HU196832B

HU196832B - Process for separating plasma proteins from cell cultures

Info

Publication number: HU196832B
Application number: HU832527A
Authority: HU
Inventors: George E Paget
Original assignee: Monsanto Co
Priority date: 1982-07-19
Filing date: 1983-07-15
Publication date: 1989-01-30
Also published as: ES8500990A1; AU552859B2; JPH0443638B2; AU1693283A; DE3369159D1; EP0099871B1; CA1202566A; IL69272A0; ATE24934T1; US4382028A; ES524150A0; ZA835181B; IL69272A; JPS5928492A; EP0099871A1

Description

A találmány tárgya eljárás vérplazma fehérjék elválasztására sejt tenyészet rendszerekből, úgymint például mikrnbiális sejttenyészetek fermentációs közegéből és emlős sejttenyészelek felhasznált tápközegéből.

Az emberi plazmában vagy szérumban előforduló különböző fajta fehérjék frakcionált elválasztása sok éve foglalkoztatja az orvosi és gyógyszerészeti területen dolgozó tudósokat. Ennek az érdeklődésnek jelentős részét képezik a véralvadásért felelős plazmakomponensek, azaz a vér koagulációs faktorok izolálására végzett kutatások. Más, nagy orvosi érdeklődésre számot tartó vérfehérje komponensek az antitest aktivitást hordozó gamma globulinok és a plazma főkolloid-ozmotikus regulátora, az albumin.

A legfontosabb plazmafehérje, fajtákat, manapság ipari méretekben emberek által adott vérből, mint természetes anyagforrásból gyűjtik. A vérplazma-fehérje fajták izolálásának fontosságát könnyen bemutathatjuk az antihemofiliás faktor (A1IF, Vlff-as faktor) kereskedelmi forgalma iránti igényén, A Vlll-as faktor kritikus szerepe a homeosztárisban és véralvadásban jól ismert. A legtöbb veleszületett véralvadási rendellenességben szenvedő beteg VH-as faktor hiányában szenved (heniofilia A betegek) nu'g kisebb számban találhatók a IX-es faktor hiányában (hernofdia B betegek) vagy egyéb minor alvadási faktor hiányában szenvedő beteg. Az ilyen alvadási rendellenességben szenvedő betegek a múltban teljes vérplazma transzfúzióra vagy előnyösen plazma sűrítményekre szorultak, melyeket a magasabb VIH-as vagy IX-es faktor koncentráció elérése céljából tisztítottak. Kriokicsapásos, például a Judith Pool által kifejlesztett (New England, J. Med., 274, 1443 47 /1963/) vagy még koncentráltabb frakciók, például Hemofil*' AHF, melyet a 3 415 804, 3 631 018, 4 089 944 és Re 29 698 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban közölt módszerekkel állítanak elő, tipikus példái a magas VIH-as faktor koncentrációval rendelkező, kereskedelmi forgalomban levő frakcióknak. Ezek a kereskedelmi célokra előállított frakciók azonban egy szűkös nyersanyagbázis, a véradók által adott vér mennyiségétől függnek.

A hagyományos ipari mikrobiológiai eljárásaira alkalmazott génsebészet és molekuláris biológiai legújabban kifejlesztett technikáival ma már elérhető, hogy emlős plazmafehérjéket állítsunk elő mikroorganizmosokkal. így a gén-illesztés fő tervezői közölték módszerük használl atóságát a különböző plazmafehérjék, például aniihemofilia fehérje, gamma globulinok, albumin, fibrinogén és protrombin előállítására. (Lásd Cohen and Boyer, 4 237 224 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás 9. oszlop). Míg a génsebészet aktuális korai munkája viszonylag kis fehérjék, úgymint szomatosztatin és inzulin előállítására korlátozódott, az idegen fehérjék baktériumokban és élesztőkben való előállításának génsebészeti alapelveiről bebizonyosodott, hogy alkalmazhatók sokkal nagyobb fehérjékre. A rekombináns mikroorganizmusokkal termelt viszonylag nagy fehérjékre példa a körülbelül 43000-es molekulasúlyú ovalbumin, a 2 923 297 és 2 933 000 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli közzétételi irat szerint, és a 2 458 585 és 2 476 126 számú francia szabadalmi bejelentés szerint, valamint az. 585 aminosavból álló láncú humán szérum albumin (tawn és munkatársai, Nucleic Acids, Rés., 9 (22), 6103 - 6114 /1981/). A Natúré, 312,

330-337. (1984) cikkében William l. Wood és munkatársai humán VÉI-as faktor kifejezését ismertetik rekombináns DNS kiónokkal. E cikkben is kifejtik a szerzők, hogy a kapott elegyek feldolgozása komoly problémát jelent, többek között az ilyen elegyekben keletkező protein csapadékok és veszélyes potenciális kórokozók (hepatitis, AIDS) következtében.

Felismertük, hogy igény van használható módszer fejlesztésére plazmafehérjék elválasztására sejttenyészet rendszerekből. Bármely kiválasztott speciális fehérje elválasztása a fermentációs tápközegekben és felhasznált közegben jelenlevő más fehérjékből és sejtalkotókból, metabolitokból, sejt törmelékekből és hasonló anyagból álló keverékből, nagy nehézségekkel jár. A múltban a fehérjetermék kinyerése a fermentációs közegekből és felhasznált közegekből számos különböző eljárással történt. Extrakció a sejtekből vagy sejtalkotókból történő felszabadítással, a sejt fal vagy membrán mechanikai, fizikai vagy kémiai roncsolásával pl. homogenizátorok használatával vagy vizes és szerves oldószeres extrakció alkalmazásával. — Kicsapás kisózással sókkal, mint pl. ammónium-szulfáttal vagy szerves oldószerek pl. etanol, metanol vagy izopropanol használatával, vagy nagymolekulasúlyú polimerekkel, pl. políetilén-glikollal és dextránnal vagy fém ionokkal és komplexekkel, vagy különböző hőmérsékleti és pH-köriilniények használatával. - Adszorpció kolloid anyagokkal, úgymint bentonit, kalcium-foszfát, bárium-szulfát, hidroxiapatin, aktív szén, szilika- vagy alumínium-hidroxid gélek,

Centrifugálás, szűrés, szűrési segédanyagok nélkül vagy segédanyagokkal, úgymint kieselgél és más ilyen diatómaföldek, vagy ultraszűrés,

Kromatográfiás gélszűréssel és ion-cserélő gyantákkal, úgymint ítephadex^K (térhálósított dextrán) gélek, Sepharose^K (agaróz) gélek és DEAE-Sephadex vagy DEAE-cellulóz-ion cserélő gyanták.

Elektroforézis

Ultracentrifugálás, és

Befejező műveletekúgymint sótlanítás, sűrítés és szárítás,

Egy újabban kifejlesztett fehérje-kinyerési és izolálás! módszer lényege immun-affinitás kromatográfia. Egy adott proteinhez affinitással rendelkező monoklonális antitesteket poliszacharid gyöngyökhöz köthetünk, majd ezeket kromatográfiás oszlopba helyezzük. Ha a nyers fehérje-oldatot átbocsátjuk az oszlopon, a kiválasztott fehérje-molekulák adszorbeálódnak a gyöngyökön, mig a szennyezések és a nem kívánt anyagok keresztülfolynak az oszlopon. A kívánt fehérjét ezután leoldjuk a gyöngyökről egy megfelelő mosó-oldat pH-jának beállításával.

