロトプラスト
法［Ａ、　Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７５．１９２７（１９
７８）］によりそれぞれ形質転換し、形質転換体Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｎ　
Ａ　７４−３Ａ（ρ−）／ｐＨＴｌ　　５０１およびＳ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＮＡ７
４　３Ａ（／’つ／ｐＨＴｌ　　５１１を得た。

次にこれらの酵母形質転換体をそれぞれ５戒の培養液［
ＩＱあたり、Ｋ、ＨＰｏ、３ｇ、グルコース５Ｑｇ、７
スバラギ７４ｇ、Ｌ−ヒスチジ／ｌｏｏｍｇ。

Ｋｌ　　Ｏ，１ｍｇ、Ｍｇ５Ｏ＊・７Ｈｚ０　５００ｍ
ｇ、ＣａＣａｚ・２Ｈｚ０　３３０ｍｇ、Ｃｕ５Ｏ，・
５ＨｚＯ０−４ｍｇ、Ｆｅ５０．・７ＨｚＯ２，５ｍｇ
、ＭｎＳＯ４・４１（ｚｏ　　Ｏ，４ｍｇ、（Ｎ　Ｈ４
）３Ｐ　Ｏｉ　”　１２Ｍ０Ｏ３’　３ＨｚＯ０，２ｍ
ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０３，１ｍｇ、イノシトールｉ
□ｎ＋ｇ、チアミン０．２ｍｇ、ピリドキシンＱ、２ｍ
ｇ、Ｃａ−パントテン酸０．２ｍｇ、ナイアシン０．２
ｍｇ、ビオチン０．００２ｍｇを含む１中で３０°Ｃ２
３日間振とう培養を行った後、その０．５ｍｆｆを上記
の培地４　、５　ｍＱに移し、３０°Ｃ１１日間培養し
、更にその２厳を１８ｍＱの新鮮培地［ＩＣあたり、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４４００ｍｇ、シヨ糖８０ｇ、アスパラギン５
ｇ、Ｉ−−ヒスチジン３００ｍｇ、ＫＣｉ２２．０ｇ、
Ｋ　ＩＯ、１ｍｇ、ＭｇＳ　Ｏ，・７　Ｈｚｏ　　６５
０ｍｇ、ＣａｃＱ、、　ｊ２　Ｈ２０４２９ｍｇ、グル
コースｌＯｇ、トリスーマレイン酸（ｐＨ６−５）２５
ｍＭ、ＣｕＳＯ４・５Ｈｚ００．４ｍｇ、Ｆｅ５０．・
７ＨｚＯ２，５ｍｇ、Ｍｎ５Ｏ＝・４Ｈ２００，４ｍｇ
、（ＮＨ４）ｓｐｏａ・　１２Ｍ０Ｏ３”３　ＨｚＯＯ
，２ｍｇ、Ｚｎ５Ｏａ＋　７　ＨｔＯ３−１ｍｇ、イノ
シトール１０ｍｇ、チアミン０．２ｍｇ、ピリドキシン
Ｑ、２ｍｇ、Ｃａ−パントテン酸４．０ｍｇ、ナイアシ
ン４．０ｍｇ、ビオチン０．０４０ｍｇを含む］に移し
、３０°Ｃで振とう培養し、７２時間後にサンプリング
し、遠心分離機（１０，０００Ｘｇ、１０分間）にかけ
、それぞれ上清と菌体を分離した。

最後に上記の菌体（２０ｍｇ、湿重量）をそれぞれ１０
０μＱの５ＤＳ−ゲル・サンプル・バッファー　（Ｓ　
Ｄ　Ｓ　−ｇｅＱｓａｍｐｌｅ　　ｂｕｆ　ｆｅｒ）団
、　Ｋ、　Ｌａｅｍｍｌｉ。

Ｎａｔｕｒｅ、２２７．６８０（１９７０月に懸濁し、
１００°Ｃ，ｔＯ分間加熱して蛋白質を抽出した。

次にこの可溶化された蛋白質を１２．５％ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により分画し、引き続いて
公知のウェスタン・プロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ　
ｂｌｏｔｔｉｎｇ）法［Ｈ，Ｔｏｗｂｉｎら、Ｐｒｏｃ
。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７６．４
３５０（１９７９）］により蛋白質をニトロセルロース
膜上に移した。公知の抗ｐ１９マウスモノクローナル抗
体　Ｇ　Ｉ　Ｎ　　７　［Ｓ、　　Ｉｔａｍｕｒａら、
Ｇｅｎｅ、３８．５７（１９８５）］を用いてＨＴＬＶ
−１ｇａｇ蛋白質の発現を検索したところ、それぞれ５
３ＫＤａＱのｇａｇ前駆体の存在を確認した。

