CN112326954B - 一种快速定量检测d-二聚体的均相荧光免疫的试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速定量检测D‑二聚体的均相荧光免疫的试剂。包括发光微球标记抗D‑二聚体单克隆抗体，感光微球亲和素复合物，生物素标记D‑二聚体单克隆抗体复合物；单组分试剂缓冲液和样本稀释液，其中所述单组分试剂缓冲液包括泛影酸钠，封闭液包括NP40，样本稀释液包括牛血清白蛋白和TW20。其中发光微球标记抗D‑二聚体单克隆抗体和生物素标记D‑二聚体单克隆抗体复合物中的抗体中，当为同时标记两株抗体是，至少有一个单克隆抗体是相同的，或者为标记单个抗体是，是两株不同的单克隆抗体。本发明可同时检测高值和低值D‑Dimer，尤其是低值D‑Dimer，且成本低廉，操作简单、快速、灵敏，且特异性好。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，尤其涉及一种快速定量检测D-二聚体的均相荧光免疫的试剂。
背景技术
人体纤溶系统，它对保持血管壁的正常通透性，维持血液的流动状态和组织修复起着重要作用。DD-二聚体血浆中水平增高说明存在继发性纤溶过程，而先生成凝血酶，后又有纤溶系统活化；并且也反映在血栓形成的局部纤溶酶活性或浓度超过血浆的2‰─抗纤溶酶活性或浓度。溶栓治疗是指用药物来活化纤维蛋白溶解系统。一般为投入一种纤溶酶原活化物如尿液酶、链激酶或组织型纤溶酶原活化物(tpA)，使大量纤溶酶生成，从而加速已形成血栓的溶解。FDP或D-二聚体生成，则表明达到溶栓效果。
纤溶蛋白降解产物中，唯D-二聚体交联碎片可反映血栓形成后的溶栓活性。因此，理论上，D-二聚体的定量检测可定量反映药物的溶栓效果、及可用于诊断、筛选新形成的血栓。但是，到目前为止，商品的D-二聚体检测手段都尚存在一定局限性。
目前临床检测D-二聚体的方法有自身红细胞凝集法、乳胶凝集法、酶联免疫吸附法(ELISA)、基于酶免疫法的荧光抗体检测法和免疫金标法。自身红细胞凝集法为半定量方法，其优点是可在全血中检测，省略了离心制备血浆的步骤。乳胶凝集法用于定性或根据其稀释度半定量测定标本中的D-二聚体的含量。酶联免疫吸附法(ELISA)检测D-二聚体不受胆红素、血红蛋白、纤维蛋白原、FDP干扰，因此更精确，敏感性更高。但操作要求严格费时，每次均需同时做标准曲线，不适于单个标本的测定。荧光抗体检测法是目前研究最多的一种检测方法，敏感性很高，与经典ELISA法有很好的一致性，但需要在专用的免疫分析仪上进行，设备成本昂贵。免疫金标法通过肉眼观察或用折射仪读数。与提供的标准色价或者测定标准品的折射读数，可计算出标本中D-二聚体的含量。该法既具有胶乳凝集法的操作简单、快速，适用于急诊测定的优点，不受胆红素，Hb、纤维蛋白原、可溶性的纤维蛋白及FDP等干扰，但对类风湿因子、肝素及脂血等有一定的干扰。均相化学发光法采用的是镧系元素铕(Eu)作为荧光材料，信号放大效果好、低本底、均相免洗、线性范围宽、操作简单、测试稳定性号，因而成为目前最热门的免疫分析技术。但同时，均相又存在液体不易保存，对运输环境要求极高这一问题。
发明内容
本发明为了解决这一问题，本发明提供一种快速定量检测D-二聚体的均相荧光免疫的试剂。
为实现上述目的，本发明提供一种快速定量检测D-二聚体的均相荧光免疫的试剂，其特征在于，包括发光微球标记抗D-二聚体单克隆抗体，感光微球亲和素复合物，生物素标记D-二聚体单克隆抗体复合物；单组分试剂缓冲液，封闭液和样本稀释液，其中所述单组分试剂缓冲液由0.05M TRIS、0.85％氯化钠、1.5％海藻糖、1-1.5％泛影酸钠、0.2-0.7％S7、0.5-0.8％TX-405、0.05％Proclin-300和纯水配制而成，其pH为7.4；所述封闭液其pH7.4，50mM-Tris+7.5％牛血清白蛋白、0.05-0.08％NP40和纯水配制而成；所述样本稀释液由0.05M hepes、0.85％氯化钠、6-7.5％牛血清白蛋白、0.2-0.7％TW20、0.05％Proclin-300和纯水配制而成，其pH为7.4；
