JPH0443638B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、たとえば微生物細胞培養物の発酵ブ
ロスおよび哺乳動物細胞培養物の消費された培地
といつた細胞培養系より血しよう蛋白質を分離す
る方法に関している。 ヒト血しようまたは血清中に存在する種々の種
類の蛋白質を分画して分けることは、多年にわた
り、医および薬学分野の科学者の関心事であつ
た。この関心事の重要の部分は、血液の凝固に関
与する血しよう成分、つまり血液凝固因子の分離
である。大きな医学的興味のある他の血液蛋白質
成分は、抗体活性の担い手であるガンマーグロブ
リンおよび血しようのコロイド滲透圧の主要な調
節物であるアルブミンである。 これらの血しよう蛋白質種のもつとも重要な部
分は、今日では、ヒトから得られる血液を天然材
料として採取されている。血しよう蛋白質を分離
することの重要性のひとつの例として、抗血友病
性因子（AHF：フアクター）商業的に供給す
ることである。止血および血液凝固におけるフア
クターの重要性はよく知られている。先天性の
凝血障害を有する患者の大部分はフアクター欠
乏を有する（血友病Ａ患者）。他方、人数は少な
いがフアクター欠乏の者もいる（血友病Ｂ患
者）。または、他のマイナーの凝固定因子を欠く
者もいる。このような血液凝固の欠陥にある患者
には、以前は、全血、またはなるべくは、フアク
ターまたはフアクターを高レベルに含有する
ように精製した血しよう投与が行なわれた。
Judith Pool，New Eng.J.Med. 274.1443−47
（1965）により開発されたクリオプレシピテート、
あるいはさらに濃厚な分画たとえば、U.S.特許
3415804，3631018，4089944およびRe29698に記
載の方法で製造される。Hemofil AHFのよう
なさらに濃厚な分画は、高いフアクター含量の
市販品として入手しうる分画の代表的な例であ
る。しかし、これらの市販される分画は、材料の
入手しやすさ、つまり提供血液の供給が限定され
るという問題がある。 伝統的な微生物学的手法に応用される。最近開
発された遺伝子工学および分子生物学の手法を用
いて、今や、微生物種のなかに哺乳動物の血しよ
う蛋白質を生産することが可能である。遺伝子ス
プライシングの主要な設計者は、この方法を種々
の血しよう蛋白質たとえば抗血友病蛋白質、ガン
マーグロブリン、アルブミン、フイブリノーゲン
およびプロトロンビンの生産に応用しうることを
示した。CohenおよびBoyer U.S.特許4237224.
col.9をみよ。遺伝子工学における初期の実際的
仕事は、ソマトスタンチおよびインスリンのよう
な比較的小型の蛋白質の生産に限定されていたけ
れども、細菌および酵母において異物蛋白質を生
産するための遺伝子スプライシングの基本原理
は、より大型の蛋白質の製造に適用しうることが
示された。それで、すでに生産された比較的大型
の蛋白質がリコンビナント微生物で製造されてい
る。たとえばGer.Offen.2923297および2933000お
よびFv.Demavde2458585および2476126に記載の
ように分子量約43000の卵アルブミンおよび
Lawn等、Nucleic Acids Res.9（22），6103−
6114（1981）に記載のような585アミノ酸鎖のヒト
血清アルブミンがある。 細胞培養系から血しよう蛋白質を分離するため
の有用な方法を開発する必要が、本発明者によ
り、認められた。他の蛋白質および細胞成分、代
謝物、細胞のかすおよび類似の、発酵ブロスおよ
び消費された培地中に存在する物質との混合物よ
り、特異的な望む蛋白質のいずれかを分離するこ
とには、大きな困難をともなう。これまで、発酵
ブロスおよび消費培地より蛋白生成物を採取し単
離するのに種々の操作が用いられた。たとえば細
胞または細胞構成成分より、細胞壁または膜を機
械的、物理的または化学的に破壊したあと、水お
よび有機溶媒で抽出する。 （NH₄）₂SO₄の塩を用いるか、エタノール、メ
タノールまたはイソプロパノールのような有機溶
媒を用いるか、ポリエチレングリコールおよびデ
キストランのような高分子量合体を用いるか、ま
たは金属イオンおよび錯化合物を用いるか、また
は温度差およびPH条件で沈殿させる。 コロイド物質たとえばベントナイト、リン酸カ
ルシウム、硫酸バリウム、ヒドロキシアパタイ
ト、活性炭、シリカまたはAl（OH）₃ゲルに吸着
させる。 キーゼルグールおよび他のけいそう土のような
濾過助剤を用いるかまたは用いないで濾過した
り、遠心したり、または超濾過する。 Sephadex （架橋デキストラン）ゲル、
Sepharose （アガロース）ゲルおよびDEAE−
SephadexまたはDEAE−セルロースイオン交換
樹脂のような材料を用い、ゲル濾過およびイオン
−交換クロマトグラフイーする。 電気泳動および超遠心 脱塩、濃縮および乾燥にような完成操作があ
る。 蛋白質の採取および分離のためのより最近にな
つて開発された方法には、イムノアフイニテイク
ロマトグラフイーがある。特定の蛋白質に親和性
を有するモニクロナル抗体多糖類のビードに付着
させうる。ビードをクロマトグラフのカラムに用
いる。粗蛋白質溶液をカラムに通すと、望む蛋白
質分子はビードに吸着され、不純物および不要な
物質はカラムを通過する。適当な洗浄溶液を用い
PHを調節し、望む蛋白質をカラムより溶出する。 本発明の記載 本発明では、水に不溶の架橋されたポリ電解質
共重合体に吸着させて、細胞培養系中の混合物よ
り血しよう蛋白質を分ける。これらのポリ電解質
共重合体は、２から約４炭素原子数のオレフイン
状不飽和の単量体と、４から約炭素原子数のα，
β不飽和ポリカルボン酸または無水物の共重合体
で、懸垂するジ低級アルキルアミノ低級アルキル
イミド官能基を有している。 本明細書中で使用する。低級アルキル基とは、
約１から約４炭素原子数のアルキル基を意味す
る。 適当なオレフイン状不飽和単量体の例には、エ
チレン、プロピレンおよびイソブチレンがある。
適当なα，β不飽和ポリカルボン酸または無水物
の例には、マレイン酸、シトラコン酸、イタコン
酸、アコニツト酸または無水物がある。これらの
単量体成分のうちで、エチレンおよび無水マレイ
ン酸が共重合体の形成に有利である。共重合体
は、さらに、２つの単量体成分を実質的に等モル
量含有するのが有利である。 共重合体を架橋させて 水不溶性とするには、
たとえば、ジビニルベンゼンおよびエチレンジア
ミンのような従来から使用の架橋剤を用いる。有
利な架橋剤は、上記定義のような低級アルキル基
を有する低級アルキルイミノビス（低級アルキル
アミン）である。 本発明で使用するポリ電解質共重合体は、U.S.
