CN113025684A - 活化部分凝血活酶时间检测试剂以及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种活化部分凝血活酶时间检测试剂以及包括上述活化部分凝血活酶时间检测试剂的活化部分凝血活酶时间检测试剂盒。活化部分凝血活酶时间检测试剂,包括磷脂、稳定剂、激活剂和缓冲液,所述稳定剂包括蛋白胨。这种活化部分凝血活酶时间检测试剂中添加了蛋白胨作为稳定剂,蛋白胨中含有20多种氨基酸,其可以提高激活剂在液体中的稳定性。与传统的APTT试剂相比,这种活化部分凝血活酶时间检测试剂的稳定性更好。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域,尤其涉及一种活化部分凝血活酶时间检测试剂以及包括该活化部分凝血活酶时间检测的试剂盒。
背景技术
当血管壁发生损伤,内皮下组织暴露,带负电荷的内皮下胶原纤维与凝血因子接触,因子XII与之结合,在激肽酶释放酶PK和高分子量激肽释放酶HK的参与下被活化为XIIa,继而将XI活化为XIa,后者将IX活化为IXa。在钙离子和磷脂存在的条件下,IXa、VIIIa、钙离子和磷脂形成复合物激活凝血酶原形成凝血酶,再将纤维蛋白原活化为纤维蛋白从而使血浆凝固。
凝固法测定活化部分凝血活酶时间,37℃条件下,向血浆中添加携带负电荷的特定激活物及标准量的脑磷脂混合液,经孵育后加入适当浓度的钙离子。从加入钙离子开始计时,直至纤维蛋白凝固形成凝块的时间即为活化部分凝血活酶时间检测值(APTT测定值)。
活化部分凝血活酶时间检测(APTT)试剂通常会采用鞣花酸作为激活剂,由于鞣花酸在液体中的不稳定,从而使得活化部分凝血活酶时间检测试剂的稳定性较差。
发明内容
基于此,有必要提供一种稳定性更好的活化部分凝血活酶时间检测试剂。
此外,还有必要提供一种包括上述活化部分凝血活酶时间检测试剂的试剂盒。
一种活化部分凝血活酶时间检测试剂,包括磷脂、稳定剂、激活剂和缓冲液,所述稳定剂包括蛋白胨。
一种试剂盒,包括钙盐溶液和上述的活化部分凝血活酶时间检测试剂。
这种活化部分凝血活酶时间检测试剂中稳定剂包括蛋白胨,蛋白胨中含有20多种氨基酸,氨基酸的分子结构、电荷分布及形成多重氢键的能力,使得氨基酸能与带有负电荷的激活剂产生静电作用,使激活剂均匀分布在溶液中,并且激活剂还对部分氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)具有吸附能力,而氨基酸易溶于水,因此提高了激活剂的溶解度。由此,蛋白胨可以起到稳定激活剂的空间结构及电荷量、提高激活剂的溶解度的作用,从而可以提高激活剂在液体中的稳定性。与传统的APTT试剂相比,这种活化部分凝血活酶时间检测试剂的稳定性更好。
结合测试例,蛋白胨可以极大的提高鞣花酸在液体中的稳定性,对这种活化部分凝血活酶时间检测试剂进行测试后发现其稳定性较好。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将结合具体实施方式对本发明进行更全面的描述。除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
本申请公开了一实施方式的活化部分凝血活酶时间检测试剂,包括磷脂、稳定剂、激活剂和缓冲液,稳定剂包括蛋白胨。
蛋白胨是通过蛋白酶水解从动物骨、内脏或毛皮制得,蛋白胨富含20多种氨基酸。
这种活化部分凝血活酶时间检测试剂中稳定剂包括蛋白胨,蛋白胨中含有20多种氨基酸,氨基酸的分子结构、电荷分布及形成多重氢键的能力,使得氨基酸能与带有负电荷的激活剂产生静电作用,使激活剂均匀分布在溶液中,并且激活剂还对部分氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)具有吸附能力,而氨基酸易溶于水,因此提高了激活剂的溶解度。由此,蛋白胨可以起到稳定鞣花酸空间结构及电荷量的作用,从而可以提高激活剂在液体中的稳定性。与传统的APTT试剂相比,这种活化部分凝血活酶时间检测试剂的稳定性更好。
本实施方式中,蛋白胨选自动物性蛋白胨、植物性蛋白胨和微生物蛋白胨中的至少一种。
具体来说,动物性蛋白胨包括胰蛋白胨、肉蛋白胨、骨蛋白胨、鱼蛋白胨、蚕蛹蛋白胨和血液蛋白胨,植物性蛋白胨包括大豆蛋白胨,微生物蛋白胨包括酵母蛋白胨。