実施例５ 実施例４の方法に従ってＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｎ　Ａ　７４−３　Ａ（Ｐ−）／
ｐＨＴ　ｌ５１１を培養して得られた組換え酵母菌体（
湿重量５０ｇ）を１．２Ｍソルビトール、１４ｍＭの２
−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７，４）５０顧に懸濁し、２００μｇ／ｍ
Ｑのチモリアーゼ−１００Ｔ（生化学工業社製）を用い
て室温で１．５時間処理後、０．１％トリトンｘ−ｉｏ
ｏ、０　、１　ｍＭの（バラーアミジ／フェニル）メタ
ンスルホニルフルオライｌ’（Ａ　Ｐ　Ｍ　ＳＦ）を含
む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７。

４）２５Ｍで希釈し、室温で１．５時間放置し細胞を破
砕した。処理液を１４，０００回転／分で２０分間遠心
し上溝を除いた後、沈殿物に８Ｍ塩酸グアニジンを含む
１／１５０Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）１２５ｍ０
．を加え室温で２時間撹拌してｇａｇ前駆体を抽出し、
１４．０００回転で２０分間遠心することにより上溝を
得、粗抽出液とした。

上記の粗抽出液を０．５Ｍ尿素、０．２５％ノニデット
Ｐ４０．１５ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１ｍＭ７ｘ＝ルメタン
スルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、０゜１ｍＭ　Ａ
ＰＭＳＦを含むｌ／１５０Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，
０）で４０倍希釈した。希釈液を同緩衝液で平衡化した
５ＩＩｉＩ２のベツド容量をもつ抗ｐ１９マウスモノク
ローナル抗体ＧＩＮ−７［Ｔａｎａｋａら、ガン７４巻
、３２７頁１９８３年］を結合したホルミルセルロファ
イン（生化学工業社製）カラムに負荷した。ＨＴＬＶ−
１ｇａｇ前駆体は、カラムを希釈用緩衝液、続けて１Ｍ
塩酸グアニジンを含むｌ／１５０Ｍリン酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ７゜０）で洗浄した後３Ｍ塩酸グアニジンを含むｌ／
１５０Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７−０）でカラムから溶
出された。

抗体カラム溶出液をＹＭＣ−ＰＡＣＫ　Ｃ，（山村化学
製）を装備した高速液体クロマトグラフイ−に添着し、
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の存在下にアセト
ニｉ・リル濃度を２０％から１００％まで直線的に上昇
させることによって溶出した。ｇａｇ前駆体は、他の酵
母由来の蛋白質より遅れて約６５％のアセトニトリル濃
度で溶出された。溶媒を除去して得られたｇａｇ前駆体
の収量は１１７μｇであった。

このようにして得られたＨＴＬＶ−１ｇａｇ前駆体をド
デシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に負荷し、銀染色法により
染色すると第６囚人に示すように５１ＫＤａ４のバンド
が主として染色され、その他に５５．４６および４４Ｋ
ＤａＱのバンドが観察された。又、この銀染色像と、西
洋ワサビペルオキシデースを結合した抗ｐ１９マウスモ
ノクローナル抗体ＧＩＮ−７を用いるウェスタンブロッ
ティング染色像（第６図Ｂ参照）とはよく一致した。