特許3554985；3555001；4081432；4097473；
4118554；および4157431に記載の方法で製造しう
る既知の化合物である。たとえば、エチレンと無
水マレイン酸（EMA）との有利な共重合体は、
有機溶媒媒体の適当なもののなかで過酸化物触媒
の存在でエチレンと無水マレイン酸とを反応させ
製造しうる。生ずるベースとしてのEMA共重合
体は、２個の１級アミノ基を有し、架橋された
EMA共重合体を与える。低級アルキルイミノビ
ス（低級アルキルアミン）のような架橋剤と反応
させうる。なるべくは、EMAは約３モル％から
７モル％の架橋剤と反応させる。望む懸垂ジ低級
アルキルアミノ低級アルキルイミド官能基は、つ
いで、ジ低級アルキルアミノ低級アルキルアミン
と、EMA共重合体の残存する遊離無水物基の１
部またはすべてと反応さすことにより架橋された
共重合体中に導入しうる。本発明において使用す
るポリ電解質共重合体吸着剤を調製するには約３
モル％から約100モル％までのジ低級アルキルア
ミノ低級アルキルアミンを用いる。 有利なジ低級アルキルアミノ低級アルキルアミ
ンはジメチルアミノプロピルアミンで有利な架橋
剤はメチルイミノビス（プロピルアミン）であ
る。 ポリ電解質共重合体はまた、凝集段階にU.S.特
許4118554に記載の方法を用い、そして、残存す
る遊離カルボキシルまたは無水物のサイトがあれ
ば、U.S.特許4157431に記載のようにアルコキシ
アルキルアミンでこれらのサイトをブロツクする
方法で製造しうる。ここでのアルコキシおよびア
ルキルは、なるべく１から４炭素原子数で、もつ
とも有利なブロツク剤はメトキシプロピルアミン
である。 了解されると思うが、ポリ電解質共重合体吸着
剤製造の上記方法の記載は説明のためのみであつ
て、本発明により細胞培養系より血しよう蛋白質
を分ける方法が、特定の方法で製造されたものに
限定されてしまうわけでない。 血清および血しようを分画するのにポリ電解質
共重合体が有用なことはすでに知られていたが、
種々の蛋白質、ペプチド、核酸および類似の細胞
培養成分と血しよう蛋白質が混合している。微生
物細胞培養物の発酵ブロス、哺乳動物細胞培養の
消費された培地および他のそのような複雑な細胞
培養系より血しよう蛋白質が分離する能力をポリ
電解質共重合体が有することは知られてもいなか
つたし、示唆されてもいなかつた。本明細書に使
用する細胞培養系は、たとえば、細胞の融解物ま
たは抽出物のような培養細胞より遊離される材
料、または発酵ブロス中に生産されるか導入され
る材料、または消費された培地、または、それら
の１部分で、望む血しよう蛋白質を含有している
ものとする。 本発明方法は、細胞培養系より、血しよう中に
ふつうに見出だされる蛋白質のいずれをも分離す
るのに用いうる。このことは以降の詳細な例で説
明するが、ここで、細菌、酵母および肝臓の細胞
培養系よりの血液凝固蛋白質つまりヒト血しよう
のフアクターの分離、細菌および酵母細胞培養
系よりの別の血しよう蛋白質、つまりヒト血清ア
ルブミンの分離の例を示す。別の血しよう蛋白質
たとえばα₁−アンチトリプシン、α₂−マクログロ
ブリン、フイブロネクチン、セルロプラスミン、
Ｃ−反応性蛋白質、トランスフエリン、フイブリ
ノーゲン、ポロトロンビン、血しようトロンボプ
ラスチン成分およびガンマーグロブリンもまた。
本発明方法により細胞培養系より分けうる。細胞
培養系における血しよう蛋白質の由来は、培地中
に外部から加えたもの、たとえば血しよう蛋白質
生長因子、馬、牛または羊の血清または牛胎児血
清のような全血清、または栄養成分や類似のも
の、または遺伝子工学的に細胞培養による血しよ
う蛋白質の特異的生産によるものでありうる。 細胞工学による微生物では、最初の遺伝子工学
は、つぎの４つの代表的リコンビナントDNA要
素を用いうる。 １ 種々の由来のDNA分子を切断しそして連結
するための手段。 ２ 自身のDNAおよびそれに連結させたよそ者
のDNAフラグメントの双方を複製させうる適
当な遺伝子担体。 ３ 複合DNA分子を機能する細菌または酵母細
胞に導入するための手段、および ４ リコンビナントDNA分子を獲得した受容細
胞のクロンを、多数の細胞から選び出す手段。 たとえば、pSC101の細菌性プラスミドをよそ
者または外部からの遺伝子を宿主細菌中に導入す
るのに用いうる。宿主細菌の例としては、たとえ
ば、the American Type Culture Collection，
Rockville Marylandより受入番号ATCC31244
として入手しうるEscherichia coliＫ−12α1776が
ありうる。プラスミドは制限エンドニユクレアー
ゼまたは他のDNA切断酵素たとえばEcoRで切
断して、インタクトのレプリコンおよび接着末端
を有する直鎖状のDNAフラグメントとなしうる。
望むよそ者遺伝子または外部遺伝子を有し、所定
のフエノタイプ的性質および相補的で連結させう
る末端を有する第２のDNAフラグメントを、よ
そ者細胞より採取しうるかまたは合成しうる。こ
の第２のDNAフラグメントと第１のDNAフラグ
メントとを、DNAリガーゼまたは他のDNA連結
剤たとえばT₄DNAリガーゼでスプライシング
し、相補的な閉じた、再環状化されたプラスミド
とする。上例のプラスミドのEcoRサイトに第
２のDNAフラグメントを導入すると、プラスミ
ドの調節要素であるlacオペロンの調節下に遺伝
子情報が発現する。生ずる組換プラスミドを用い
て細菌細胞を形質転換し適当な培地中に細菌を培
養して複製させる。フエノタイプの性状による分
別で望む転換細胞を分離する。たとえば、特定の