具体来说,本实施方式中,蛋白胨选择胰蛋白胨。胰蛋白胨(胰酪蛋白胨)又称胰酪蛋白胨(Casein Tryptone)、胰酶消化酪蛋白(Pancreatic digest of casein),胰酶水解酪蛋白、胰酶水解酪素、胰酶水解干酪素等。胰蛋白胨是采用酪蛋白为原料,经过消化、脱色、过滤、浓缩、喷雾干燥而得到的一种浅黄色至类白色的干燥粉末。酪蛋白又称干酪素是从牛奶中提取的一种营养价值很高的磷蛋白,是生产蛋白胨常用的原料。用此原料生产的蛋白胨,其氨基酸比较齐全,特别是色氨酸的含量比较高。本实施方式中,活化部分凝血活酶时间检测试剂中,稳定剂的浓度为1g/L~10g/L。
具体来说,稳定剂的浓度可以为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L或10g/L。
一般来说,激活剂可以为鞣花酸、鞣花酸的盐或鞣花酸的金属螯合物。鞣花酸在溶液中因电解而带有负电荷,氨基酸的分子结构、电荷分布及形成多重氢键的能力,使得氨基酸能与带有负电荷的鞣花酸分子产生静电作用,使鞣花酸均匀分布在溶液中。此外,鞣花酸对部分氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)具有吸附能力,且氨基酸易溶于水,因此提高了鞣花酸的溶解度。本实施方式中,活化部分凝血活酶时间检测试剂中,激活剂的浓度为0.05mmol/L~0.2mmol/L。
具体来说,激活剂的浓度可以为0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.15mmol/L或0.2mmol/L。
磷脂作为APTT试剂中主要成分,参与血浆凝固。
一般来说,磷脂可以为兔脑磷脂或牛脑磷脂。
本实施方式中,活化部分凝血活酶时间检测试剂中,磷脂的浓度为0.1g/L~1g/L。
具体来说,磷脂的浓度可以为0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L或1g/L。
本实施方式中,稳定剂还包括甘露醇,甘露醇用于维持蛋白空间结构。甘露醇能使酶蛋白稳定,阻止细胞膜蛋白质分子的聚集,从而保护酶蛋白结构不被破坏。
活化部分凝血活酶时间检测试剂中,甘露醇的浓度为1g/L~10g/L。
具体来说,甘露醇的浓度可以为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L或10g/L。
本实施方式中,稳定剂还包括分子量为6000~20000的聚乙二醇,聚乙二醇作为表面活性剂可以使鞣花酸均匀的分散在试剂中。
聚乙二醇是一种非离子型表面活性剂,分子式为H-(O-CH2-CH2)n-OH,其中的氧桥原子-O-亲水,-CH2-CH2-疏水。聚乙二醇通常情况下是一根锯齿状的长链,当溶于水时长链为曲折形,亲水性的氧桥原子被水分子拉出处于链的外侧,疏水的部分处于内部,曲折行长链可进一步弯曲成不同形状,每个聚乙二醇长链分子的外部可当成亲水性外壳。因此聚乙二醇可以被看成是亲水基朝外,疏水基朝内的小分子定向排列的反胶束,将不易溶于水的鞣花酸包裹而均匀分布于溶液中,这种胶束增容作用相当于增大了鞣花酸的溶解度。
活化部分凝血活酶时间检测试剂中,分子量为6000~20000的聚乙二醇的浓度为0.5g/L~5g/L。
具体来说,分子量为6000~20000的聚乙二醇的浓度为0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L或5g/L。
本实施方式中,活化部分凝血活酶时间检测试剂还包括抗氧化剂,抗氧化剂的浓度为0.1g/L~0.5g/L,所述抗氧化剂为抗坏血酸。
具体来说,抗坏血酸的浓度可以为0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L或0.5g/L。
搭配甘露醇和聚乙二醇,添加抗坏血酸作为抗氧化剂时,可以防止鞣花酸存放时被氧化,从而进一步提高APTT试剂的灵敏度、稳定性及检测结果重复性好以及较长的保存时间(测试例)。
本实施方式中,活化部分凝血活酶时间检测试剂还包括防腐剂。防腐剂的浓度为0.1g/L~0.5g/L。
防腐剂可以为ProClin150、ProClin200、ProClin300或ProClin5000。
具体来说,Proclin300的浓度可以为0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L或0.5g/L。
本实施方式中,缓冲液为浓度为20mmol/L~100mmol/L、pH为6.5~8的Tris-HCl缓冲液。在其他的实施方式中,缓冲液还可以选择其他种类。
本申请还公开了一实施方式的试剂盒,包括钙盐溶液和上述的活化部分凝血活酶时间检测试剂。
一般来说,钙盐溶液可以为氯化钙溶液。
具体实施例