其中发光微球标记抗D-二聚体单克隆抗体为发光微球混合标记两株抗D-二聚体单克隆抗体；生物素标记D-二聚体单克隆抗体复合物为生物素标记两株抗D-二聚体单克隆抗体；或者，
发光微球标记抗D-二聚体单克隆抗体为发光微球标记一株抗D-二聚体单克隆抗体；生物素标记D-二聚体单克隆抗体复合物为生物素标记不同的另外一株抗D-二聚体单克隆抗体。
进一步，所述发光微球标记抗D-二聚体单克隆抗体，感光微球亲和素复合物和生物素标记D-二聚体单克隆抗体复合物三者一起加入到单组分试剂缓冲液中成为一种混合物。
进一步，发光微球混合标记两株抗D-二聚体单克隆抗体和生物素标记D-二聚体单克隆抗体复合物中的抗体至少有一个单克隆抗体是相同的。
进一步，所述发光微球标记抗D-二聚体单克隆抗体的制备方法为，
清洗：取发光微球，加去离子水离心洗涤1-2次，弃上清液，得到洗涤后的发光微球；优选的，发光微球的浓度为10mg/ml；离心的转速为14000rpm，时间为10min；
活化：向上述洗涤后的发光微球中添加MES溶液，再依次加入EDC溶液和NHS溶液，超声后活化，再离心去上清，再用去离子水离心洗涤；
优选的，向上述洗涤后的发光微球中添加MES溶液，再依次加入EDC溶液和NHS溶液，超声后活化，再离心去上清，再用去离子水离心洗涤1-3次，弃上清液得活化后的发光微球；
更优选的，向上述洗涤后的发光微球中添加50mM pH5.0的MES溶液，再依次加入MES溶液一半体积的10mg/ml EDC溶液,和同样体积的10mg/ml NHS溶液，超声后将离心管放置在摇床上活化；活化的条件为30℃、250rmp/min，30min；再离心去上清，加入去离子水，离心洗涤1-3次，14000rpm，弃上清液得活化后的发光微球；
偶联：向上述活化后的发光微球中添加偶联液，超声后再加入两株DD单克隆抗体或者一株DD单克隆抗体，将离心管放置在摇床上偶联；优选的，偶联的条件为30℃、250rmp/min，2h；
封闭：偶联后，加入封闭剂进行封闭，封闭后，离心去上清，加去离子水离心洗涤1-3次，弃上清液，加入单组分试剂缓冲液悬浮即可；优选的，封闭的条件为30℃、250rmp/min，30min。
进一步，所述感光微球亲和素复合物的制备方法为，
清洗：取感光微球，加入去离子水，离心洗涤1-3次，弃上清液，得到洗涤后的感光微球；优选的，感光微球的浓度为10mg/ml；离心的转速为14000rpm，时间为10min；
活化：制备活化液(50mM MES缓冲液)，将EDC和NHS配制成10mg/ml。
向上述洗涤后的感光微球中添加MES溶液，再依次加入EDC溶液和NHS溶液，超声后活化；再离心去上清，加入去离子水离心洗涤1-3次，弃上清液得到活化后的感光微球；
优选的，向上述洗涤后的感光微球中添加50mM pH5.0的MES溶液，再依次加入MES溶液一半体积的10mg/ml EDC溶液,和同样体积的10mg/ml NHS溶液，超声后活化，活化条件为30℃、250rmp/min，30min；再离心去上清，加入去离子水，离心洗涤1-3次，14000rpm，弃上清液得活化后的感光微球；
偶联：向上述活化后的发光微球中添加偶联液，超声后再加入亲和素，将离心管放置在摇床上偶联；优选的，偶联的条件为30℃、250rmp/min，2h；
封闭：偶联后，加入封闭剂进行封闭，封闭后，离心去上清，加去离子水离心洗涤1-3次，弃上清液，加入单组分试剂缓冲液悬浮即可；优选的，封闭的条件为30℃、250rmp/min，30min。
进一步，所述生物素标记D-二聚体单克隆抗体复合物的制备方法为，将抗体，生物素依次加入到磷酸缓冲液中进行偶联；偶联结束后，将偶联好的生物素溶液放入透析袋中，透出多余的生物素，得到生物素标记D-二聚体单克隆抗体复合物；优选的，偶联的条件：500～700rmp/min、2h。