A találmány tárgya eljárás plazmafehérjék elválasztása sejttenyészet rendszerekből készített keverékekből vízben oldhatatlan, térhálósított polielektrolit kopolimereken való adszorpcióval. Ezek a polielektrolit kopolimerek 2-4 szénatomszámú, olefin típusú telítetlen monomerek és di-(kis szénatomszámú alkilamino-kis szénatomszámú alkilmid) funkciós csoportokat tartalmazó 4-6 szénatomszámú, telítetlen polikarbonsavak vagy anhidridek kopolimerjei.

Amint az alábbiakban használjuk, kis szénatomszámú alkil jelentése 1-4 szénatomszámú alkilcsoport.

A megfelelő olefin-típusú telítetlen monomerekre jellemző példa az etilén, propilén és izobutilén, a megfelelő a , 0 telítetlen polikarbonsavakra vagy anhid-21 ridekre jellemző példa a maleinsav, citrakonsav, itakonsav, akonitsav vagy ezek anhidridjei. Ezek közül a monomer komponensek közül az etilén és a maleinsav-anhidrid használhatók előnyösen kopolimer képzésére. A kopolimer előnyösen lényegében ekvimoláris mennyiséget tartalmaz a két monomer komponensből.

A kopolimereknek víz-oldhatatlanság céljából végzelt térhálósítását ismert térhálósító anyagokkal végezhetjük, úgymint divinil-benzollal és etilén-diaminnal. Az előnyösen használható térhálósító anyagok a (kis szénatomszámú alkil)-imino-bisz-(kis szénatomszámú)-alkilaminok, ahol kis szénatomszámú alkil jelen tése ugyanaz, mint a fentiekben.

A jelen szabadalmi leírásban használt polielektrolit kopoliinerck ismert vegyületek, a 3 554 985, 3 55 001, 4 081 432, 4 097 473, 4 118 554 és 4 157 431 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásokban közölt módszerekkel állíthatók elő. Például az etilénés malinsav anhidrid előnyösen használható kopolimere (EMA) etilén és maleinsav-anhidrid reakciójával állítható elő peroxid katalizátor jelenlétében, megfelelő szerves oldószeres közegben. A kapott alap EMA kopolimerl reagáltathajtjuk térhálósító anyaggal, például (kis szénatomszámú alkil)-imino-bisz(/kis szénatomszámú alkil/-amin)-nal, melynek két primer amino-csoportja van és térhálós EMA kopolimert eredményez. Az EMA-t előnyösen körülbelül 3-7 mólszázalék térhálósító anyaggal reagáltatjuk. A kívánt di-(kis szénatomszámú alkil-amino-kis szénatomszámú alkil-amid) függelék funkciós csoportokat a térhálós kopolimerbe úgy juttatjuk be, hogy a di-(kis szénatomszámú alkil-amino-kis szénatomszámú aikil-imid)-del reagáltatjuk az EMA kopolimer megmaradt szabad anhidrid csoportjait, vagy azok egy részét. A jelen szabadalmi leírásban alkalmazott polielektrolit kopolimer adszorbensek készítése során körülbelül 3-100 mólszázalék di-(kis szénatomszámú alkil-amino-kis szénatomszámú alkil-amin )-t használunk.

Egy előnyösen használható di-(kis szénatomszámú alkil-amino-kis szénatomszámú alkil-amin) a dimetilamino-propilamin és egy előnyösen használható térhálósító anyag a metilimino-bisz(propilamin).

A polielektrolit kopolimereket előállíthatjuk a 4 118 554 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban közölt aggregációs lépést használó módszerekkel, és minden megmaradó szabad karboxil vagy anhidrid csoportot alkoxi-alkilaminnal blokkolhatunk a 4 157 431 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban közöltek szerint. Az említett alkoxi és alkil csoportok előnyösen 1-4 szénatomo sak, és a legelőnyösebben használható blokkoló csoport metoxi-propilamin.

Érthető, hogy a polielektrolit kopolimer előállítási módszernek alábbi leírása csak ismertető jellegű és a plazmafehérjék sejttenyészet rendszerekből a jelen szabadalmi leírás alapján történő elkülönítési módszerét nem korlátozzuk egyes külön előállítási módszerekre.

Jóllehet a polielektrolit kopolimerekről ismert, hogy jól használhatók vérszérum és plazma frakcionálására, eddig nem volt ismert róluk, hogy rendelkeznek mikrobiális sejttenyészetek fermentációs közegéről, emlős sejttenyészetek felhasznált tápközegéből, és más olyan, a plazma fehérjét különböző fehérjék, peptidek, nuklcinsavak és hasonló sejttenyészet komponensek keverékében tartalmazó komplex sejttenyészet rendszerekből a plazmafehérjék szeparálásának képességével. Amint a továbbiakban használjuk, a sejttenyészet rendszer kifejezés meghatározás szerint a tenyésztett sejtekből felszabadított anyagot jelent, úgymint például a sejtek lizátuma vagy extraktuma, vagy a fermentációs közegbe illetve felhasznált tápközegbe bevitt vagy ott feldolgozott anyagot, vagy ennek bármely olyan részében talált anyagot, mely a kívánt plazmafehérjét tartalmazhatja.

A találmány szerinti eljárás alkalmazható a plazmában normális körülmények között bármely fehérje elválasztására a sejttenyészet rendszerből. Ezt részletes példákkal mutatjuk be az alábbiakban a vér koagulációs fehérje, nevezetesen a humán VIII-as faktor elválasztásán bakteriális, élesztő és sejttenyészet rendszerekből és más plazmafehérjék, nevezetesen humán szérumalbumin elválasztásában bakteriális és élesztő sejttenyészet rendszerből. Más plazmafehéqék, úgymint például aj-antitripszin, Oyinakroglobulin, fibronektin, coruloplazmin, C-reaktív Tehérje, transzferrin, fibrinogén, protrombin, plazma tromboplasztin komponens és a gamma globulinok hasonló képpen választhatók el a találmány szerinti eljárással sejttenyészet rendszerekből. Ezeknek a plazmafehéijéknek a forrása a sejttenyészet rendszerekben lehet a tenyészlébe kívülről való bejuttatás, például a plazmafehérje növekedési faktorok bevitele, teljes vérszérum, úgymint ló, marha, vagy birka szérumok, vagy borjúmagzat szérum, tápanyagok és hasonlók, vagy származhatnak a plazmafehérjét specifikusan termelő génsebészetileg megváltoztatott sejtek tenyészetéből.

A génsebészetileg megváltoztatott mikroorganizmusok esetében a kezdeti génsebészeti eljárás a következő négy, tipikus rekombináns DNS elemet alkalmazhajtja.

1. A különböző forrásokból származó DNS molekulák hasítására és összekötésére szolgáló módszerek

2. egy mind önmagában, mind a hozzákapcsolt idegen DNS fragmenttel összekapcsolva szaporodni képes megfelelő gén-hordozó,

3. az összetett DNS molekulának működő baktérium vagy éfesztő-sejtbe való bejuttatására szolgáló módszerek, és

4. eljárás a rekombináns DNS molekulát befogadott sejtek kiónjának kiválasztására nagy sejtpopulációból

Példaképpen egy baktérium-plazmid, például pSC-101 használható klónozó vektorként arra, hogy idegen vagy külső gént a gazda-baktériumban juttassunk. Egy jellemző gazda-baktérium lehet például az Escherichia coli K-l 2 1776, mely hozzáférhető az American Type Culture Collection-nál, Rockville, Maryland ATCC 31244 szám alatt. A plazmidot restrikciós endonuleázzal vagy más DNS-hasítóenzimmel hasíthatjuk, így egy intakt replikonnal és ragadós végekkel rendelkező lineáris DNS fragmentet hozunk létre. Egy második, a kívánt külső vagy idegen gént tartalmazó, adott fenotípust hordozó és komplementer, ligálható végekkel rendelkező DNS fragmentet nyerhetünk egy idegen sejtből, vagy kémiailag szintetizálhatjuk. Egy teljesen zárt, újra körré alakított plazmid előállítására ezt a második DNS fragmentet illesztjük az első fragmenthez DNS ligázzal vagy más DNS-t ligáló anyagokkal, például Tj pNS ligázzal. A második fragment beépítése a példaként felhozott plazmid EcoRi helyére, a genetikus információ kifejeződését a plazmid lac operon kontroll elemeinek ellenőrzése alá rendeli.

