CN114397460B - 生物标记物的保存液以及生物标记物试剂 - Google Patents

生物标记物的保存液以及生物标记物试剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物标记物的保存液及其包括该保存液的生物标记物试剂，生物标记物的保存液包括蛋白稳定剂以及作为溶剂的缓冲液，生物标记物的保存液的pH为6.5～8；蛋白稳定剂包括血液蛋白胨，血液蛋白胨包括氨基酸和短肽，并且血液蛋白胨不包括多肽，血液蛋白胨的浓度为1.5g/L～12gL。这种生物标记物的保存液通过使用血液蛋白胨作为蛋白稳定剂，血液蛋白胨可以较好的复现血液中的环境，从而对生物标记物起到较好的稳定作用，避免生物标记物形成聚集物。结合实施例部分的数据，这种生物标记物的保存液保存的生物标可以在较长时间保存后依然具有足够的抗原抗体活性和发光性质。

Description

生物标记物的保存液以及生物标记物试剂
技术领域
本发明涉及化学发光检测技术领域，尤其是涉及一种生物标记物的保存液以及包括该生物标记物的保存液的生物标记物试剂。
背景技术
化学发光检测的基本原理，是将化学发光剂作为示踪物与抗体或抗原结合，形成生物标记物，生物标记物与相应的抗原或抗体结合，形成示踪物标记的抗原-抗体复合物，通过对该复合物进行化学发光检测得到定量数据。
生物标记物作为化学发光检测的核心试剂，其保存一直是业内需要重点关注的一个问题。一般来说，生物标记物的保存容易出现如下问题：抗原或抗体本质上是蛋白质，蛋白质在保存过程中容易因为各种原因变性，从而导致抗原或抗体的活性降低乃至失活。
发明内容
基于此，有必要提供一种可以解决上述问题的生物标记物的保存液。
此外，还有必要提供一种包括上述生物标记物的保存液的生物标记物试剂。
一种生物标记物的保存液，包括蛋白稳定剂以及作为溶剂的缓冲液，所述生物标记物的保存液的pH为6.5～8；
所述蛋白稳定剂包括血液蛋白胨，所述血液蛋白胨包括氨基酸和短肽，并且所述血液蛋白胨不包括多肽，所述血液蛋白胨的浓度为1.5g/L～12gL。
在一个实施例中，所述短肽为二肽和/或三肽。
在一个实施例中，所述血液蛋白胨为市售蛋白胨经过再一次酶促水解后得到。
在一个实施例中，所述市售蛋白胨为猪血蛋白胨。
在一个实施例中，所述酶促水解的操作中使用的酶选自丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和谷氨酸蛋白酶中的至少一种。
在一个实施例中，所述蛋白稳定剂还包括水溶性蛋白。
在一个实施例中，所述水溶性蛋白的浓度为0.1g/L～1gL。
在一个实施例中，所述水溶性蛋白为BSA。
在一个实施例中，所述缓冲液为10mmol/L～100mmol/L、pH为6.5～8的PBS缓冲液。
一种生物标记物试剂，包括生物标记物以及上述的保存液。
这种生物标记物的保存液通过使用血液蛋白胨作为蛋白稳定剂，血液蛋白胨可以较好的复现血液中的环境，从而对生物标记物起到较好的稳定作用，避免生物标记物中的抗原或抗体变性。
结合实施例部分的数据，这种生物标记物的保存液保存的生物标记物可以在较长时间保存后依然具有足够的活性和发光性质。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明公开了一实施方式的生物标记物的保存液，蛋白稳定剂以及作为溶剂的缓冲液，生物标记物的保存液的pH为6.5～8。
针对生物标记物的保存容易出现蛋白质变性导致的活性降低乃至失活的问题。
本发明中生物标记物的保存液中的蛋白稳定剂用于稳定生物标记物中的蛋白质，避免蛋白质变性。
具体来说，蛋白稳定剂包括血液蛋白胨，血液蛋白胨包括氨基酸和短肽，并且血液蛋白胨不包括多肽，血液蛋白胨的浓度为1.5g/L～12gL。
血液蛋白胨可以较好的复现血液环境，而血液环境是抗原、抗体最为稳定的工作环境。
本发明中，短肽指由3个～9个氨基酸残基组成的短链肽，由10个～100个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽，多肽的分子量低于10000Da。