进一步，所述抗体为混合抗体或者单一抗体。
进一步，所述抗体：生物素的用量比例为50ug抗体：1ug生物素。
本发明还保护所述均相荧光免疫的试剂用于快速定量检测DD二聚体的用途。
本发明的单组分试剂缓冲溶液中添加了泛影酸钠，否则无法使几种成分混合到一起长期保存。
标记方式为两株单克隆抗体混合标记发光微球和生物素，比起单株标记能大大降低漏检率，同时提高检测灵敏度。本发明采用的微球标记封闭剂配方与传统封闭剂比较多加入了NP40，能有效降低标记过程中不稳定吸附在微球上的抗体，从而降低背景值，达到检测参考品线性宽，微球稳定性好的目的。
本发明的试剂在所确定的体系条件下，在0.1-30g/L之间呈良好的线性关系，而且灵敏度好，准确度高，批内和批间差均符合检测标准。并且该试剂盒与目前市场上进口电化学发光法试剂盒相比，具有操作简便、免洗、检测时间短、对设备要求低、不需要设备有管路清洗系统等优势，大大提高了检测效率。
本发明可同时检测高值和低值D-Dimer，尤其是低值D-Dimer，且成本低廉，操作简单、快速、灵敏，且特异性好，同现有的发光检测试剂比较，其操作简单，试剂可以冻干，易于长期保存使用，不影响试剂整体性能。
附图说明
图1是单组分试剂和多组分试剂荧光值线性比对结果图。
图2是抗体标记方式线性比对结果图。
图3是采用不同封闭液抗原参考品线性结果图。
图4是采用不同样本稀释液测试线性结果图。
图5是实验5-1到5-4的测试线性结果图。
图6是对照8的抗原参考品线性结果图。
图7是对照11的抗原参考品线性结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
DD-A1，DD-A2，均直接购买于厦门同仁心。货号XJ241/XJ243。
实施例1：单组分试剂与多组分试剂差异实验
单组分试剂缓冲溶液：所述单组分试剂缓冲液pH 7.4，由0.05M TRIS、0.85％氯化钠、1.5％海藻糖、1.00％泛影酸钠、0.5％S7、0.5％TX-405、0.05％Proclin-300和纯水配制而成。
以下分别制备组分1，组分2和组分3：
组分1：发光微球混合标记两株抗D-二聚体单克隆抗体的制备:
清洗：取100ul浓度为10mg/ml的发光微球(直接购买得到)，置于1.5ml塑料离心管中，加入100ul去离子水，离心洗涤2次，14000rpm，弃上清液，待用；
活化：向上述去离子水洗涤后的发光微球中添加100ul-MES缓冲液(即50mM pH5.0的MES)，再加入50ul-EDC缓冲液(10mg/ml，溶剂为50mM pH5.0的MES),再加入50ul-NHS缓冲液(10mg/ml，溶剂为50mM pH5.0的MES)，超声1min，将离心管放置在摇床上活化，活化条件为30℃、250rmp/min，30min。活化后，离心去上清，加入200ul去离子水，离心洗涤2次，14000rpm，弃上清液，待用。
偶联：向上述活化后的发光微球中添加200ul偶联液(50mM Hepes-Ph8.0)，超声1min，再加入两株DD单克隆抗体共50ug(先按照DD-A1：DD-A2的质量比1:1混合后再加入微球中)，将离心管放置在摇床上偶联，偶联条件为30℃、250rmp/min，2h。
封闭：偶联后，加入10ul封闭剂进行封闭，封闭条件为30℃、250rmp/min，30min。封闭后，离心去上清，加入200ul去离子水，离心洗涤2次，14000rpm，弃上清液，加入50ul悬浮液(单组分试剂缓冲液)悬浮。
组分2：感光微球亲和素复合物的制备：
清洗：取100ul浓度为10mg/ml的感光微球，置于1.5ml塑料离心管中，加入100ul去离子水，离心洗涤2次，14000rpm，弃上清液，待用；