A kapott rekombináns plazmidot használjuk a baktérium-sejt transzformálására, majd hagyjuk hogy replikálódjon, a baktériumot megfelelő táptalajon növesztve. A kívánt transzforrmánsokat ezután a fenotípusos tulajdonságok alapján izoláljuk, például bizonyos növekedés-gátló anyagok, úgymint antibiotikumok, elleni rezisztencia, vagy különböző morfológiai különbségek alapján.

A génsebészet fenti, általános elveinek emlős plazmafehérjék mikroorganizmusokban történő kifejeződésére való alkalmazását a gyakorlatban a humánszérum-albuminnak (HSA) rekonbináns baktériummal történő előállításával illusztráljuk (Lawin et al. Nucleic Acids Rés. 9 (22), 6103 6114 /1981/).

A leírt eljárás szerint ismert módszerekkel a HSA gén érett fehérje-kódoló szakaszát tartalmazó pHSAl rekombináns plazmidot készítenek. Ezt a rekombináns plazmid-vektort tartalmazó baktériumok EISA fefiérjét termelnek az E. coli trp pronioter-operátor szabályozása szerint, mely az E. coli kromoszómának az a szakasza, mely a triptofán szintézisében résztvevő enzimeket kódolja.

A pHSAl plazniid előállítása céljából a HSA mRNS teljes fehérje-kódoló szakaszából és 3 nem transzlálódó részét tartalmazó szakaszából cDNS kiónokat izolálunk. Az első cDNS kiónokat úgy állítottuk elő, hogy humán máj-RNS-en indítottuk meg a DNS szintézist megfelelő oligo-deoxitimidilát nevezetesen oligo (dT)p_jg használatával (Collaborative Research). Ezeket a cDNS kiónokat használjuk arra, hogy pBR322 plazmid szakaszait a pLelÉ A25 plazmidból származó, mesterséges tompavégű Xbal hasítási helyben végződő E. coli trp bevezető peptid, promoter operátor és riboszóma-kötő helyét tartalmazó 300 bázis pár hosszúságú fragmentet tartalmazó vektor fragmentből rekombináns plazmidot készítsünk. A pLelF A25 plazmid irányítja a humán leukocita interferon A (IFNB2) kifejeződését (Goeddel et al. Natúré 287, 411-416 /1980/). Az E. coli promoter-operátor régiót közük a 3 020 528 számú Ger. Offen-ben, Japan Kokai Tokkyo Koho 8061ben, EPA 36 776—bán, valamint Russel és Bennet (Gene 17 (1), 9-18 /1982/). A pBR322 plazmid jól jellemzett kereskedelmi forgalomban levő 2,6 x 10⁶ molekulasúlyú plazmid. Több mint tíz enzimnek van egy hasítási helye rajta, ideértve az ampicillin rezisztencia (Ap) génen belüli egyetlen PstI restrikciós helyet, valamint a tetraciklin rezisztencia (Te) génen belüli egyetlen EcoRI, HindlII, BamHI és Sáli restrikciós endonukleáz hasítási helyet. Ezeknek az egyetlen restrikciós helyeknek a jelentőségét a Psll restrikciós endonukleáz által felismert egyetlen hellyel mutatjuk be. A Pstí az 5’CTGCA 63’ szakasz ötödik és hatodik bázisa között hasít. Mivel a PBR-322-ben csak egyetlen Pst hely van, a hasítás eredményeképpen rövid egyszálú 3’ végeket tartalmazó lineáris plazmidot kapunk. A plazmid további leírását Bolivár és munkatársai közlik (Gene, 2, 95 /1977/), restrikciós endonukleáz térképét Sutcliff közli (Nucleic Acids Rés., I 2721-2728 /1978/). A B-12014 NRRL számú E. coli RRI törzsből nyerhetjük ki, mely tenyészet a Northern Régiónál Research Laboratory, U. S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA állandó gyűjteményében van letétbe helyezve.

Számos F-47, F-61 és B-44 jelű átlapoló oligonukleotid fragmentet választottak a fent említett kutatók szerint a cDNS kiónokból hogy megfelelő DNS szakaszokat készítsenek a fenti módosított pBR322 vektor-fragmentbe való beillesztésre. A teljes pHSAl rekombináns plazmid így nemcsak a plazmid pBR322 részének Te és Ap génjeit tartalmazza, valamint az E. coli trp promoter-operátor szakaszát, hanem az F-47, F-61 és B-44 cDNS kiónokból származó HSA kódoló szakaszokat is. A pHSAl rekombináns plazmidban kiválasztott más restrikciós endonukleáz helyek az egyetlen EcoRI és Bglll restrikciós hely, valmaint két Xbal és PstI restrikciós hely.

A módosított pHSAl plazmidot használtuk az E. coli K-12 294 törzs transzformálására. A pHSAl plazmidot tartalmazó E. coli-t triptofán-mentes minimál táptalajon növesztve, a sejtek HSA antitestekkel specifikusan reagáló fehérjét termelnek, mely SDS poüakrilamid elektroforézisnél együtt vándorol a HSA-val.

Más plazmid-vektorokat hasonlóképpen készíthetünk különböző plazma-fehérjéknek mikrobiális sejttenyészetben való ilyenfajta kifejeződésére, ha a megfelelő genetikus, információt építjük be a rekombináns plazmidba. így a kívánt fehérje aminosav-sorrendjét kódoló DNS-t, a genetikai kódnak megfelelő kódonok kiválasztásával állíthatjuk elő. A megtervezett gént ezután beillesztjük egy expressziós plazmidba, hogy a fenti HSA példával analóg módon szaporodjon a gazda mikroorganizmusban.

A fentiekben HSA termelésre leírt E. coli K-12 gazda-vektor rendszertől eltérő, emlős fehérjék génsebészeti előállítására alkalmas mikrobiális gazdavektor rendszerekre jellemző példák a következők:

Más Esclierichia törzsek és más Enterobaktériuniok, úgymint Salmonella,

Bacillus fajok, úgymint B. subtilis, B. megaterium B. cereus, B. pumilus, B. amyloliguefaciens, B. licheniformis, és B. gübigii,

Streptomyces fajok, úgymint S. coelicolor, S. fradiae, S. parvulus, S. lividans, S. griseus, S. albus, és S. phaeochromogenes,

Staphyloccus fajok, úgymint S. aureus, és Élesztők, úgymint Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carslbergensis, és Schizosaccharomyes pombe.