発育阻止物質たとえば抗生物質に対する抵抗性ま
たは種々の形態上の差を利用する。 微生物に哺乳動物の血しよう蛋白質を発現さす
のに上記の一般的原則を応用しうることは、実際
に、Lawn等が、Nucleic Acids Res. ９（22）、
6103−6114（1981）に記載したような、リコンビ
ナント細菌を用いるヒト血清アルブミン（HSA）
の生産により説明される。この記載の方法による
と、HSA遺伝子の完成蛋白質コード領域を含有
するように、従来法によりリコンビナントプラス
ミドpHSAが構成された。このリコンビナント
プラスミドベクターを含有する細菌は、E.coli染
色体のトリプトフアン合成に関与する酵素をコー
ドする領域である。E.colitrpプロモーター−オ
ペレーターの調節下にHSA蛋白質を合成する。 pHSAプラスミド構成にためには、HSA
mRNAの蛋白質をコードする全配列および3′の
非翻訳部分にわたるcDNAを分離する。最初の
cDNAクローンは、適当なオリゴデオキシチミジ
レート、つまりオリゴ（dT）_12-18
（Collaborative Research）を用いヒト肝臓
RNAをプライミングして得られた。これらの
cDNAを用いて、プラスミドpBR322配列および
E.colitrpプロモーター−オペレーターおよびプ
ラスミドpLeIF Ａ 25に由来する。人為的平滑
末端を有するXba切断サイトに終る。trpリー
ダーペプチドのリボゾーム結合サイトの300bpフ
ラグメントを含有するベクターフラグメントより
リコンビナントプラスミドを構成した。pLeIF
Ａ 25プラスミドはヒト白血球インターフエロン
Ａ（IFNα ２）の発現をみちびき、Goeddel等が
Nature287、411−416（1980）に記載した。E.coli
trpプロモーター−オペレーター領域もまた、
Ger.Offen.3020528、日本公開特許公報8061798.
Eur.Pat.Appl′n36776およびRusselおよび
Bannet，Gene 17（１），９−18（1982）に記載さ
れている。プラスミドpBR322は、性質の明確な
市販されているプラスミドで、分子量は2.6×10⁶
である。10個以上の独特の制限サイトを有し、そ
れは、アンピシリン抵抗性（Ap）遺伝子内にた
だひとつのPat制限サイトおよびテトラサイク
リン抵抗性（Tc）遺伝子内に位置する。制限エ
ンドニユクレアーゼEcoR，Hind，BanH
、およびSalに対する単一サイトを含有する。
これらの単一制限サイトの重要性は、配列
5′CTGCA↓G3′の５番目と６番目の塩基のあい
だを切る制限エンドニユクレアーゼPsTにより
認識されるひとつのサイトであるということから
も分るであろう。pBR322中にはひとつだけの
Pstサイトがあるので、短かい一重鎖の3′末端を
有する直線状プラスミドを与える。このプラスミ
ドはさらにBolivar等がGene ２，95（1977）に記
載しており、その制限エンドニユクレアーゼマツ
プはSutcliff，Nucleic Acids Res. ５，2721−2728
（1978）に記載されている。これは、E.coliRRI，
NRRL Ｂ−12014よりうることができるが、そ
の培養物のひとつは、the Norther Regional
Research Laboratory，U.S.Department of
Agriculture，Peoria，Illinois U.S.A.の永久的
コレクシヨンに寄託されている。 Ｆ−47，Ｆ−61、およびＢ−44と称するいくつ
かの重複しているオリゴニユクレオチドリコンビ
ナントフラグメントが、上記の研究者による
cDNAクロンより選択され、上記のpBR322変型
ベクターフラグメント中に挿入するための適切な
DNA鎖となつた。フラグメントブロツクの補的
な接着末端により、望む構造遺伝子のメツセージ
配列全体を３つの部分より構成することが可能と
なつた。得られる完成されたリコンビナントプラ
スミドpHSAは、プラスミドのpBR322部分に
TcおよびAp遺伝子およびE.colitrpプロモーター
−オペレーター領域を含有するのみならず、
cDNAクロンＦ−47，Ｆ−61およびＢ−44に由来
するHSAコード領域を含有した。リコンビナン
トプラスミドpHSA中の他の選択された制限エ
ンドニユクレアーゼサイトは、単一のEcoRお
よびBgl制限サイトおよび２個のXbaおよび
Pst制限サイトであつた。 この変型されたプラスミドpHSAを用いてE.
coliＫ−12菌株294を変型した。pHSAを含有
するE.coliをトリプトフアンを欠く最小培地に発
育させると、HSA抗体と特異的に反応し、SDS
ポリアクリルアミド電気泳動でHSAと共に移動
する蛋白質を生産すると報告された。 リコンビナントプラスミド中に適当な遺伝子情
報を導入することにより、微述物細胞培養系中に
種々の血しよう蛋白質を同様に発現さすために、
他のプラスミドベクターを同様に構成しうる。そ
れで、望む蛋白質のポリペプチドアミノ酸配列を
コードするDNAを、遺伝コードによりコドンを
選択することにより調製しうる。組立てられた遺
伝子はついで発現プラスミド中に挿入し、上記の
HSAの例と同じ方法で微生物宿主中で複製させ
うる。 哺乳動物蛋白質を遺伝子工学的に生産するのに
応用しうる微生物宿主バクター系の代表的な例に
は、HSAの生産のための上記したE.coliＫ−12宿
主ベクター系以外につぎのものがある。 他のEscherichia株および他の
EnterobacteriaceaeたとえばSalmonella； Bacillus種、たとえばB.subtilis. B.