为了避免抗原、抗体与血液蛋白胨中的物质发生特异性结合，影响到抗原、抗体的活性，本发明中的血液蛋白质中不包括多肽。
这种生物标记物的保存液通过使用血液蛋白胨作为蛋白稳定剂，血液蛋白胨可以较好的复现血液中的环境，从而对生物标记物起到较好的稳定作用，避免生物标记物中的抗原或抗体变性。
结合实施例部分的数据，这种生物标记物的保存液保存的生物标记物可以在较长时间保存后依然具有足够的活性和发光性质。
本实施方式中，生物标记物可以为示踪物标记的抗原或抗体。
示踪物可以为化学发光剂。
一般来说，在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。
化学发光剂需要满足如下条件：①发光的量子产率高；②它的物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；③能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；④其化学发光常是氧化反应的结果；⑤在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。
常见的化学发光剂包括吖啶酯和三联吡啶钌。
优选的，生物标记物的保存液中，血液蛋白胨的浓度为2g/L～8gL。
更优选的，本发明中，短肽为二肽和/或三肽。这样的进一步避免短肽与抗原、抗体发生特异性结合。此外，氨基酸、二肽和三肽共同组成的体系，可以更好的对生物标记物起到稳定的作用。
优选的，本发明中，血液蛋白胨为市售蛋白胨经过再一次酶促水解后得到。
考虑到一般的市售蛋白胨中，肽的组成比较复杂，通常会含有较多的多肽，为了将这部分多肽去除，需要对其进行再一次的酶促水解。
优选的，市售蛋白胨为猪血蛋白胨。猪血蛋白胨中含有十八种氨基酸，抗原性低，且价格便宜。
优选的，酶促水解的操作中使用的酶选自丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和谷氨酸蛋白酶中的至少一种。
本实施方式中，蛋白稳定剂还包括水溶性蛋白，水溶性蛋白的浓度为0.1g/L～1gL。水溶性蛋白可以保持抗原、抗体的生物活性，并且还可以降低因为受热、表面张力等因素引起的抗原、抗体团聚。
优选的，水溶性蛋白为BSA。
缓冲液主要起到稳定pH值的作用。
本实施方式中，缓冲液为10mmol/L～100mmol/L、pH为6.5～8的PBS缓冲液。
更优选的，PBS缓冲液的pH为6.8～7.3。
本发明还公开了一实施方式的生物标记物试剂，包括生物标记物以及上述的保存液。
生物标记物可以为示踪物标记的抗原或抗体，示踪物可以为化学发光剂。
常见的化学发光剂包括吖啶酯和三联吡啶钌。
以下为具体实施例。
实施例1
将市售的血液蛋白胨(血粉蛋白胨，购自SIGMA公司)加水稀释5倍后加入体积比为0.1％的酶溶液，酶溶液为体积比为1：1的丝氨酸蛋白酶溶液和半胱氨酸蛋白酶溶液。在pH为7.2～7.6，温度为45℃～55℃，酶促水解反应12h，接着通过1000Da的超滤膜过滤分离，得到血液蛋白胨溶液。
按照体积比为1：3，将血液蛋白胨溶液和25mmol/L的PBS缓冲液混合，调节pH至7.1，接着加入BSA溶液、甘露醇和木糖醇，得到生物标记物的保存液。其中，BSA的浓度为0.25g/L，甘露醇的浓度0.1g/L，木糖醇的浓度0.1g/L。
实施例2
按照体积比为1：9，将实施例1得到的血液蛋白胨溶液和25mmol/L的PBS缓冲液混合，调节pH至7.1，接着加入BSA溶液、甘露醇和木糖醇，得到生物标记物的保存液。其中，BSA的浓度为0.25g/L，甘露醇的浓度0.1g/L，木糖醇的浓度0.1g/L。
实施例3
按照体积比为1：1.5，将实施例1得到的血液蛋白胨溶液和25mmol/L的PBS缓冲液混合，调节pH至7.1，接着加入BSA溶液、甘露醇和木糖醇，得到生物标记物的保存液。其中，BSA的浓度为0.25g/L，甘露醇的浓度0.1g/L，木糖醇的浓度0.1g/L。
实施例4
生物标记物试剂的配制以及发光测试。