Az nyilvánvaló, hogy gyakorlatilag bármely DNS darabot hozzáépíthetünk riboszómális vagy bármely olyan génhez, mely be tud épülni a gazdaszervezet kromoszómájába. Axel és munkatársai kimutatták, hogy tenyésztett emlős sejtek képesek felvenni és kifejezni idegen DNS-t (Science, 209, 1414-1422 /1989/). Ezek a technikák hasznosak olyan gének izolálásában, melyek nem fejeződnek ki E. coli-ban vagy más mikrobiális gazdában, de megkülönböztethető fenotípusos tulajdonsággal rendelkeznek emlős vagy más gerinces szervezetek sejtjeiben. A transzformált DNS így beépül a kromoszómába. A transzformáló DNS-t simian vírus 40 (SV40) vektorral is bejuttathatjuk a tenyésztett sejtekbe. Az SV40 vírust használták vektorként arra a célra, hogy számos prokrióta gént klónozzanak emlős sejtekben (Mulligan and Berg, Science 209, 14221427 /1980/). Tulajdonképpen a rekombináns DNS módszer első bemutatkozása az E. coli galaktóz operonjának beépítése volt SV40-be (Jackson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 2904-2909 /1972/).

A humán kromoszómák meghatározott részeiből klónozott DNS szakaszok izolálására más módszereket Írnak le Gusella és munkatársai (Proc. Natl. Aead. Sci. USA, 77 (5), 2829-2833 /1980/).

Nyilvánvaló, hogy a jelen találmány nem korlátozódik egyetlen gazda-vektor rendszerrel sem a plazmafehérjék génsebészeti előállítása területén, a találmány tárgya ehelyett plazniafehérjék elválasztása sejttenyész.et rendszerből, a sejtek megfelelő sejttenyésztő közegben való növesztése után, függetlenül attól, hogy a plazniafehérjék hogy kerültek a tenyészetbe.

A sejttenyészet tápközegének olyan kémiai összetételinek kell lennie, hogy kielégítse a sejttömeg kémiai elem igényeit és megfelelő energiát szolgáltasson a szintézishez és fenntartáshoz. A mikrobiális sejt tipikus elemösszetétele a következő lehet:

Ele m Sej t szárazanyag %

C 50

Ν 7-12

P 1-3

S 0,5—1

Mg 0,5

Egy megfelelő táptalajnak olyannak kell lennie, hogy pótolja az adott sejt növekedéséhez szükséges kémiai elemeket. Kistérfogatú mikrobiális sejttenyészetek megszokott táptalajai általában húskészítményeken alapszanak (triptikus emésztés, pepton, tápleves), melyek hús vagy hal enzimes hidrolízisének oldható terméke. Vitaminok és koenzimek (általában mg/liter mennyiségben) pótlására, a táptalajokat gyakran tovább gazdagítjuk húskivonattal (hús infúzió) vagy élesztő kivonattal. Szükség esetén ásványi sókat, úgymint nátrium-kloridot, dikáliun-hidrogén-foszfátot és magnézium-szulfátot és különböző, aminosavakat adhatunk hozzá. Véres-agar táptalajokban a vér szolgáltatja a további tápanyagokat. A szérumokat is használhatjuk, amelyben az albumin komponens szolgál védő, nem-tápanyag jellegű faktorként. Szénvegyületek, úgymint glükóz, laktóz és maltóz szolgáltathatják a sejtek szén-szükségletét, valamint a szükséges energiát.

További illusztrálás céljából. E. coli tipikus minimális táptalaja a következő lehet:

Anyag K₂HPO₄	Gm/liter 7,0
KH₂PO₄	3,0
Naj citrát. 3H₂O	0,5
MgSO₄.7H₂O	0,1
FeSO₄	0,01
(NH₄)₂so₄	1,0
Glükóz	1,0

Nagyobb léptékű fermentációban az alkalmas fermentációs közeget szénhidrát anyagokból, úgymint tejsavó, lebontott kukorica-keményítő, kukorica-cukor, melaszok, keményítő-cukor, búzakorpa és más elérhető szénforrásból, valamint nitrogéntartalmú anyagokból, úgymint sűtőélesztő, szójafehérje, kazein, karbamid, ammónium-sók, nitrátok és más elérhető nitrogén-fonásokból készíthető. Ezek a fermentációs táptalaj-adalékok lehetnek nyersanyagok, vagy tisztított anyagok. Az N-Z-Amine fehérje hidrolizátum, kukoricalekvár, szeszfőzési maradék kereskedelmi forgalomban levő komplex anyagok, melyek hasznos táp-komponenseket szolgáltathatnak a mikrobiális sejttenyészet rendszerhez. Az Ν-Ζ-Amin a tejiparban melléktermékként keletkező kazein enzimes emésztésével állítható elő. A kukoricalekvár a kukoricakeményítő feldolgozásának mellékterméke, és komplex anyagokat tartalmaz, ideértve számos fehérje-hidrolízis terméket, B-komplex vitaminokat, aminokat és más szerves és szervetlen anyagokat. A szeszfőzési maradék az alkoholos italok gyártásának mellékterméke.

A mikroorganizmusok által esetleg igényelt nyomnyi mennyiségű tápanyagok általában benne vannak a fontos fermentációs táptalaj komponensekben, úgy, hogy külön hozzáadásukra általában nincs szükség. Például szervetlen sók, úgymint fém-kloridok, szulfátok, foszfátok cs nitrátok általában a fontos szén- és nitrogén-forrás adalékanyagokkal kapcsolatban jelen vannak a fermentációs táptalajban.

Hasonlóképpen, emlős és más gerinces állatok sejtjeinek növesztésére alkalmas táptalaj emészthető nitrogén- és szénforrást, valamint szervetlen sókat tartalmaz. Ez lehet bármely jól ismert szövettenyésztő táptalaj, például Eagle Alaptáptalaj (BME), Eagle Minimálisan szükséges Táptalaj (NEM), Dulbccco Módosított Eagle Táptalaj, 199-es Táptalaj és kiegyensúlyozott sóoldat (BSS), úgymint az Eagle és llanks által különböző tápanyagokkal megerősített oldatok. Ezek a kereskedelmi forgalomban elérhető szövettenyészet táptalajok, és részletesen H. J. Morton ismerteti őket (In Vitro 6, 89108 /1970/). Ezek a szokásos tenyésztő táptalajok ismert esszenciális aminosavakat, ásványi sókat, vitaminokat és szénhidrátokat tartalmaznak. Ezenkívül gyakran gazdagítják őket emlős szérumokkal, például borjú-magzat szérummal.

A májnak a plazmafehérjék bioszintézisében elfoglalt uralkodó szerepet figyelembe véve, a jelen találmány egyik szempontjából következően a májsejtek az előnyben részesített emlős sejtek a plazmafehérje komponensek előállításában és elválasztásában. A tumorsejtek tenyészetei különösen hasznosak a találmány szerinti eljárásban a_zvéralvadásért felelős plazma-komponensek esetében. így ismert az, hogy a véralvadási abnormali fásokat általában daganatos betegeknél figyelik meg, és fibrin lerakódásokat találtak számos elsődleges és áttételes tumor körül emberben és állatokban. Lásd például (Dvorak et al., Science, 212, 923 -924 /1981/). Az is jól ismert, hogy tenyésztett hepatóma sejtekből albumin nyerhető ki.

A plazma-komponensek emlős sejttenyészet rendszerekből való elválasztását részletesen bemutatjuk az alábbiakban az emberi VH-as faktornak SK-HEP-1 jelű emberi máj-adenokarcinóma sejtvonal sejttenyészet rendszerekből való elválasztásán. Az SK-HEP-1 stabilizált sejtvonalat G. Trempe állította elő (Sloan-Kettering ístitute fór Cancer Research) 1971ben máj-adenokarcinómából, és a sejtvonal tenyészetei ebből az intézetből megszerezhetők. Az SK-HEP-1 sejtvonal stabilizálásáról és jellemzéséről szóló közlemények közé tartoznak a következők:

Fogh and Tremplc, „New Humán Tumor Cell

Lines', a Humán Cells in Vitro kiadványában.