活化：制备活化液(50mM MES缓冲液)，将EDC和NHS配制成10mg/ml。向上述去离子水洗涤后的感光微球中添加100ul-MES缓冲液，再加入50ul-EDC缓冲液(10mg/ml),再加入50ul-NHS缓冲液(10mg/ml)，超声1min，将离心管放置在摇床上活化，活化条件为30℃、250rmp/min，30min。活化后，离心去上清，加入200ul去离子水，离心洗涤2次，14000rpm，弃上清液，待用。
偶联：向上述活化后的感光微球中添加200ul-hepes缓冲液，超声1min，再加入50ug亲和素，将离心管放置在摇床上偶联，偶联条件为30℃、250rmp/min，2h。
封闭：偶联后，加入10ul封闭剂(8.5％BSA 10Mm Tris溶液稀释)封闭，封闭条件为为30℃、250rmp/min，30min。封闭后，离心去上清，加入200ul去离子水，离心洗涤2次，14000rpm，弃上清液，加入50ul悬浮液(Tris溶液)悬浮。
组分3：生物素标记抗体D-二聚体单克隆抗体的制备：
先按照DD-A1：DD-A2的质量比1:1混合后，再取50ug混合抗体、1ug生物素加入到50ul-10Mm磷酸缓冲液进行偶联，偶联条件：500～700rmp/min、2h。偶联结束后，将偶联好的生物素溶液放入透析袋中，透出多余的生物素，透析时长24h，其中更换两次透析液(10mM-PBS)。
单组分试剂组(即实施例1组)：将各组分(上述制备好的组分1、组分2和组分3)一起加入到单组分试剂缓冲液中，其中组分1、组分2和组分3的用量为按照终浓度为1/70、1/140、1/140的体积比例。37℃平衡后5天后取出，2～8℃保存或使用。
多组分试剂组(即对照1)：将实施例1中的组分1，组分2和组分3分别用单组分试剂缓冲液1/200、1/400、1/400稀释后，分别加入稀释后的样本中。
将上述单组分试剂组(即实施例1组)与多组分试剂组(即对照1)一起测试，测试方法为(其他实施例的测试方法均同此)：
样本用稀释液稀释后加入到反应孔中。
再将对照组或实验组加入到反应孔中，37℃孵育15min后，利用波长为680nm的激光照射反应孔，检测发光光子量。
数据见表1和图1。图1为单组分试剂和多组分试剂荧光值线性比对结果图。
表1单组分试剂和多组分试剂荧光值比对结果表
| 单组分试剂(实施例1组) | 多组分试剂(对照1) | |
| DD(g/L) | 信号值-1 | 信号值-2 |
| 30 | 1320310 | 1180857 |
| 15 | 1128951 | 1079160 |
| 8 | 638935 | 577783 |
| 4 | 248799 | 206600 |
| 2 | 92892 | 78490 |
| 1 | 26840 | 26225 |
| 0.5 | 10137 | 9093 |
| 0.25 | 4527 | 4158 |
| 0.1 | 2643 | 2302 |
| 0 | 2298 | 1923 |
从表1可以看出：单组分试剂较多组份试剂而言，线性相差不大，但单组分试剂测试荧光值略高10％左右。且37℃稳定性较优，能实现高温5天后平衡。
为了检测实施例1组与对照1试剂的稳定性，进行不同处理，制备好试剂后，37℃放置不同时间后测定，其结果见表2-3。
表2单组分试剂(实施例1组)稳定性结果表
表3多组分试剂(对照1)稳定性结果表
从表2-3可以看出：实施例1组即单组分试剂组较对照1即多组份试剂组而言，37℃稳定性较优，能实现高温5天后平衡。
实施例2：发光微球、生物素抗体混合标记与分开标记的实验
单组分试剂的制备：同实施例1组。
对照2：组分1的发光微球标记抗D-二聚体单克隆抗体，其中的抗体为A1(记为发光微球标记-A1)，组分3的生物素标记抗体D-二聚体单克隆抗体，其中的抗体为A2(记为生物素标记-A2)；组分2同上。
对照3：组分1的发光微球标记抗D-二聚体单克隆抗体，其中的抗体为A2(记为发光微球标记-A2)，组分3的生物素标记抗体D-二聚体单克隆抗体，其中的抗体为A1(记为生物素标记-A1)；组分2同上。
测试方法为：同实施例1。