实施例1
称取10.9g Tris到800mL超纯水中,持续搅拌,用HCl调节PH值在7.20,定容缓冲液至1000mL,得到Tris-HCl缓冲液。
称取0.0302g鞣花酸溶解于1mL二甲基亚砜,再将溶液加入到上述缓冲液中使得鞣花酸终浓度为0.1mM,得到鞣花酸母液。
取10mL的鞣花酸母液,加入0.005g的兔脑磷脂、0.05g胰蛋白胨(OXOID.LTD,BASINGSTOKE,HAMPSHIRE,ENGLAND.LOT:1938556)、0.002g抗坏血酸以及0.02mL的Proclin300,搅拌均匀即可获得鞣花酸APTT试剂。
实施例2
取10mL实施例1制得的鞣花酸溶液,加入0.001g的兔脑磷脂、0.01g肉蛋白胨(源叶生物,LOT:A11A9B58441)、0.002g抗坏血酸以及0.02mL的Proclin300,搅拌均匀即可获得鞣花酸APTT试剂。
实施例3
取10mL实施例1制得的鞣花酸溶液,加入0.01g的兔脑磷脂、0.1g胰蛋白胨(源叶生物,LOT:A11A9B58441)、0.002g抗坏血酸以及0.02mL的Proclin300,搅拌均匀即可获得鞣花酸APTT试剂。
实施例4
取10mL实施例1制得的鞣花酸溶液,分别加入0.005g的兔脑磷脂、0.05g胰蛋白胨(OXOID.LTD,BASINGSTOKE,HAMPSHIRE,ENGLAND.LOT:1938556)、0.05g甘露醇、0.01g聚乙二醇6000、0.002g抗坏血酸以及0.02mL的Proclin300,搅拌均匀即可获得鞣花酸APTT试剂。
实施例5
取10mL实施例1制得的鞣花酸溶液,分别加入0.005g的兔脑磷脂、0.05g胰蛋白胨(OXOID.LTD,BASINGSTOKE,HAMPSHIRE,ENGLAND.LOT:1938556)、0.1g甘露醇、0.005g聚乙二醇6000、0.002g抗坏血酸以及0.02mL的Proclin300,搅拌均匀即可获得鞣花酸APTT试剂。
实施例6
取10mL实施例1制得的鞣花酸溶液,分别加入0.005g的兔脑磷脂、0.05g胰蛋白胨(OXOID.LTD,BASINGSTOKE,HAMPSHIRE,ENGLAND.LOT:1938556)、0.01g甘露醇、0.5g聚乙二醇6000、0.002g抗坏血酸以及0.02mL的Proclin300,搅拌均匀即可获得鞣花酸APTT试剂。
对比例
取10mL实施例1制得的鞣花酸溶液,分别加入0.005g的兔脑磷脂、0.05g甘氨酸、0.05g甘露醇、0.01g聚乙二醇6000、0.002g抗坏血酸以及0.02mL的Proclin300,搅拌均匀即可获得鞣花酸APTT试剂。
空白例
取10mL实施例1制得的鞣花酸溶液,分别加入0.005g的兔脑磷脂、0.05g甘露醇、0.01g聚乙二醇6000、0.002g抗坏血酸以及0.02mL的Proclin300,搅拌均匀即可获得鞣花酸APTT试剂。
测试例
对实施例1-6、对比例和空白例制得的APTT试剂进行观察,发现实施例1-6、对比例和空白例制得的APTT试剂均为浅黄色透明液体。
使用Stago原装正常质控血浆及异常质控血浆,在Stago的Emo Express全自动血凝仪上对实施例1和4-6、对比例和空白例制得的APTT试剂进行测定,记录血浆凝固时间。其中,钙离子试剂采用浓度为0.1g/L的氯化钙溶液,APTT测量正常值范围为25s~35s。
具体测试时,为了保证测试结果的准确性,以实施例1为例,按照实施例1的反应条件重复制备5次制备APTT试剂,得到5份APTT试剂,每份APTT试剂均试均重复测量10次,取最终平均值为测得的值。
对实施例1和4-6、对比例和空白例制得的APTT试剂进行精密度检测,检测结果如下表1所示。其中,S为标准偏差,X为平均值,误差CV=S/X。
表1:实施例1和4-6、对比例和空白例制得的APTT试剂的精密度检测值
均值X | 标准偏差S | 变异系数CV | |
实施例1 | 28.78 | 0.41 | 1.41% |
实施例4 | 27.21 | 0.27 | 0.82% |
实施例5 | 27.39 | 0.28 | 0.64% |
实施例6 | 27.31 | 0.39 | 0.71% |
对比例 | 31.18 | 0.78 | 2.51% |
空白例 | 35.60 | 1.09 | 3.06% |
由表1可以看出实施例1和4-6中制得的APTT的测试精密度明显优于对比例和空白例。
对实施例1、实施例4、对比例和空白例制得的APTT试剂进行稳定性检测。稳定性检测包括开封后稳定性、模拟条件稳定性、未开封加速破坏试验、长期稳定性试验。