(Szerk. Fogh), Plenum Publ. Corp., New York,

115 154,1975,

Fogh et al, J. Nat’¹. Cancer Jnst., 58, 209—214 (1977).

és

Fogh et al., J. Nat’l. Cancer Inst., 59, 221 —

225 (1977).

A találmány szerinti eljárás egy, a Vlll-as faktor fehérje sejttenyészet rendszerekből való elválasztását bemutató példájában a polielektrolit előnyösen 3-7 mól % függő di-kis szénatomszámú alkil-amino-, kis szénatomszámú alkil-imid) funkciós csoportot tartalmazó, körülbelül 3—10 mól% kis szénatomszámú alkil-imino-bis(kis szénatomszámú alkil-amin)-nak térhálósított etilén és maleinsav-anhidrid kopolimer, a továbbiakban azzal jellemezhető, hogy lényegében az összes megmaradó karboxil vagy anhidrid csoportok alkoxialkil-aminnal vannak blokkolva. A kopolimer előnyösen metilimino-bisz-propilaminnal van tcrhálósítva és függő funkciós csoport dimetil-amino-propiliinid. Ebben a bemutató példában az elválasztási eljárásban használt poli elektrolit koncentrációja részben a kezelt sejttenyészet rendszerben levő Vlll-es faktor mennyiségétől függ, de általában kiváló eredményt kapunk, ha a polielcktrolitot körülbelül 1-10 súly% koncentrációban használjuk, előnyösen körülbelül 5-6 súly%-ban. A Villás faktor adszorpciós lépésében a sejttenyérzet rendszer pll-ját előnyösen körülbelül 5,5-6,5 közé állítjuk.

Az adszorbeált Vlll-as faktort a felülúszóból szűréssel, centrifugálással és hasonló elválasztási eljárással nyerhetjük ki. A Vlll-as faktort a felülúszóból szűréssel, centrifugálással és hasonló elválasztási eljárással nyerhetjük ki. A VHI-as faktor fehérjének a leoldását körülbelül 1-3 m nátrium-kloriddal végezhetjük, előnyösen körülbelül 1,5-1,8 in nátrium-kloriddal és más ilyen fiziológiailag elfogadható oldattal.

A találmány szerinti eljárás másik, az albuminnak sejttenyészet rendszerekből való elválasztását bemutató példájában a polielektrolit előnyösen hasonló a fentiekben a Vlll-as faktorra leírt anyaghoz, azzal a kivétellel, hogy a függő funkciós csoportok mennyisége körülbelül 90-100 ntól% között van és a megmaradó szabad karboxii- vagy anhidrid csoportok lehetnek blokkoltak vagy blokkolás nélküliek. Az ebben a bemutató példában szereplő elválasztási eljárásban hasznúit polielektrolit koncentrációja részben a kezelt sejttcnycszet rendszerben levő albumin mennyiségéiül függ, de általában kiváló eredményt kapunk ha a használt polielektrolit koncentrációja körülbelül 0.01 -20 súly%. Az albumin adszorpciós lépés során a scjtlcnyészet rendszer pH-ját előnyösen körülbelül

6,5 7,5 közé állítjuk. Az adszorbeált albumin kinyerését a felülúszóból valamint az albumin leoldását az adszorbcnsről a Víll-as faktorra leírt eljárással hasonló módon végezhetjük. A leoldási lépés során a pH-t előnyösen körülbelül 3,5-4,5 közé állítjuk és körülbelül 0,01 0,1 mólos nátrium-kloriddal végezzük az cluálást.

A következő részletes példák tovább jellemzik a találmány szerinti eljárást, de azt meg kell érteni, hogy a találmány nem korlátozódik ezekre a speciális példákra.

1. példa

Ez a példa a humán VÍII-as plazma-faktornak baktérium- és élesztő-tenyészetekből polielektrolit kopolímeres adszorpcióval való elválasztását mutatja be, Escherichia coli baktérium és Saeharomyces cerevisiae élesztősejteket tenyésztünk és dolgozunk fel az alábbi körülmények között.

A

Tenyésztő táptalaj E. coli-hoz:

Luria Broth

17,5 g nátrium-klorid

17,5 g élesztő-kivonat (Difco)

35,0 g Bacto-tryptone (Difco)

4,2 ntl 2 N nátrium-hidroxid

3500 ml ionmentes desztillált víz

A fenti anyagokat keveréssel visszük oldatba, majd az oldatot 30 percig autoklávozzuk.

E. coli törzs: K12

Tenyésztés: 48 óra 37°C-on a fenti táptalajban. Indukáló koncentráció: 5 ml-es ferde agaron nőtt tenyészet szuszpendálva 3500 ml fenti táptalajban _

Végső koncentráció: 5x10 sejt/ml

A sejteket 3500/perc fordulatszámmal 10 percig centrifugáljuk hűtött Beckman J2-21 centrifugában. Kinyert scjtnicntes felülúszó: 3000 ml

Kinyert sejtek mennyisége: 14,44 g

Sejtek roncsolása 8 g sejtet roncsolunk négyszer

French Bress berendezésben 82,740 Kilopascallal B

Élesztő tenyésztő táptalaj YEPD

1. oldat g élesztő-kivonat (Difco) g Bacto-pepton (Difco)

3150 ml ionmentes desztillált viz

2. oldat g glükóz

350 ml ionmentes desztillált víz,

3. oldat

3,5 g ammónium-szulfát

17,5 ml ionmentes desztillált víz

Az 1 és 2 oldatot külön autoklávozzuk. Az 1 és 2 oldatot az autoklávozás után még melegen, de már csökkentett hőmérsékleten a következő arányban keverjük a 3. oldattal:

( 450 ml 1. oldat .

x 8 50 ml 2. oldat

L 2,5 ml 3. oldat

Élesztő törzs: M 25

Tenyésztés: 48 órán át 30°C-on a fenti táptalajban, rázatással.

Kiinduló koncentráció: 1,5 ml-es ferde agaron nőtt tenyészet szuszpendálva 3500 ml fenti táptalajban. □

Végkoncentráció: 5x10’ sejt/ml

A sejteket 3500/perc fordulatszámmal 10 percig centrifugáljuk Beckman J2-21 centrifugában.

Kinyert sejtmentes felülúszó 2500 ml.

Kinyert sejtek mennyisége: 28,0 g

Sejtek roncsolása 8 g sejtet roncsolunk négyszer French Press berendezésben 103,425 kilopascallal

Kereskedelmi forgalomban lévő, nagyon' tiszta humán VITI-as plazma-faktort (Hemofd^R AHF*, (A 3 415 804, 3 631 018, 4 089 944 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásokban és Re. 29 698-ban közölt módszer szerint előállítva), Travenol Laboratories Inc.) feloldunk 10 ml steril vízben majd a fenti sejtmentes felülúszókban valamint a fenti feltárt sejtekből fiziológiás sóoldattal készített szuszpenzióban 30-190 ml hígításban inkubáljuk, A VHI-as faktort ezután a megfelelő szuszpenziókból adszorpcióval nyerjük ki a következő vízben oldhatatlan, térhálósított polielektrolit polimer gyantával (A gyanta).

Az A gyanta 5 mól dimetil-amino-propil-imid csoportot tartalmazó, 5 mól% metilimino-bisz(propilaniin)nal térhálósított, lényegében ekvimoiáris mennyiségű etilént és maleinsav-anhidridet tartalmazó kopolimer. Az összes szabad karboxil vagy a anhidrid-csoportot tovább blokkoljuk nietoxi-propilamiiinal. Ezt a polielektrolit kopolimert lényegében az 1. példában leírt módon, a 4 157 431 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban közölt módszerrel készítettük a reagenseket és mólarányokat illetően.