结果见表4-7和图2。图2为抗体标记方式线性比对结果图。
表4抗体不同标记方式荧光值结果表
表5实施例1组(混合两株抗体标记)的荧光值结果表
表6对照2的荧光值结果表
表7对照3的荧光值结果表
结论：混合标记较分开标记而言，抗原参考品线性偏差不大，但测试荧光值略高20％左右，且37℃稳定性较优，能实现高温5天后平衡。
实施例3：不同封闭剂配方的实验
实施例3组的封闭液：50mM-Tris(pH 7.4)+7.5％牛血清白蛋白、0.05％NP40和纯水配制而成。
对照4中的封闭液由50mM-Tris(pH 7.4)+7.5％牛血清白蛋白和纯水配制而成。
对照5中的封闭液由50mM-Tris(pH 7.4)+7.5％牛血清白蛋白+0.5％吐温80和纯水配制而成。
对照6中的封闭液由50mM-Tris(pH 7.4)+7.5％牛血清白蛋白+0.5％TX+405和纯水配制而成。
对照7中的封闭液由50mM-Tris(pH 7.4)+7.5％牛血清白蛋白+0.5％S9和纯水配制而成。
对照4-7与实施例3所述试剂一起测试，数据见表8-12和图3。图3为采用不同封闭液抗原参考品线性结果图。
表8实施例3及对照4-7使用不同封闭剂的测试荧光值结果表
| 实施例3 | 对照4 | 对照5 | 对照6 | 对照7 | |
| DD(g/L) | 信号值-1 | 信号值-2 | 信号值-3 | 信号值-4 | 信号值-5 |
| 30 | 1305813 | 1558267 | 1050849 | 1097917 | 1309994 |
| 15 | 1133838 | 1361847 | 928057 | 909732 | 1016532 |
| 8 | 631365 | 765530 | 500133 | 514889 | 1122852 |
| 4 | 236297 | 289798 | 200887 | 199304 | 871313 |
| 2 | 85758 | 109228 | 69648 | 68315 | 952545 |
| 1 | 27959 | 34016 | 22624 | 22757 | 169408 |
| 0.5 | 10052 | 12337 | 7675 | 8562 | 1905 |
| 0.25 | 4846 | 5952 | 3695 | 3536 | 1696 |
| 0.1 | 2703 | 3369 | 2005 | 2120 | 7278 |
| 0 | 2232 | 2721 | 1785 | 1829 | 3006 |
表9采用实施例3的封闭剂后的测试荧光值结果表
表10采用对照4的封闭剂后的测试荧光值结果表
表11采用对照5的封闭剂后的测试荧光值结果表
表12采用对照6的封闭剂后的测试荧光值结果表
从表8-12可以看出：对照4中只添加牛血清白蛋白进行封闭，测试荧光值高30％，但由于不稳定的吸附较多，导致37℃稳定性性能较差，存在荧光值不稳定的情况。对照5-6添加tw80或TX-405后均存在初值荧光值较低，且37℃稳定性较差的情况。对照7中添加了S9导致抗原参考品不成线性，故不做37℃稳定性性能研究。
实施例4：不同的样本稀释液配方的实验
实验组4-1的样本稀释液：0.05M hepes、0.85％氯化钠、6％牛血清白蛋白、0.5％TW20、0.05％Proclin-300和纯水配制而成。
实验组4-2中的样本稀释液由0.05M hepes、0.85％氯化钠、7.5％牛血清白蛋白、0.5％TW20、0.05％Proclin-300和纯水配制而成。
实验组4-3中的样本稀释液由0.05M hepes、0.85％氯化钠、6.5％牛血清白蛋白、0.5％TW20、0.05％Proclin-300和纯水配制而成。
实验组4-4中的样本稀释液由0.05M hepes、0.85％氯化钠、6％牛血清白蛋白、0.25％TW20、0.05％Proclin-300和纯水配制而成。