对实施例1和4、对比例和空白例制得的APTT试剂进行开封后稳定性测试,测试的温度为4℃,测试结果如下表2所示。
表2:实施例1和4、对比例和空白例制得的APTT试剂的开封后稳定性测试
结合表2,实施例1和4的开封后稳定性实验结果显示,30天内正常质控血浆测值在正常范围以内,异常质控血浆检测值在给定范围以内且二者变异系数均小于5%。
对实施例1和4、对比例和空白例制得的APTT试剂进行高温运输条件测试,测试的温度为38℃,测试结果如下表3所示。
表3:实施例1和4、对比例和空白例制得的APTT试剂的高温运输条件测试
结合表3,实施例1和4的高温运输条件测试实验结果显示,高温运输条件下,10天之内正常质控和异常质控均在给定范围以内,偏差小于5%。
对实施例1和4、对比例和空白例制得的APTT试剂进行冷冻运输条件测试,测试的温度为-5℃,测试结果如下表4所示。
表4:实施例1和4、对比例和空白例制得的APTT试剂的冷冻运输条件测试
结合表4,实施例1和4的冷冻运输条件测试实验结果显示,冷冻运输条件下,30天之内正常质控和异常质控均在给定范围以内,偏差小于5%。
对实施例1和4、对比例和空白例制得的APTT试剂进行37℃加速破坏试验,测试的温度为37℃,测试结果如下表5所示。
表5:实施例1和4、对比例和空白例制得的APTT试剂的37℃加速破坏试验
结合表5,实施例1和4的37℃加速破坏试验实验结果显示,正常质控与异常质控血浆检测值在21天内基本保持稳定,均处于给定范围。
结合上述表1-表5可以看出,实施例4制得的APTT试剂的测试精密度和稳定性显著优于对比例和空白例。实施例1制得的APTT试剂的测试精密度和稳定性优于对比例,显著优于空白例。
也就是说,实施例1在仅添加蛋白胨,未添加甘露醇、聚乙二醇6000等常规稳定剂的情况下,依然使得制得的APTT试剂具有较高的稳定测试精密度和稳定性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种活化部分凝血活酶时间检测试剂,其特征在于,包括磷脂、稳定剂、激活剂和缓冲液,所述稳定剂包括蛋白胨。
2.根据权利要求1所述的活化部分凝血活酶时间检测试剂,其特征在于,所述蛋白胨选自动物性蛋白胨、植物性蛋白胨和微生物蛋白胨中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的活化部分凝血活酶时间检测试剂,其特征在于,所述动物性蛋白胨包括胰蛋白胨、肉蛋白胨、骨蛋白胨、鱼蛋白胨、蚕蛹蛋白胨和血液蛋白胨,所述植物性蛋白胨包括大豆蛋白胨,所述微生物蛋白胨包括酵母蛋白胨。
4.根据权利要求3所述的活化部分凝血活酶时间检测试剂,其特征在于,所述活化部分凝血活酶时间检测试剂中,所述稳定剂的浓度为1g/L~10g/L。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的活化部分凝血活酶时间检测试剂,其特征在于,所述激活剂为鞣花酸、鞣花酸的盐或鞣花酸的金属螯合物,所述磷脂为兔脑磷脂或牛脑磷脂;
所述活化部分凝血活酶时间检测试剂中,所述激活剂的浓度为0.05mmol/L~0.2mmol/L,所述磷脂的浓度为0.1g/L~1g/L。
6.根据权利要求5所述的活化部分凝血活酶时间检测试剂,其特征在于,所述稳定剂还包括甘露醇;所述活化部分凝血活酶时间检测试剂中,所述甘露醇的浓度为1g/L~10g/L。
7.根据权利要求6所述的活化部分凝血活酶时间检测试剂,其特征在于,所述稳定剂还包括分子量为6000~20000的聚乙二醇;所述活化部分凝血活酶时间检测试剂中,所述分子量为6000~20000的聚乙二醇的浓度为0.5g/L~5g/L。
8.根据权利要求5所述的活化部分凝血活酶时间检测试剂,其特征在于,所述活化部分凝血活酶时间检测试剂还包括抗氧化剂,所述抗氧化剂的浓度为0.1g/L~0.5g/L;
所述活化部分凝血活酶时间检测试剂还包括防腐剂,所述防腐剂的浓度为0.1g/L~0.5g/L;
所述缓冲液为浓度为20mmol/L~100mmol/L、pH为6.5~8的Tris-HCl缓冲液。
9.一种试剂盒,其特征在于,包括钙盐溶液和如权利要求1~8中任一项所述的活化部分凝血活酶时间检测试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述钙盐溶液为氯化钙溶液。
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