Felhasználás előtt az A gyantát a következőképpen készítjük elő:

Tizenkét gramm A gyantát keverünk 200 nil stabilizálóként 0,1% szarvasmarha szérum-albumint (BSA) tartalmazó 0,154 mólos nátrium-klorid-oldatban. (Humán szérum-albumint is használhatunk BSA helyett).

A pfí-t 4,0-ra állítjuk 1 mólos citromsavval, majd a szuszpenziót műanyag Büchner tölcséren, Whatman 54 szűrőpapíron szűrjük keresztül. A szűrletet elöntjük és a polielektrolit polimer szűrési maradékot 200 nil, 0,1% BSA-t tartalmazó, 0,154 mólos nátrium-klorid oldatban szuszpendáljuk. A pH-t ezután 1 normál nátrium-hidroxiddal 5,8-ra állítjuk, majd tíz percig pH 5,8-on kevertetjük. A szuszpenziót ismét m(anyag Büchner tölcséren, Whatman 54 szűrőpapíron szűrjük. A szűrletet elöntjük és a polielektrolit polimer szűrési maradékot megőrizzük az alább következő felhasználásra.

Az elválasztási eljárást a következőképpen hajtjuk végre: ,

A protinin proteáz inhibitort (Sigma Chemical Company) (egy ml, 10—20 tripszin-inhibítor egység) adunk stabilizálóként 190 ml, a fentiek szerint előállított E. coli tenyészet felülúszójához műanyag főzőpohárban. 3—5 perc keverés után 10 ml feloldott Heniofil AHF-t (264 egység VHI-as faktor) adunk hozzá, az elegyet keverjük és vizsgálat céljára mintát veszünk belőle (a minta) a kezdeti szint megállapítása céljából. Az elegyet a fentiekben megőrzött polielektrolit polimer szűrési maradékhoz adjuk, a pH-t 1 mólos citromsavval 5,8-ra állítjuk és 20 percig pH 5,8-ra kevertetjük. A szuszpenziót műanyag Büchner tölcséren, Whatman 54 szűrőpapíron szűrjük át. Mielőtt a polielektrolit lepény megszárad és megreped, a szürlet térfogatát megmérjük és mintát veszünk (b minta). 200 ml, 0,1% BSA-t tartalmazó 0,002 mólos nátrium-kloridot öntünk lassan a polielektrolit lepényre. A szűrletet elöntjük, a lepényt szuszpendáljuk 200 ml, 0,1% BSA tartalmú 0,3 mólos nátrium-klorid-oldatban, majd pH 5,8 mellett öt percig keverjük. A szűrletet műanyag

Büchner tölcséren, Whatman 54 szűrőpapíron szűrjük keresztül. Mielőtt a polielektrolit polimer lepény megszárad és megreped, a szürlet térfogatát megmérjük és mintát veszünk belőle (c minta). 200 ml, 0,1% BSA tartalmú 0,3 mólos nátrium-klorid-oldat tál mossuk a polielektrolit polimer lepényt és a szűrletet elöntjük. A polielektrolit lepényt ezután 200 ml

1,5 mól nátrium-klorid, 0,1 mól lizin és 0,1 % BSA stabilizátor összetételű oldatban diszpergáljuk, a pH-t 1 mólos nátrium-hidroxid-oldattal 6,0-ra állítjuk, majd pH 6,0 mellett a szuszpenziót 20 percig keverjük. A szuszpenziót műanyag Büchner tölcséren, Whatman 54 szűrőpapíron szűrjük át. A polielektrolit polimer lepényt eldobjuk és a szűrletet újra szűrjük műanyag Böchnet tölcséren Whatman 1 szűrőpapíron keresztül. A kapott szürlet térfogatát megmérjük és vizsgálat céljára mintát veszünk belőle.

A fenti polielektrolit adszorpciós eljárást megismételjük a fenti élesztő-tenyészet sejtmentes felülúszójával valamint a fenti E, coli és élesztő feltárt sejtszuszpenziókkal.

A VHI-as faktor vizsgálatokat a fentiekben kivett mintákon az ismert egy-lépéses aktivált PTT (részleges tromboplasztin idő) vizsgáló módszerrel (További háttér-információ az egy-lépéses PTT vizsgáló módszerről, lásd (Quick, „Hemorrhagic Diseases” Lea and Febiger Philadelphia, Pa., 1957, Langdell et ah, J. Láb. Clin. Med. 41.637 (1953) és Hardisty et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 7. 215 (1962). MLA Electra 750 Coagulation Timer-rel (Medica] Laboratory Automation, Inc.) végeztük.

Ez a berendezés optikai érzékelőt használ az alvadási folyamat megkezdődésének jelzésére. A koagulációs sebesség második differenciálhányadosát méri (azaz a koagulációs sebesség változásának sebességét). A mérést APTT (aktivált részeges tromboplasztin idő) reagens készlettel (Actiii ) és a kereskedelmi forgalomban Dadi Diagnostics, Inc. által eladott eljárással végezzük, mely Vni-as faktor hiányos plazmát és ellagin-sav aktivátort tartalmaz (3 486 981 számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírás). A koagulációs időket meghatározzuk a vizsgált minták említett hígítására és az eredményeket kinyert VHI-as faktor egységekben, valamint az eredeti kezeletlen minta (a minta) aktivitására vonatkoztatott, kinyert Vni-as faktor aktivitás százalékában fejezzük ki.

Az eredményt a következő I. táblázatban közöljük:

I. táblázat

Mikrobiális VlII-as faktor aktivitás (egység/kiindulási szint %)

Adszorbeá- VHI-as fák- Kinyert latlan VIII- tor aktivi- Vni-as as faktor tás a mosás faktor aktiaktivitás mintában vitás ad a b mintá- (s) mintában _ízaa___

E. coli sejtmentes felülúszó 0,5/0,2% 0,7/0,3% 181/68.6%

E. coli feltárt sejt szuszpenzió 0,8/0,3% 0,6/0,2% 135/61.1%

196 832

Élesztő sejt mentes felültiszó 0,3/0,1% 0,8/0,3% 164/62.1%

Élesztő feltárt 5 sejt szuszpenzió 0,7/0,3% 0,7/0,3% 151/57,2%

Λζ eredmények a VHI-as faktor aktivitás baktérium és élesztő tenyészlevekből és feltárt sejtszuszpenziókból való nagy tisztaságú és jelentős mértékű kinyerését bizonyítják.

2. példa

Ez a példa humán szérum-albumin elválasztását mutatja be baktérium és élesztő-tenyészetekből polielektrolit kopolímeres adszorpcióval. -jc.

Λζ E. coli és S. cerevisiae sejteket a fenti, első példa szerint tenyésztjük és dolgozzuk fel. A humán szérum albumint (Conn Factor V., J. A. C. S., 68,

459 /1946/) a sejtmentes felülúszókban és a feltárt sejtek fiziológiás só-oldatban (30—190 ml hígítás) készült folyadék fázisának hígításában inkubáljuk. 20 Az albumint ezután a megfelelő frakciókból a következő, vízben oldhatatlan, térhálós polielektrolit polimer gyantán (B gyanta) adszorbeáltatva választjuk el:

A B gyanta 90 mól % függő dimetil-amino-propilimid csoportot tartalmazó, 5 mól % metilimino- 25 -bis(propilamin)-nal térhálósított, lényegében ekvimoláris mennyiségű etilénből és maleinsav-anhidridből készült kopolimer. Ezt a polielektrolit kopolimert a reagensek és mólarányok szempontjából lényegében a 4 097 473 és 4 118 554 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás 1. példájában és a 4 157 431 sz. Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírás 12. példájában leírt módszerekkel állítjuk elő.