megatherium，B.cereus，B.pumilus，Ｂ，
amyloliquefaciens，B.licheniformisおよびB.
globigii； Streptomyces種、たとえばS.coelicolor，S.
fradiae，S.parvulus、S.lividans、S.griseus，S.
albus、およびS.phaeochromogenes Staphylococcus種、例えばS.aureus；および
酵母、たとえばSaccharomyces cerevisiae，
Saccharomyces carlsbergensisおよび
Schizosaccharomyces pombe 今や宿主の染色体中に組込まるべきリボソーム
性または任意の他の遺伝子に、見かけ上いかなる
DNA断片を連結されうることは明らかである。
Axelおよび協同研究者は培養哺乳動物細胞中に、
よそ者DNAが取り込まれ発現されうるとを示し
た。Science 209，1414−1422（1980）。このような
技術は、E.coliまたは他の微生物宿主中には発現
されないが、哺乳動物または他の脊推動物細胞に
おいて顕著なフエノタイプを有する遺伝子を分離
するのに有用である。このようにして、転換され
たDNAは染色体DNA中に組込まれる。転換
DNAはまたはシミアンウイルス40（SV40）ベク
ターを経由して培養細胞中に導入されうる。それ
で、SV40ウイルスは、多くの原核細胞遺伝子を
哺乳動物細胞にてクロニングするためのベクター
として用いられた。MulliganおよびBerfg，
Science209，1422−1427（1980）。実際、リコンビ
ナントDNAの方法論が初めて証明されたのは、
SV40へのE.coliガラクトースオペロンの導入で
あつた。Jackson等、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A
69，2904−2909（1972）。ヒト染色体の規定された
領域よりクロン化DNAを分離する他の方法は、
Gusella等によりProc.Natl.Acod. Sci.U.S.A 77
（５），2829−2833（1980）に記載されている。 理解されうるように、本発明は、遺伝子工学に
より血しよう蛋白質を提供するために特定の宿主
ベクター系に限定されない。その理由は、血しよ
う蛋白質を培養系に導入する方法のいかんにかか
わらず、適当な細胞培養培地中に細胞を発育させ
たあとの細胞培養系より血しよう蛋白質を分離す
ることに本発明は関与しているからである。 細胞培養培地の元素的組成は、細胞塊および細
胞生成物を構成するための基本的必要条件をみた
しその合成および維持に適当なエネルギーを供給
するものとする。たとえば、微生物細胞のための
代表的元素組成はつぎにようでありうる。 元 素 細胞乾燥重量中の％ Ｃ 50 Ｎ ７−12 Ｐ １−３ Ｓ 0.5−１ Mg 0.5 それで。適当な培地とは、特定の細胞の発育の
ための上記した元素上の必要条件をみたしうるも
のとなる。小規模微生物細胞培養のための従来か
ら用いられている培地は、ふつう、肉または魚の
酵素水解の可溶性生成物である肉消化物（トリプ
シン消化物、ペプトン、ニユトリエントブロス）
を基礎としている。ビタミンおよび補酵素（ふつ
うmg／リツトル量）を提供するために、培地には
しばしばさらに、肉エキス（ミートインフユージ
ヨン）または酵母エキスを加える。NaCl，K₂
HPO₄およびMgSO₄の無機塩および種々のアミ
ノ酸も必要に応じて加える。血液寒天培地では、
血液がさらに追加の養分を提供する。血清もまた
用いうる。ここでアルブミン成分は、保護的な非
栄養分性の発育因子となる。グリコース、ラクト
ース、およびマルトースのような炭素化合物は、
元素炭素への細胞の要求および必要なエネルギー
を提供する。 さらに例として、E.coliに対する代表的最小培
地はつぎのようである。 物 質 ｇｍ／ｌ K₂HPO₄ 7.0 KH₂PO₄ 3.0 Na₃サイトレート・3H₂Ｏ 0.5 MgSO₄・7H₂Ｏ 0.1 FeSO₄ 0.01 （NH₄）₂SO₄ 1.0 グリコース 2.0 大規模の発酵においては、ホエイ、分解コンス
ターチ、コーンシュガー、糖密、Carelose 、小
麦ふすまといつた炭水化物材料および他の利用し
うる炭素原、醸造酵母、大豆蛋白質、カゼイン、
尿素、アンモニウム塩、硝酸塩、他の利用しうる
窒素原といつた窒素性材料より適当な発酵培地を
物質しうる。これらの発酵培地成分の原料は、粗
物質でもより精製した物質でもよい。Ｎ−Ｚ−
Amine 蛋白質水解物、コーンステイープリカ
ーおよびデイステイラースソルブルは、微生物細
胞培養系に有用な栄養成分を提供する、市販品と
して入手しうる複合材料である。Ｎ−Ｚ−
Amineは、らく農専業の副産物である。カゼイ
ンに酵素消化物である。コーンステイープリカー
は、コーンターチ製造の副産物で、種々に蛋白水
解物、Ｂ−複合ビタミン、アミン、および他の有
機物および無機物質を含めた複合物質を含有す
る。デイステイラースソルブルは、アルコール飲
料製造の副産物である。 微生物の必要としうる微量栄養成分は、ふつう
主要な発酵培地成分中に存在するので、微量成分
を別に添加する必要はふつうない。たとえば、金
属の塩化物、硫酸塩、リン酸塩および硝酸塩は、
主要な炭素および窒素成分とあわせて発酵培地中
に存在するのがふつうである。 同様に、哺乳動物および他の脊推動物の細胞の
発育のための適当な培地は、同化しうる。窒素
原、炭素原および無機塩を含有する。これらは、
よく知られている組織培養の培地たとえば、
Basal Medium Eagle′s（BME），Eagle′s
Minmum Essential Medium（MEM），
Dulbecco′s Modified Eagle Media，
Medium199、そしてバランスト サルト ソル
ーシヨウン（BSS）たとえば、種々の栄養成分で
強化されたEagleおよびHanks培地がある。これ
らは市販品として入手しうる培地で、H.J.