实验组4-5中的样本稀释液由0.05M hepes、0.85％氯化钠、6％牛血清白蛋白、0.7％TW20、0.05％Proclin-300和纯水配制而成。
采用不同样本稀释液一起测试，数据见表13-14和图4。图4是采用不同样本稀释液测试线性结果图。
表13采用不同稀释液配方后的荧光值结果表
| 实验组4-1 | 实验组4-2 | 实验组4-3 | 实验组4-4 | 实验组4-5 | |
| DD(g/L) | 信号值-1 | 信号值-2 | 信号值-3 | 信号值-4 | 信号值-5 |
| 30 | 1312129 | 1377258 | 1361610 | 1364718 | 1371426 |
| 15 | 1183903 | 1172316 | 1198693 | 1180439 | 1130252 |
| 8 | 633519 | 610703 | 616391 | 626021 | 598743 |
| 4 | 230363 | 243348 | 248500 | 252790 | 235225 |
| 2 | 84890 | 87201 | 86556 | 91622 | 92063 |
| 1 | 26898 | 27000 | 27794 | 28333 | 29397 |
| 0.5 | 10047 | 10084 | 10520 | 9999 | 9938 |
| 0.25 | 4788 | 4680 | 4635 | 4907 | 4520 |
| 0.1 | 2705 | 2671 | 2647 | 2584 | 2734 |
| 0 | 2280 | 2243 | 2160 | 2239 | 2277 |
表14采用实验组4-1的稀释液测试稳定性结果表
从表13-14可以看出，实验组4-1到4-5的抗原参考品线性荧光值相差不大，偏差在10％以内，而37℃稳定性性能研究也与实验组4-1基本一致，试剂能够在5天后达到平衡，故省略数据。
实施例5：不同的单组分试剂缓冲液配方的实验
不同的单组分试剂缓冲液配方见表15。
表15采用不同的单组分试剂缓冲液配方(％)的配方表
采用对照8-13与实验5-1到5-4的不同单组分试剂缓冲液一起测试，比对数据见表16-21和图5-7。其中图5为实验5-1到5-4的测试线性结果图。图6是对照8的抗原参考品线性结果图。图7是对照11的抗原参考品线性结果图。
表16不同单组分试剂缓冲液的测试荧光值结果表
| 实施例5-1 | 实施例5-2 | 实施例5-3 | 实施例5-4 | 对照8 | |
| DD(g/L) | 信号值-1 | 信号值-2 | 信号值-3 | 信号值-4 | 信号值-5 |
| 30 | 1312840 | 1304410 | 1287145 | 1340929 | 976921 |
| 15 | 1109128 | 1194781 | 1174047 | 1152437 | 807222 |
| 8 | 587989 | 616407 | 614148 | 603993 | 1007148 |
| 4 | 236419 | 249921 | 232759 | 239241 | 691296 |
| 2 | 87803 | 90953 | 89179 | 92282 | 184085 |
| 1 | 27037 | 28184 | 27610 | 27313 | 61351 |
| 0.5 | 9982 | 10043 | 10246 | 9771 | 5169 |
| 0.25 | 4765 | 4702 | 4802 | 4740 | 2521 |
| 0.1 | 2707 | 2575 | 2613 | 2585 | 3162 |
| 0 | 2214 | 2328 | 2282 | 2361 | 2548 |
表17不同单组分试剂缓冲液(对照13-17)测试荧光值结果表
| 对照9 | 对照10 | 对照11 | 对照12 | 对照13 | |