A jelen példa szerint 200 mg/ml koncentrációjú albumin oldatból 2,4 ml-t keverünk, az előzőekben gg említett sejtmentes felülúszók és feltárt sejt hígítások 20 ml-es mintáiba. Ezeknek a mintákban vizsgáltuk a teljes fehérje-tartalmát az albumin hozzáadása előtt és után, hogy egy alapvonalat és a kezdeti albumin-szintet meghatározzuk. A teljes fehérjetartalmat a Bio-Rad Assay Kit-tel határoztuk meg, 40 mely a kereskedelmi forgalomban kapható (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.)

Ez a készlet Bradford (Anal. Biochem. 72, 248 /1976/) módszerén alapuló festék-kötési mérőmódszert nyújt és a különböző fehérje-koncentrációkra adott differenciális festék színváltozást méri.

Mindegyik albumín-tartalmú keverékből 20 ml-t elkeverünk 200 mg B gyantával. A gyanta-szuszpenzió pH-ját 7,0-ra állítjuk, 30 percig keverjük, szűrjük, majd a gyantát háromszor mossuk 50-50 ml ionmentes vízzel. Az egyesített mosófolyadékoknak gQ az előzőeknek megfelelően meghatározzuk az összes fehérje-tartalmát. A gyanta-lepényeket 20-20 ml 0,04 mólos nátrium-klorid-oldatban szuszpendáljuk, pH-ját 4,0-ra állítjuk és a leoldott albumint tartalmazó vizes fázist szűréssel választjuk el. A leoldott minták összes fehéije-tartalmát az előzőek szerint 55 határozzuk meg. A kinyert albumin mennyiségét az «Albumin Standards and the Meascerement of Serurn Albumin with Bromcresol Green” (Clin.

Chem. Acta 31, 87 /1971/) cikkben leírt speciális módszerrel is meghatározzuk. Az összes fehérjetartalomra és az albumin mennyiségére vonatkozó 60 vizsgálati eredményeket a következő II. Táblázatban foglaljuk össze:

II. Táblázat
Vizsgált minta	Mikrobiális keverék
E. coli		Élesztő
	Sejt-	Feltárt	Sejt-	Feltárt
	mentes	sejt-	mentes	sejt-
	felül-	SZUSZ-	felül-	SZUSZ-
	úszó	penzió	úszó	penzió
TPC (mg) Kezdő alapvonal TPC (mg) Albumín tártál-	0,43	67	0,65	71
mú minták	624	647	576	600
TPC (mg) ' Mosófolyadék minták	15	0,42	0	7
TPC (mg) leoldott minták	431	456	337	433
Kinyerés (%-os alap) összes
fehérje) Kinyerés (%-os	69,0	70,5	58,5	72,0
alap) Albumin	60,5	95,6	63,9	65,0

+ összes fehérje tartalom

A fenti mintákat SDS-poliakrilamid gél-elektroforézissel is megvizsgáljuk. Az SDS elektroforézis során a mintákat röviden nátrium-dodecil-szulfáttal felmelegítjük, majd 7%-os poliakrilamid gél-elektroforézisnek vetjük alá konstans 20-40 mA/gél áramerősséggel, és a gél molekuláris szűrő hatása alapján a méret szerint elválasztjuk. A vándorlás sebessége kapcsolatban áll a molekulasúllyal. A géleket Coomassie Blue R-250 festékkel festjük meg és sűrűség-pásztázó technikákkal értékeljük. Az elektroforézis megerősíti az albumin kiváló elválasztását a mikrobiális és élesztő fermentlevek egyéb komponenseivel alkotott komplex keverékekből.

3. példa

Ez a példa bemutatja a humán VIH-as plazmafaktor elválasztását emberi májsejt-tenyészetből polielektrolit kopolimerekkel végzett adszorpcióval.

SK-HEP-1- májsejteket növesztünk 37°C-on, Dulbecco módosított minimál esszenciális táptalajban (MÉM), mely 4,5 mg/ml glükózt tartalmaz (KC Biologicals). A tenyésztő közeget 5 térfogat %borjú szérummal egészjtjük ki. A sejteket 75 cm²-es T-lombikokban (Falcon Plastics) először tapadó tenyészetben addig tenyésztjük, míg egybefüggő réteget nem képeznek, majd a sejtek egy részét forgatott lombikokban levő, kevert folyadék-szuszpenziós tenyészetbe visszük és ott fenntartjuk, lényegében a 4 059 485 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban közölt eljárás szerint.

A sejteket és a sejtmentes felülúszókat kinyerjük a T-lombikokban és a forgatott lombikokban levő sejttenyészet rendszerekből. A sejteket centrifugálással választjuk el a felülúszók tói, és négyszer fagyasztva-olvasztva tárjuk fel.

A humán VIH-as plazma-faktor kereskedelmi fór-81

1% 832 galomban levő, nagyon tiszta sűrítményét (AHF Cutter Laboratories, Inc.), inkubáliuk a sejtmentes felülúszók és a feltárt sejtek fiziológiás sóoldatban (0,9 % nátrium-klorid) került szuszpenzió mintában. Az inkubálás előtt a száraz Vlll-as faktort steril vízben oldjuk 240 egység/10 ml oldat koncentrációban. A forgatott tenyészet feltárt sejtjeiből hasonló mintát készítünk, külső VHI-as faktor hozzáadása nélkül (Z minta). A példában szereplő öt minta a következő:

V minta	- feltárt sejtek a T-lombik tenyé-
	szetéből,
W minta	- sejtmentes felülúszó a T-lombík tenyészetéből,
X minta	- feltárt sejtek a forgatott tenyészetből,
Y minta	- sejtmentes felülúszó a forgatott tenyészetből, és
Z minta	- feltárt sejtek a forgatott tenyészetből,

+ = Az összegyűjtött frissen fagyasztott plazma hideg oldhatatlan frakciójából tisztítva, a Hershgold és munkatársai (J. Láb. Clin. Med., 67, 23-32 /1966/) által leírt módszerek módosításával és finomításával.

A feloldott VII 1-as faktort részletekben ínkubáljuk a következők szerint:

ml (240 egység) VIH-as faktort keverünk 100 ml, a V mintából származó feltárt sejtek szuszpenziójával 90 ml normál sóoldatban és egy inl Aprotinin proteáz inhibitorral:

ml (240 egység) VIII-as faktort adunk 190 ml a W mintából származó sejtmentes felülúszóhoz és egy ml Aprotinin proteáz-gátlóhoz, ml (240 egység) VIII-as faktort keverünk 15 ml, az X mintából származó feltárt sejtek szuszpenziójához 173 ml normál sóoldatban:

9,5 ml (228 egység) VIII-as faktort adunk 191, az Y mintából származó sejtmentes felülúszóhoz.

ml a Z mintából származó feltárt sejtet adunk 185 ml normál sóoldathoz, külső VIII-as faktor hozzáadása nélkül.

Az elválasztási eljárást a következőképpen hajtjuk végre:

Az X és Z minták esetében a mintákat először 70,0 mg B gyantával (lásd 2. példa) keverjük össze, a pH-t 8,0 -ra állítjuk és a szuszpenziót 20 percig ezen a pH-η kevertetjük. A keveréket Büchner tölcséren, Whatman 54 szűrőpapíron szűrjük keresztül. A gyantát desztillált vízzel egy főzőpohárban mossuk a szűrőpapírról és 5 percig keverjük. Ezt a keveréket Büchner tölcséren Whatman 8 szűrőpapíron szűrjük át. A gyantát eldobjuk és a két szürletet egyesítjük. A szürletetek térfogatát feljegyezzük és a szürletet ugyanúgy vizsgáljuk, mint a B gyantán nem adszorbeált frakciót.