発明の効果 本発明の方法により、ＨＴＬＶ−Ｉのｇａｇ抗原性を有
する蛋白質を大量に得ることができるので、該蛋白質を
診断用キットの材料あるいはＨＴＬＶ−Ｉワクチンとし
て用いるのに有利である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例３で用いるプラスミドｐＧＬＤ　　９
０７Ｔの構築図である。 第２図は、実施例１に記載のｇａｇ遺伝子（ＸｂｏＩ断
片）の調製方法を示す。 第３図は、ｇａｇ遺伝子のＤＮＡ塩基配列およびｇａｇ
蛋白質のアミノ酸配列を示す。（＊＊＊は翻訳終止コド
ンを示す。） 第４図は、実施例２で得られる発現プラスミドｐＨＴｌ
５０１の構築図である。 第５図は、実施例３で得られる発現プラスミドｐＨＴｌ
５１１の構築図である。 第６図は、実施例５で得られるＨ　Ｔ　Ｌ　Ｖ〜■ｇａ
ｇ前駆体の５ＤＳ−ＰＡＧＥ像である。（第６図Ａは銀
染色法により染色したときの５ＤＳ−ＰＡＧＥ像であり
、第６図Ｂはウェスタンブロッティング法により染色し
たときの５ＤＳ−ＰＡＧＥ像である。） 第 図 　　ＧＣＴ ＣＣＧ ＡＴＣＴＧＴ ＣＣＧ ＴＴ ＡＣ ＴＡＣＴＣＣＣＴＣ ＣＴＡ ＣＣＧ ＡＧＣＣＴＡ　ＣＴＣ Ｃ ＡＣＣＣＡＡ ＣＣＧ ＧＡＧ ＡＴＣ ＣＣＧ　　ＴＣＣ ＧＴＴ ＧＡＧ　　ＣＣＴ ＡＣＧ　　ＧＣＣ ＣＣＧ ＣＡＡ つづきあり 第 図 １６１　　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　
Ｇｉｎ　ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　
Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｍａｌ　　Ｇ１ｎ５５０　　
ＧＣＣＣＣＴ　ＧＧＧ　　ＡＧＣＣＣＣＣＡＧ　ＴＴＴ
　ＡＴＧ　ＣＡＧ　　ＡＣＣＡＴＣＣＧＧ　ＣＴＴ　Ｇ
ＣＧ　ＧＴＧ　ＣＡＧＡｓｐ　　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　　Ａ
ｓｐ　　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ
ＧＡＣＣＴＣＣＡＡ　　ＧＡＣＣＴＣＣＴＧ　　ＣＡＧ
　　ＴＡＣＣＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣ ＣＴＣ ＣＴＣ ＯＣＴ　　ＴＣＣ ２０９１１ｅ　　Ｓｅｒ　Ｇｌｔｘ　Ａｌａ　Ｇｉｕ　
Ｔｈｒ　Ａｒｇ６９４　　ＡＴＡ　　ＴＣＡ　ＧＡＧ　
ＧＣＣＧＡＡ　　ＡＣＣＣＧＡ　ＧＧＴ　　ＡＴＴ　　
ＡＣＡ　ＧＧＴ　ＴＡＴ　　ＡＡＣＣＣＡ　ＴＴＡ　Ｇ
ＣＣ２２５Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　、Ａｒｇ　Ｍａ
ｌ　　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　　Ｐｒｏ　Ｇ
ｉｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ７４２
　　　ＧＧＴ　　ＣＣＣＣＴＣＣＧＴ　　ＧＴＣＣＡＡ
　　ＧＣＣＡＡＣＡＡＴ　　ＣＣＡ、ＣＡＡ　　ＣＡＡ
　　ＣＡＡ　　ＧＧＡ　　ＴＴＡ　　ＡＧＧ２４１　　
Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　　Ｇｉｎ　、Ｇｌｎ　　Ｌｅ
ｕ　Ｔｒｐ　ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　Ｐｈｅ　　
Ａｌａ　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ７９０
　　　ＣＧＡ　　ＧＡＡ　　ＴＡＣＣＡＧ　　ＣＡＡ　
　ＣＴＣＴＧＧ　　ＣＴＣＧＣＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＧ
ＣＣＣＴＧ　　ＣＣＧ　　ＧＧＧＡｌａ　　５ｅｒ ＧＣＣＴＣＴ １１ｅ　　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｇ
ｌｕ　　ＧｌｕＡＴＣＣＴＣＣＡＡ　　ＧＧＣＣＴＧ　
　ＧＡ、Ｇ　　ＧＡＧＣＣＴ　　ＴＡＣＣＡＣ ＧＣＣＴＴＣＧＴＡ　ＧＡＡ ２８９　　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ
　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ９３４　　　ＣＴＧ　　ＣＣＡ　　
ＧＡＡ　　ＧＧＣＡＣＧ　　ＣＣＣＡＡＡ−）づきあり ＡＣＣ ＡＡＡ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＣＣ ＡＡＡ ＣＴＣ ＴＴＡ ＣＴＴ ＣＴＣ ＧＡＣ ＣＣＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＣＣ ＣＣに

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）成人Ｔ細胞白血病ウィルスのｇａｇ抗原性を有す
   る蛋白質をコードするＤＮＡを含有し、酵母内で複製可
   能であることを特徴とする該蛋白質の発現プラスミド。
2. （２）請求項１記載のプラスミドを用いて形質転換させ
   た酵母。
3. （３）請求項２記載の酵母を培地に培養し、培養物中に
   成人Ｔ細胞白血病ウィルスのｇａｇ抗原性を有する蛋白
   質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とす
   る該蛋白質の製造法。