将生物标记物(吖啶酯标记的血栓调节蛋白抗体，君和公司自产，货号为A20030)分别加入到实施例1～3制得的生物标记物的保存液，得到生物标记物试剂，记为A组、B组和C组，生物标记物试剂的浓度均为0.5μg/mL。
将得到的A组、B组和C组三组试剂取一份置于4℃冰箱中避光冷藏，另外取三份放置于37℃恒温恒湿箱中，分别在第4天、第7天和第14天取出上述37℃放置试剂，对上述生物标记物试剂取出进行发光测试，每组测试重复两次，测试信号值结果与4℃(0天)放置试剂比较，具体测试流程如下。
发光测试流程：依照血栓调节蛋白项目的试剂反应参数，设定化学发光仪参数，并装载上述配制好的吖啶酯试剂和试剂盒其他组分，上机测试。
第一步，将样本、生物标记物试剂和免疫磁珠试剂(顺磁性微粒上包被的血栓调节蛋白抗体，君和公司自产，货号为A20029)混合孵育：样本中的血栓调节蛋白和顺磁性微粒上包被的血栓调节蛋白抗体(君和公司自产，货号为A20030)及生物标记物试剂中的生物标记物(吖啶酯标记的血栓调节蛋白抗体，君和公司自产，货号为A20030)反应，形成夹心(抗体-抗原-抗体)复合物。
第二步，清洗：在磁场作用下，磁微粒吸附到反应管壁，未结合的物质被清洗液洗去。
第三步，激发和读数：在反应复合物中加入预激发液和激发液，通过相对发光强度测定化学发光反应。
样本中的血栓调节蛋白的量和测定仪光学系统测定到的相对发光强度(RLU)呈正相关。
上述测试结果如下表1～表3所示，测试信号值结果与第0天比较，偏差应在10％以内。
表1：A组试剂的发光测试结果
放置时间 测试值1 测试值2 均值 偏差
0d 18894 18762 18828 /
4d 18752 18458 18605 -1.18％
7d 18205 18154 18180 -3.44％
14d 18021 18109 18065 -4.05％
表2：B组试剂的发光测试结果
放置时间 测试值1 测试值2 均值 偏差
0d 17969 17843 17906 /
4d 16834 17554 17194 -3.98％
7d 16379 16431 16405 -8.38％
14d 15329 15222 15275 -14.69％
表3：C组试剂的发光测试结果
Figure BDA0003401556920000061
Figure BDA0003401556920000071
结合表1、表2和表3，可以看出，三组试剂均可以保证在储存37℃14天存储后，发光值偏差在30％以内。
其中，A组试剂的发光值偏差相对较小，并且发光值波动最小，B组试剂的发光值偏差其次，C组试剂的发光值波动最大。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (2)

1.一种生物标记物的保存液，其特征在于，生物标记物的保存液通过如下方法制备得到：
将血液蛋白胨加水稀释5倍后加入体积比为0.1％的酶溶液，酶溶液为体积比为1：1的丝氨酸蛋白酶溶液和半胱氨酸蛋白酶溶液；在pH为7.2～7.6，温度为45℃～55℃，酶促水解反应12h，接着通过1000Da的超滤膜过滤分离，得到血液蛋白胨溶液；
按照体积比为1：3，将血液蛋白胨溶液和25mmol/L的PBS缓冲液混合，调节pH至7.1，接着加入BSA溶液、甘露醇和木糖醇，得到生物标记物的保存液，其中，BSA的浓度为0.25g/L，甘露醇的浓度0.1g/L，木糖醇的浓度0.1g/L；
或者，按照体积比为1：9，将血液蛋白胨溶液和25mmol/L的PBS缓冲液混合，调节pH至7.1，接着加入BSA溶液、甘露醇和木糖醇，得到生物标记物的保存液，其中，BSA的浓度为0.25g/L，甘露醇的浓度0.1g/L，木糖醇的浓度0.1g/L；
或者，按照体积比为1：1.5，将血液蛋白胨溶液和25mmol/L的PBS缓冲液混合，调节pH至7.1，接着加入BSA溶液、甘露醇和木糖醇，得到生物标记物的保存液，其中，BSA的浓度为0.25g/L，甘露醇的浓度0.1g/L，木糖醇的浓度0.1g/L。
2.一种生物标记物试剂，其特征在于，包括生物标记物以及如权利要求1所述的保存液。
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