Morton，In Vtro689−108（1970）に詳記されて
いる。これらの従来法による培地は、既知の不可
欠アミノ酸、無機塩、ビタミンされている炭水化
物を含有する。それらはしばしば、牛胎児血清の
ような哺乳動物血清で強化される。 血しよう蛋白質の生合成における肝臓の支配的
役割から、肝臓細胞は、本発明のひとつの特徴に
従い、培養血しよう蛋白質成分を分離するための
遊離な哺乳動物細胞である。血液の凝固に関与す
る血しよう成分の場合に、腫瘍細胞の培養物は本
発明で特に有用である。つまり、腫瘍患者には、
凝固異常がふつうに観察され、ヒトおよび動物中
での多くの１次的および移植腫瘍のまわりにフイ
ブリンが沈着することが報告された。たとえば、
Dvorak等、Science，212，923−924（1981）をみ
よ。また、培養肝臓癌細胞からアルブミンをうる
こともできることが知られている。 哺乳動物細胞培養系より血しよう成分を分ける
ことを、ヒト肝臓アデノカルシノーマセルライン
SK−HEP−の細胞培養系よりヒトフアクター
を分けることを例として説明する。確立された
セルラインSK−HEP−は、1971年にSloan−
Kettering Institute for Cancer ResearchのG.
Trempeにより肝アデノカルシノーマより得られ
このセルラインの培養物はこの研究所より入手し
うる。 セルラインSK−HEP−の確立および特徴に
ついてはつぎのような文献がある。 FoghおよびTrempe，“New Human Tumor
Call Lines”，Human Tumor Calls In Vitro
（Fogh，ed.），Plenum Publ.Corp.，New
York，1975，pp.115−54； Fogh et al.，J.Nat′l.Cancer Insts．58，209
−14（1977）； Fogh et al.，J.Nat′l Cancer Inst．59，221
−25（1977）。 細胞培養系よりフアクターを分けるための本
発明のひとつの具体例として、ポリ電解質は、約
３モル％から約７モル％の懸垂するジ低級アルキ
ルアミノ低級アルキルイミド官能基を含有する。
約３モル％から約10モル％までの低級アルキルイ
ミノビス（低級アルキルアミン）で架橋された、
エチレンと無水マレイン酸との共重合体がある。
そして、これは、残存する遊離カルボキシルまた
は無水物サイトの実質的にすべてがアルコキシア
ルキルアミンでふさがれていることを特徴とす
る。有利なのは、共重合体はメチルイミノビスプ
ロピルアミンで架橋させ、懸垂する基がジメチル
アミノプロピルイミドの場合である。この具体例
の分離プロセスで用いるポリ電解質の濃度は、１
部には、処理する細胞培養系中のフアクターの
量に依存するが、一般的に、約１から約10重量
％、そしてなるべくは約５から約６重量％の濃度
にポリ電解質を用いてすぐれた結果を得られた。
細胞培養系のPHはなるべくは、フアクターの吸
着の段階で約5.5から約6.5に調整する。 吸着されたフアクターの上清よりの分離は、
濾過、遠心、および類似の分離操作で実しうる。
フアクター蛋白質の溶出は、約１から約３モル
のNaClなるべくは約1.5から約1.8モルのNaCl、
および他の生理的に許容されうる溶出液を用いて
行なう。 細胞培養系よりアルブミンを分離する、本発明
の別の具体例として、ポリ電解質はなるべくは、
フアクターについて上記したのと同様とする
が、懸垂する官能基の含量は約90モル％から約
100モル％までとし、残存する遊離カルボキシル
または無水物のサイトは、ふさがれていても、そ
のままでもよい。この具体例での分離プロセスに
用いるポリ電解質の濃度は、部分的には、処理さ
れる細胞培養系中のアルブミンの量によつて変化
するが、一般的に、約0.01から約20重量％の濃度
に用いてよい結果を与える。細胞培養系のPHは、
アルブミン吸着段階のあいだ約6.5から7.5に調整
する。上清よりの吸着されたアルブミンの分離お
よび、吸着剤よりのアルブミンの溶出はフアクタ
ーについて上記したような様式で実施しうる。
溶出段階でPHを約3.5から約4.5に調整し、約0.01
から約0.1モルのNaClで溶出するのが有利であ
る。 つぎに実施例を示して本発明を説明するが、本
発明がこれにより限定されるわけでない。 例 １ この例は、ポリ電解質共重合体に吸着させ、細
胞および酵母培養物よりヒト血しようフアクタ
ーを分解することを説明する。 Escherichia coli細菌およびSaccharomyces
cerevisiae酵母の細胞をつぎの条件で培養し処理
した。 ＡE.coli の培地：Luria Broth 17.5ｇNaCl 17.5ｇ酵母エキス（Difco） 35.0ｇBacto−tryptone（Difco） 4.2ml 2N NaOH 3500ml脱イオン蒸留水 上記の材料をかくはん溶解し、溶液は30分オー
トクレーブした。E.coli 菌株：K12 培養：上記培地中に37℃で48時間 出発時の濃度：５mlの寒天斜面より3500mlの上記
培地に懸濁 最終濃度：５×10ｇ細胞／ml 細胞は、Beckman J2−21冷凍遠心機で3500rpm
で10分遠心 採取された細胞不含上清：3000ml 採取された細胞：14.44ｇ 細胞の破壊：８ｇの細胞を、82.740Kilopascal／
回で４回、１フレンチプレス中で破壊 Ｂ 酵母用培地：YEPD 溶液 (1)：25ｇ酵母エキス（Difco） 70ｇBacto−peptone（Difco） 3150mlの脱イオン蒸留水 溶液 (2)：70ｇデキストロース 350mlの脱イオン蒸留水 溶液 (3)：3.5ｇの（NH₄）₂SO₄ 17.5mlの脱イオン蒸留水 溶液(1)および(2)
は別々にオートクレーブした。溶液(1)および(2)は
温かいうちに減圧で、溶液(3)とつぎの割合に合併
した。 ６×450ml溶液(1) 50ml溶液(2) 2.5ml溶液(3) 酵母菌株：M25 培養：上記培地中でかくはんしながら30℃で48時
間 最初の濃度：1.5mlの寒天斜面培養物を上記培地
の3500mlに懸濁 最終濃度：５×10ｇ細胞／ml 細胞は冷凍Beckman J2−21遠心機中で10分間
3500rpmで遠心 採取された細胞不含上清：2500ml 採取された細胞：28.0ｇ 細胞の破壊：103425キロパスカル／回で４回フレ
ンチプレス中で８ｇの細胞を破壊 市販の、高度に精製された、ヒト血しようフア
クター濃厚液（Hemofil AHF U.S.特許
3415804；3631018；4089944およびRe.29698に従
つて処理、Travanol Laboratories社）を10mlの
滅菌水で再構成し、上記の細胞不含上清および上
記の破壊細胞の生理食塩水中懸濁液（30−190ml
の割合）中でインキユベートした。次の水不溶性
架橋ポリ電解質重合体（樹脂Ａ）により、それぞ
れの懸濁液からフアクターを吸着分離した。 樹脂Ａは５モル％のメチルイミノビス（プロピ
ルアミン）で架橋されて、モル％の懸垂ジメチル
アミノプロピルイミド基を含有する。エチレンと
無水マレイン酸との実質的等モルの量の共重合体
である。遊離カルボキシル基または無水物の基の
すべては、さらに、メトキシプロピルアミンでふ
さがれている。このポリ電解質共重合体は、U.S.