| DD(g/L) | 信号值-6 | 信号值-7 | 信号值-8 | 信号值-9 | 信号值-10 |
| 30 | 1309490 | 1291678 | 887966 | 1288701 | 44392 |
| 15 | 1197304 | 1128759 | 711916 | 1169748 | 5601 |
| 8 | 633899 | 609594 | 44672 | 597273 | 3480 |
| 4 | 234567 | 252238 | 5871 | 236397 | 3883 |
| 2 | 92524 | 89510 | 3484 | 91311 | 2282 |
| 1 | 27277 | 28329 | 45502 | 29097 | 660048 |
| 0.5 | 10688 | 10462 | 5808 | 10548 | 1348028 |
| 0.25 | 4882 | 4843 | 3542 | 4815 | 1118863 |
| 0.1 | 2667 | 2710 | 3804 | 2717 | 825952 |
| 0 | 2359 | 2295 | 2329 | 2226 | 2329 |
表18实验5-1的稳定性测试结果表
表19对照9的稳定性测试结果表
表20对照10的稳定性测试结果表
表21对照11的稳定性测试结果表
从表16-21可以看出：实验5-2到5-4与实验5-1比较，抗原参考品线性荧光值相差不大，偏差在10％以内，而37℃稳定性性能研究也与实验5-1基本一致，试剂能够在5天后达到平衡，故省略数据显示；对照8,对照11和对照13的添加物存在线性干扰，不做稳定性跟踪；对照9,对照11和对照12的抗原参考品线性与实验5-1偏差不大，线性较优，但稳定性性能较差。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (18)
1.一种快速定量检测D-二聚体的均相荧光免疫的试剂，其特征在于，包括发光微球标记抗D-二聚体单克隆抗体，感光微球亲和素复合物，生物素标记D-二聚体单克隆抗体复合物；单组分试剂缓冲液，封闭液和样本稀释液，其中所述单组分试剂缓冲液由0.05M TRIS、0.85％氯化钠、1.5％海藻糖、1-1.5％泛影酸钠、0.2-0.7％S7、0.5-0.8％TX-405、0.05％Proclin-300和纯水配制而成，其pH为7.4；所述封闭液其pH 7.4，50mM-Tris+7.5％牛血清白蛋白、0.05-0.08％NP40和纯水配制而成；所述样本稀释液由0.05M hepes、0.85％氯化钠、6-7.5％牛血清白蛋白、0.2-0.7％TW20、0.05％Proclin-300和纯水配制而成，其pH为7.4；
其中发光微球标记抗D-二聚体单克隆抗体为发光微球混合标记两株抗D-二聚体单克隆抗体；生物素标记D-二聚体单克隆抗体复合物为生物素标记两株抗D-二聚体单克隆抗体；或者，
发光微球标记抗D-二聚体单克隆抗体为发光微球标记一株抗D-二聚体单克隆抗体；生物素标记D-二聚体单克隆抗体复合物为生物素标记不同的另外一株抗D-二聚体单克隆抗体。
2.如权利要求1所述均相荧光免疫的试剂，其特征在于，所述发光微球标记抗D-二聚体单克隆抗体，感光微球亲和素复合物和生物素标记D-二聚体单克隆抗体复合物三者一起加入到单组分试剂缓冲液中成为一种混合物。
3.如权利要求1所述均相荧光免疫的试剂，其特征在于，发光微球混合标记两株抗D-二聚体单克隆抗体和生物素标记D-二聚体单克隆抗体复合物中的抗体至少有一个单克隆抗体是相同的。
4.如权利要求1所述均相荧光免疫的试剂，其特征在于，所述发光微球标记抗D-二聚体单克隆抗体的制备方法为，
清洗：取发光微球，加去离子水离心洗涤1-2次，弃上清液，得到洗涤后的发光微球；
活化：向上述洗涤后的发光微球中添加MES溶液，再依次加入EDC溶液和NHS溶液，超声后活化，再离心去上清，再用去离子水离心洗涤；