A V, W és Y mintákat (B gyantával nem kezelt), valamint a fentiek szerint kezelt X és Z mintákat (B gyantával való kezelés után nyert szürletek) előre kondicionált A gyantával (lásd 1. példa kezeljük az alábbiak szerint:

A mintát és a gyantát összekeverjük, a pH-t 5,8ra állítjuk és a kapott szuszpenziót 20 percig keverjük ezen a pll-π. A szuszpenziót Büchner tölcséren Whatman 54 papíron szűrjük meg. Mielőtt a lepény kiszárad és ftiegreped, a szürlet térfogatát feljegyezzük, mintát veszünk belőle és ugyanúgy vizsgáljuk, mint az A gyantán nem adszorbeált frakciót, majd 200 ml, 0,1% BSA-t tartalmazó 0,002 mólos nátrium-klorid-oldatot öntünk a lepényre és a teljes szürletet elöntjük. A lepényt 200 ml, 0,1% BSA -t tartalmazó 0,3 mólos nátrium-klorid oldatban szuszpendáljuk és 5 percig pH 5,8-on keverjük. A ¹ szürletet Büchner tölcséren Whatman 54 szűrőpapíron szűrjük meg. Mielőtt a lepény megszárad és megreped, a szürlet térfogatát feljegyezzük, mintát veszünk belőle, mint a mosó-folyadékból, majd 200 ml, 0,1% BSA-t tartalmazó 0,3 mólos nátrium-klo15 rid-oldatot öntünk a lepényre és a teljes szürletet elöntjük. A gyanta-lepényt 200 ml, 1,5 mólnátrium-klorid, 0,1 mól lizin és 0,01 mól nátrium-citrát, 0,1% BSA összetételű vizes eluáló oldatban szuszpendáljuk, majd 20 percig pH 6-on kevertetjük. A szuszpenziót Büchner tölcséren Whatman 54 papíron szűrjük. A gyanta-lepényt eldobjuk és a kapott szürletet újra szűrjük Büchner tölcséren Whatman 1 szűrőpapíron keresztül. A szürlet térfogatát feljegyezzük és mintát veszünk belőle vizsgálat céljából, mint a végső VIII-as faktor frakcióból.

A VIII-as faktor méréseket az ilyen újra kezelt mintákon ugyanúgy végezzük, mint az 1. példában, és az eredményeket kinyert VIII-as faktor egységekben fejezzük ki. Az eredményeket a következő III. Táblázat-ban közöljük.

III. táblázat

Vizsgált	VIH-í	is faktor aktivitás-egység
minta	V	W	X	Y	Y Z
	min ta min ta min ta min ta min tanún ta
Feltárt sejtek* Feltárt sejtek*	93		198		198
VHI-as faktor	300		602
Sejtmentes felülúszó Sejtmentes felülúszó		0		3
+ VIII-as faktor		240		228
B gyanta adszorbeálatIan anyag			375		104
A gyanta adszorbeálatlan anyag	6	1	3	2	3
Mosófolyadék Végső eluált VHI-as	3	2	3	5	2
faktor	100	208	172	190	39

Az eredmények a VIII-as faktor-aktivitás kinyerését mutatják májsejt-tenyésze lekből.

4. példa

Lényegében az 1 -3. példákban leírtakhoz ha55 sonló eredményeket kapunk, ha ekvivalens mennyiségű propilénnel vagy izobutilénnel helyettesítjük az etilént, és/vagy ekvivalens mennyiségű citrakonsav, itakonsav vagy akonitsav anhidriddel helyettesítjük a maleinsav-anhidridct és/vagy ha az említett 1-3 példákban ekvivalens mennyiségű dietil-amino-etil60 aminnal helyettesítjük a dimetilaminpropilamint.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás plazma-protein elválasztására sejtte- 5 nyészet rendszerből, azzal jellemezve, hogy sejttenyészet rendszert olefines telítetlenségű monomer és a· β-telítetlen polikarbonsav vagy anhidridje, di-(kis szénatomszámú)-alkil-amino-(kis szénatomszámú)-alkil-imid funkciós csoportot tartalmazó, víz- ~ ben oldhatatlan, térhálós polielektrolit kopolimerjével hozzuk érintkezésbe.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy sejttenyészet rendszerként mikrobiális sejttenyészet rendszert alkalmazunk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal j e 11 e- -,5 in e z v e, hogy sejttenyészet rendszerként emlős sejttenyészet rendszert alkalmazunk.
4. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal j e 11 e in e z v e, hogy a sejttenyészet rendszerként míkrobiális fermentációs tenyészetet alkalmazunk.
5. A 3. igénypont szerinti eljárás azzal j e 1 1 e- 20 in e z v e, hogy az emlős sejttenyészet rendszerként kimerített sejttenyészetet alkalmazunk.
6. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy mikrobiális sejttenyészet rendszerként feltárt mikrobiális sejtek izolátumát alkalmazzuk. 25
7. A 3. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy emlős sejttenyészet rendszerként feltárt emlős-sejtek izolátumát alkalmazzuk.
8. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy mikrobiális sejttenyészet rendszerként baktérium sejtek tenyészetét alkalmazzuk.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy baktérium-sejtek tenyészeteként Escherichia coli sejtek tenyészetét alkalmazzuk.
10. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy mikrobiális sejtenyészet rendszer- 05 ként élesztő-sejtek tenyészetét alkalmazzuk.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás azzal j e 1 lémé z v e, hogy élesztő-sejtek tenyészeteként Saccharomyces cerevisiae sejtek tenyészetét alkalmazzuk.
12. A 3. igénypont szerinti eljárás módja, azzal jellemezve, hogy emlős-sejtek tenyészet rendszerként humán májsejtek tenyészetét alkalmazzuk.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy humán májsejtek tenyészeteként SK-HEP-1 sejtek tenyészetét alkalmazzuk.
14. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal j e 1 lémé z v e, hogy olefin-típusú telítetlen monomerként etilént és az α- β telítetlen polikarbonsavként vagy -anhidridként maleinsavat, vagy -anhidridet alkalmazunk.
15. A 14, igénypont szerinti eljárás azzal j e 1 leni e z v e, hogy a di-kis szénatomszámú alkil-amino-kis szénatomszámú alkil-lmidként dimetil-propilimidet alkalmazunk.
16. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olefin jellegű telítetlen monomerként etilént, az a< p telítetlen polikarbonsavként vagy anhidridként maleinsavat vagy -anhidridet alkalmazunk, a polielektrolit, kopolimer körülbelül 3-7 mól% említett dimetilamino-propilimidet tartalmaz és az összes megmaradó szabad karboxil vagy anhidrid csoportokat alkoxi-alkilaminnal blokkoljuk, ahol az említett alkil- és alkoxi-csoportok 1-4 szénatomot tartalmaznak.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás azzal j e 1 lémé z v e, hogy olefin jellegű telítetlen monomerként etilént, a α· β telítetlen polikarbonsavként vagy -anhidridként maleinsavat vagy -anhidridet alkalmazunk, a függő di- kis szénatomszámú alkil-amino kis szénatomszámú alkilimid dimetilamino-propilimin és a polielektrolit kopolimer kb. 90—100 mól% említett függő dimetilamino-propilimidet tartalmaz.