特許4157431の例１記載のような反応剤を示した
モル割合で用いて製造した。 使用前、樹脂Ａは、つぎのように予備的に条件
づけした。 0.1％の牛血清アルブミン（BSA）を安定剤と
して含有する200mlの0.154MのNaCl中で12グラ
ムの樹脂Ａをスラリーとした。（ヒト血清アルブ
ミンも、BSAに代えて用いうる。）1Mくえん酸
でPHを4.0に調整したスラリーは、プラスチツク
ブツフナー濾斗上でWhatmanNo.54濾紙を通して
濾過した。濾液はすでに、ポリ電解質共重合体ケ
ーキを、0.1％のBSAを含有する200mlの0.154M
のNaCl中にスラリーとした。ついで1NのNaOH
をPHを5.8に調整し、PH5.8で10分かくはんした。
スラリーはふたたびプラスチツクブツフナー濾斗
上ワツトマンNo.54濾紙を通して濾過した。濾液を
すてポリ電解質共重合体ケーキを採取し、下記の
ように用いた。 分離プロセスはつぎのように実施した。 Sigma Chemical社よりのアプロチニンプロテ
アーゼ阻害剤（１ml、つまり、10−20トリプシン
阻害剤単位）を安定剤として、プラスチツクビー
カーに入れた、上記調製のE. coli培養物上清の
190mlに加えた。３かた５分かくはんしたあとで、
再構成Hemofil AHF（フアクターの264単位）
の10mlを加え、混合物はかくはんし、試料(a)と同
様に分析して、最初のベースラインレベルを設定
した。この混合物を、上記に採取したポリ電解質
重合体ケーキに添加し、1Mくえん酸でPHを5.8に
調整し、PH5.8で20分かくはんした。スラリーは
プラスチツクブツフナー濾斗上、ワツトマンNo.54
濾紙を通した。ポリエチレンケーキを乾燥し破壊
する前に、濾液容量を測定し、試料(b)を採取し
た。ついで0.1％のBSAを含有する200mlの
0.002M NaClをポリエチレンケーキにゆつくり
加えた。濾液をすて、ケーキは、0.1％BSAを含
有する0.3MのNaClの200ml分散させた。PH5.8で
５分かくはんした。スラリーは、プラスチツクブ
ツフナー濾斗上、ワツトマンNo.54濾紙を通して濾
過した。ポリ電解質重合体ケーキを乾燥粉砕する
より前に、濾液容量を測定し、試料(c)を採取し
た。0.1％BSA含有200mlの0.3MのNaClを用いて
ポリ電解質ケーキを洗い、濾液をすてた。ポリ電
解質ケーキは、安定剤として0.1Mのリジンおよ
び0.1％のBSA安定剤を含有する。200mlの1.5M
のNaCl中に分散させた。1MのNaOHでPHを6.0
に調整し、スラリーをPH6.0で20分かくはんした。
スラリーは、プラスチツクブツフナー濾液上ワツ
トマンNo.54濾紙で濾過した。ポリ電解質共重合体
ケーキにすて、濾液は、ブツフナー濾斗上ワツト
マンNo.１濾紙を通して濾過した。生ずる濾液の容
量を測定し、試料(d)を分析のために採取した。 上記の酵母培養物の細胞不含上清および上記の
E.coliおよび酵母の破壊された細胞懸濁液を用い
て、上記のポリ電解質吸着操作を反復した。 MLA Electra750Coagulation Timer
（Medical Laboratory Automation社）上、従
来法による１段階活性化PTT（部分的トロンボプ
ラスチン時間）アツセイシステムにより、上記採
取の試料のフアクターを分析した。なお、１段
階PTTアツセイシステムのさらに背景となる情
報については、Quick，“Hemorrhagic
Diseases”，Lea ＆ Fabiger，Philadelphia，
Pa.，1957；Langdell等、J. Lad．Clin．Med．
41．637（1953）；およびHardisty等、Thromb．
Diath.Haemorrh，７．215（1926）を参照された
い。 この装置は、凝集プロセスの開始を示すのに光
学センシングを用いる。これは、２次微分の凝固
速度を用いる。つまり、凝固速度の変化速度であ
る。このアツセイは、APTT（活性化された部分
的トロンポプラスチンタイム）試薬キツトActin
を用いる。これは、Dade Diagnostics社より
市販され、U.S.特許3486981記載のような、フア
クター欠如血しようおよびエラジン（ellagic）
酸活性化剤を包含している。凝固時間を、試料の
希釈液について測定し、結果は、回収されたフア
クター単位および最初の未処理試料(a)中の活性
に対する回収されたフアクター活性のパーセン
トで表わす。結果は次表１に示す。 【表】 以上の結果は、増加した純度および実質的な収
量で、細菌および酵母のブロスおよび破壊細胞懸
濁液よりフアクター活性を回収しうることを示
す。 例 ２ ポリ電解質共重合体を用いる吸着で、細菌およ
び酵母培養物よりヒト血清アルブミンを分離する
例を示す。 E.coliおよびS.cerevisiae酵母細胞を上記例１
のように培養し処理した。ヒト血清アルブミン
（Cohn Factor Ｖ：J.A.C.S. 68，459，（1946）
を、細胞不含上清および破壊細胞の液相の生理食
塩水中希釈液（30−190ml希釈）中でインキユベ
ートした。つぎに示す、水不溶の、架橋されたポ
リ電解質共重合体樹脂（樹脂Ｂ）に吸着させてア
ルブミンを分離した。 樹脂Ｂは、５モル％のメチルイミノビス（プロ
ピルアミン９で架橋されそして90モル％の懸垂す
るジメチルアミノプロピルアミド基を含有する。
実質的に等モル量のエチレンと無水マレイン酸と
の共重合体である。このポリ電解質共重合体は、
U.S.特許4097473および4118554の例１およびU.S.