偶联：向上述活化后的发光微球中添加偶联液，超声后再加入两株DD单克隆抗体或者一株DD单克隆抗体，将离心管放置在摇床上偶联；
封闭：偶联后，加入封闭剂进行封闭，封闭后，离心去上清，加去离子水离心洗涤1-3次，弃上清液，加入单组分试剂缓冲液悬浮。
5.如权利要求4所述均相荧光免疫的试剂，其特征在于，所述清洗步骤中，发光微球的浓度为10mg/ml；离心的转速为14000rpm，时间为10min。
6.如权利要求4所述均相荧光免疫的试剂，其特征在于，所述活化为，向上述洗涤后的发光微球中添加MES溶液，再依次加入EDC溶液和NHS溶液，超声后活化，再离心去上清，再用去离子水离心洗涤1-3次，弃上清液得活化后的发光微球。
7.如权利要求6所述均相荧光免疫的试剂，其特征在于，所述活化为，向上述洗涤后的发光微球中添加50mM pH5.0的MES溶液，再依次加入MES溶液一半体积的10mg/ml EDC溶液,和同样体积的10mg/ml NHS溶液，超声后将离心管放置在摇床上活化；活化的条件为30℃、250rmp/min，30min；再离心去上清，加入去离子水，离心洗涤1-3次，14000rpm，弃上清液得活化后的发光微球。
8.如权利要求4所述均相荧光免疫的试剂，其特征在于，所述偶联步骤中，偶联的条件为30℃、250rmp/min，2h。
9.如权利要求4所述均相荧光免疫的试剂，其特征在于，所述封闭步骤中，封闭的条件为30℃、250rmp/min，30min。
10.如权利要求1所述均相荧光免疫的试剂，其特征在于，所述感光微球亲和素复合物的制备方法为，
清洗：取感光微球，加入去离子水，离心洗涤1-3次，弃上清液，得到洗涤后的感光微球；
活化：制备活化液，活化液为50mM MES缓冲液，将EDC和NHS配制成10mg/ml；
向上述洗涤后的感光微球中添加MES溶液，再依次加入EDC溶液和NHS溶液，超声后活化；再离心去上清，加入去离子水离心洗涤1-3次，弃上清液得到活化后的感光微球；
偶联：向上述活化后的发光微球中添加偶联液，超声后再加入亲和素，将离心管放置在摇床上偶联；
封闭：偶联后，加入封闭剂进行封闭，封闭后，离心去上清，加去离子水离心洗涤1-3次，弃上清液，加入单组分试剂缓冲液悬浮。
11.如权利要求10所述均相荧光免疫的试剂，其特征在于，所述清洗步骤中，感光微球的浓度为10mg/ml；离心的转速为14000rpm，时间为10min。
12.如权利要求10所述均相荧光免疫的试剂，其特征在于，所述活化为，向上述洗涤后的感光微球中添加50mM pH5.0的MES溶液，再依次加入MES溶液一半体积的10mg/ml EDC溶液,和同样体积的10mg/ml NHS溶液，超声后活化，活化条件为30℃、250rmp/min，30min；再离心去上清，加入去离子水，离心洗涤1-3次，14000rpm，弃上清液得活化后的感光微球。
13.如权利要求10所述均相荧光免疫的试剂，其特征在于，所述偶联步骤中，偶联的条件为30℃、250rmp/min，2h。
14.如权利要求10所述均相荧光免疫的试剂，其特征在于，所述封闭步骤中，封闭的条件为30℃、250rmp/min，30min。
15.如权利要求1所述均相荧光免疫的试剂，其特征在于，所述生物素标记D-二聚体单克隆抗体复合物的制备方法为，将抗体，生物素依次加入到磷酸缓冲液中进行偶联；偶联结束后，将偶联好的生物素溶液放入透析袋中，透出多余的生物素，得到生物素标记D-二聚体单克隆抗体复合物。
16.如权利要求15所述均相荧光免疫的试剂，其特征在于，所述偶联的条件：500～700rmp/min、2h。
17.如权利要求15所述均相荧光免疫的试剂，其特征在于，所述抗体为混合抗体或者单一抗体。
18.如权利要求15所述均相荧光免疫的试剂，其特征在于，所述抗体：生物素的用量比例为50ug抗体：1ug生物素。
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