特許4157431の例12記載の反応剤およびモル比を
用いる方法に実質的に準じて製造した。 この例によると、上記細胞不含の上清および破
壊細胞懸濁希釈後のそれぞれの20mlと、アルブミ
ンの200mg／ml溶液の2.4mlとを混合した。これら
の試料はべースラインそれぞれ最初のアルブミン
レベルを設定するために、アルブミン添加前後の
全蛋白質含量を分析した。全蛋白質含量はBio−
Rad Laboratories，Richmond，Califより市販
されているBio−Rad Protein Assay Kidを用い
て測定した。このキツトは、Bradfrd，Anal．
Biochem．72，248（1976）の方法にもとづき、
種々の蛋白質濃度に応ずる染料の色の変化の差を
測定する。 アルブミン添加混合物のそれぞれの20mlを200
mgの樹脂Ｂと混合した。樹脂の懸濁液はPH7.0に
調整し、30分かくはんし、濾過し、樹脂は、それ
ぞれ約50mlの脱イオン水で３度洗つた。洗液を合
併し、前記のように全蛋白質含量を分析した。そ
れぞれの試料について、樹脂ケーキを20mlの
0.04MのNaClに懸濁させ、PH4.0に調整し、溶出
アルブミンを含有する水相を濾別した。溶出資料
は、上記にように全蛋白質含量を測定した。
“Albumin Standards and the Measure−meet
of Serum Aibumin with Bromcresol Green，”
Clin.Chem. Acta 31，87（1971）に記載の特異的ア
ツセイによつての測定した。全蛋白質含量および
アルブミンの採取についての上記の分析結果は、
次表２に示す。 【表】 上記の試料はまた、SDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動に処した。SDS電気泳動において、
試料はナトリウムドデシルスルフエート（SDS）
と短時間加熱し、20−40mA／ゲルで７％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動に処し、ゲルの分子ふ
るい効果により大きさに従つて分けた。移動率は
分子量に関係する。ゲルはComassie Biue Ｒ−
250で染め、デンシテイ スキヤンニング法で評
価した。電気泳動からは、微生物および酵母のブ
ロスの他の成分との複合混合物よりアルブミンの
すぐれた分離が確かめられた。 例 ３ この例は、ポリ電解質共重合体吸着によりヒト
肝臓細胞培養物よりヒト血しようフアクターを
分けることを説明する。 SK−HEP−肝臓細胞を、4.5mg／mlのグルコ
ースを含有するDulbecco変型ミニマム エツセ
ンシヤル培地（MEM）中に37℃で発育させた。
培地には５容量％の牛血清を加えた。細胞はま
ず、75cm²のＴ−フラスコ（Falcon Plastics）中
の付着培養でコンフルエンシイー状態まで発育さ
せた。細胞の１部は、U.S.特許4059485記載の操
作に実質的に従いスピンナーフラスコ中でかくは
ん液体懸濁培養に移し、そこで保持した。 Ｔ−フラスコの細胞培養系およびスピンナーフ
ラスコより細胞および細胞不含上清を採取した。
上清より遠心により細胞を分け、凍結−融解を４
回反復して破壊した。 細胞不含の上清および生理食塩水（0.9％
NaCl）中破壊細胞懸濁液の試料中で、市販され、
高度精製されたヒト血しようフアクターの濃厚
液（AHF，Cutter Laboratories社）をインキユ
ベートした。AHFは、Hershgold等、J.Lab.
Clin.Med.67，23−32（1966）記載の方法の変型お
よび改良により、プールされた新鮮凍結血しよう
の冷不溶分画より精製された。このインキユベー
シヨンの前に、乾燥状のフアクターは無菌水中
で再構成し、240単位／10ml溶液とした。フアク
ターを外部から加えないで、スピンナー培養物
よりの破壊細胞について類似の試験をした（試行
Ｚ）。この例の５つの試行はつぎのようである。 試行Ｖ Ｔ−フラスコ培養物よりの破壊細胞 試行Ｗ Ｔ−フラスコ培養物よりの細胞不含上
清 試行Ｘ スピンナー培養物よりの破壊細胞 試行Ｙ スピンナー培養物よりの細胞不含上清 試行Ｚ スピンナー培養物よりの破壊細胞 再構成フアクターはつぎのような割合でイン
キユベートした。 90mlの生理食塩水および１mlのAprotininプロ
テアーゼインビビター中、試行Ｖよりの破壊細胞
の100mlの懸濁液と、10ml（240フアクター単
位）を混合した。 190mlの細胞不含の試行Ｗの上清および１mlの
Aprotininプロテアーゼインビビターに、10ml
（240フアクター単位）を加えた。 試行Ｘよりの破壊細胞15mlを175mlの生理食塩
水に含有する懸濁液に10ml（240フアクター単
位）を加えた。 試行Ｙよりの細胞不含上清の191mlに9.5ml
（228フアクター単位）を加えた。そして、フア
クターを外部添加しない生理食塩水の185mlに
試行Ｚよりの破壊細胞の15mlを加えた。 分離プロセスはつぎのようである。 試行ＸおよびＺの場合には、試料を、まず70.0
mgの樹脂Ｂ（上記例２記載）と混合し、PHを8.0に
調整し、このPHでスラリーを20分かくはんした。
混合物はブツフナー濾斗上ワツトマンNo.54濾紙で
濾過した。樹脂は蒸留水で濾紙よりはぎ取りビー
カーに入れ５分かくはんした。この混合物はブツ
フナー濾斗上ワツトマンNo.１濾紙で濾過した。樹
脂をすて、２度の濾液合併した。濾液の容量を計
り、樹脂Ｂに吸着されない分として試料をアツセ
イした。 試行Ｖ，ＷおよびＹよりの試行（樹脂Ｂで処理
してない）および試行ＸおよびＺの上記処理試料
（樹脂Ｂ処理よりの濾液）を、あらかじめ条件付
けした樹脂Ａ（上記例１記載）でつぎのように処
理した。 試料および樹脂を混合し、PHを5.8に調整し、
生ずるスラリーをこのPHで20分かくはんした。ス
ラリーはブツフナー濾斗上ワツトマンNo.54濾紙で
濾過した。ケーキを乾燥し砕くより前に、濾液の
容量を記録した。試料は、樹脂Ａに吸着されぬ分
画としてアツセイした。ついで、0.1％BSAを加
えた200mlの0.02MのNaCl溶液をケーキに注加
し、濾液はすてた。ケーキは0.1％BSAを加えた
200mlの0.3MのNaCl溶液中に懸濁させた。PH5.8
で５分かくはんした。スラリーはブツフナー濾斗
上、ワツトマンNo.54濾紙を濾過した。ケーキを乾
燥し、砕く前に、濾液の容量を記録した。濾液を
あツセイしたが、これは洗液の活性である。つい
で、0.1％のBSAを加えた200mlの0.3MのNaCl溶
液をケーキに注加し、濾液はすてた。樹脂ケーキ
は、1.5MのNaCl、0.1Mのリジン、0.01Mのくえ
ん酸ナトリウムの、0.1％BSA添加水性溶液200ml
中に懸濁させた。PH６で20分かくはんした。スラ
リーはブツフナー濾斗上でワツトマンNo.54濾紙を
濾過した。樹脂ケーキをすて、濾液をブツフナー
濾斗上ワツトマンNo.１濾紙を濾過した。濾液の容
量を記録し、試料は、最終溶出フアクター分画
としてアツセイした。 例１のように処理した試料についてフアクター
をアツセイした。結果は、回収されたフアクタ
ー単位として示した。結果を次表３に示す。 【表】 す。
例 ４ エチレンに代えてそれと当量のプロピレンまた
はイソブチレンを用い、そして（または）無水マ
レイン酸に代えてそれと当量のシトラコン酸、イ
タコン酸またはアコニツト酸の無水物を用い、そ
して（または）ジメチルアミノプロピルアミンに
代えてそれと当量のジエチルアミノエチルアミン
を用いて、例１から３を実施しても実質的に同様
な結果を与える。 本発明の趣旨および歯にを逸脱しないで種々の
他の例に専門家は気付かられるのであろうが、そ
れらもすべて特許請求の範囲に含まれるはずであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 細胞培養系中に混合している血しよう蛋白質
   成分をこの系から分離する方法であつて、懸垂状
   態のジ低級アルキルアミノ低級アルキルイミド官
   能基を含有する、炭素原子４〜約６個を有する、
   α，β不飽和ポリカルボン酸またはその無水物と
   炭素原子２〜約４個を有するオレフイン状不飽和
   単量体との水不溶性の架橋されたポリ電解質共重
   合体に接触させることによつて、上記血しよう蛋
   白質成分を吸着させることからなる分離方法。 ２ 細胞培養系が微生物細胞培養系である、特許
   請求の範囲第１項記載の方法 ３ 細胞培養系が哺乳動物細胞培養系である、特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 微生物細胞培養系が発酵ブロスである特許請
   求の範囲第２項記載の方法。 ５ 哺乳動物細胞培養系が消費された細胞培養培
   地である、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ６ 微生物細胞培養系が破壊微生物細胞の分離物
   である、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ７ 哺乳動物細胞培養系が破壊哺乳動物細胞の分
   離物である、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ８ 微生物細胞が細菌細胞である、特許請求の範
   囲第２項記載の方法。 ９ 細菌細胞がEscherichia coli細胞である、特
   許請求の範囲第８項記載の方法。 １０ 微生物細胞が酵母細胞である、特許請求の
   範囲第２項記載の方法。 １１ 酵母細胞がSaccharomyces cerevisiae細
   胞である、特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２ 哺乳動物細胞がヒト肝臓細胞である、特許
   請求の範囲第３項記載の方法。 １３ ヒト肝臓細胞がSK−HEP−１細胞であ
   る、特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４ オレフイン状不飽和単量体がエチレンであ
   り、そしてα，β不飽和ポリカルボン酸またはそ
   の無水物がマレイン酸またはその無水物である、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 １５ ジ低級アルキルアミノ低級アルキルイミド
   がジメチルアミノプロピルイミドである、特許請
   求の範囲第１４項記載の方法。 １６ 血しよう蛋白質がヒト血しようフアクター
   である、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １７ 血しよう蛋白質がヒト血清アルブミンであ
   る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １８ オレフイン状不飽和単量体がエチレンであ
   る、α，β不飽和ポリカルボン酸またはその無水
   物が、マレイン酸またはその無水物であり、懸垂
   状ジ低級アルキルアミノ低級アルキルイミドがジ
   メチルアミノプロピルイミドであり、ポリ電解質
   共重合体が約３モル％〜約７モル％の該懸垂ジメ
   チルアミノプロピルイミドを含有し、そして残り
   のすべての遊離カルボキシまたは無水物サイトは
   そのアルキル基およびアルコキシ基が炭素原子約
   １〜４個を有するアルコキシアルキルアミンでふ
   さがれている、特許請求の範囲第１６項記載の方
   法。 １９ オレフイン状不飽和単量体がエチレンであ
   り、α，β不飽和ポリカルボン酸またはその無水
   物がマレイン酸またはその無水物であり、懸垂状
   ジ低級アルキルアミノ低級アルキルイミドがジメ
   チルアミノプロピルイミドであり、そしてポリ電
   解質共重合体は約90モル％〜約100モル％の該懸
   垂ジメチルアミノプロピルイミドを含有してい
   る、特許請求の範囲第１７項記載の方法。