CN104569430B - 一种快速定量检测心脏型脂肪酸结合蛋白的均相荧光免疫试剂组及其制备方法 - Google Patents

一种快速定量检测心脏型脂肪酸结合蛋白的均相荧光免疫试剂组及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种快速定量检测心脏型脂肪酸结合蛋白的均相荧光免疫试剂组及其制备方法。本发明所述的快速定量检测心脏型脂肪酸结合蛋白的均相荧光免疫试剂组，包括稀土元素螯合物标记的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体(anti‑FABP)、近红外荧光化合物标记的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体和系列浓度的心脏型脂肪酸结合蛋白校准品。本发明可同时检测高值和低值FABP，尤其是低值FABP，且成本低廉，操作简单、快速、灵敏，且特异性好，只需要配套专用均相荧光免疫检测仪，因此可广泛应用于各级医疗检验场所，尤其是基层医疗机构，包括乡镇卫生院等均可开展，对于心脑血管事件发生的预防有极为重要的意义。

Description

一种快速定量检测心脏型脂肪酸结合蛋白的均相荧光免疫试剂组及其制备方法
技术领域
本发明属于医学检验领域，具体涉及一种快速定量检测心脏型脂肪酸结合蛋白的均相荧光免疫试剂及其制备方法。
背景技术
急性心肌梗死(AMI)的发病率及死亡率均很高，现代治疗学认为，AMI发病后能迅速得到确诊并进行再灌注治疗，对于降低死亡率及改善预后十分重要。WHO推荐的AMI的诊断条件为：临床症状、心电图异常和生化指标等。但大约1/3的AMI病人早期临床症状不典型，约50％的病人心电图不能出现特征性ST段改变，所以在此期的诊断来说一个灵敏又有特异性的心肌指标尤为重要。
心脏型脂肪酸结合蛋白(Heart fatty acid binding protein，H-FABP)是一族分子量为14-16kD的胞内蛋白质，至少有肝、小肠、心、脑、肾、骨骼肌、脂肪组织、回肠、表皮9种类型，各型之间具有不同的免疫学差别。H-FABP是存在于心肌细胞胞浆内的可溶性蛋白质，分子量15kD，占心肌内蛋白含量的(4±8)％，由132个氨基酸构成，呈酸性(pI5)，参与细胞脂肪酸的摄取、转运和代谢。心肌胞浆与血液中的比值为200000:1。在骨骼肌的浓度不到心肌里的十分之一，在远端肾小管、脑组织的特殊部位、乳腺、胎盘内含量更低。而肌红蛋白在骨骼肌的浓度是心肌里的两倍。正常条件下血流中几乎检测不到H-FABP，极微量的H-FABP可能与破坏的骨骼肌持续释放H-FABP有关，在心肌细胞受损时，细胞膜完整性受到破坏，H-FABP透过受损细胞膜进入外周血循环，使其血中H-FABP含量升高，1.5h开始升高、6h达到高峰、24h降至正常。这一特性使得H-FABP成为检测心肌损伤早期生化标志物。因与其它FABP在免疫学上具有特异性，不会发生交叉反应，故对心肌损伤的诊断特异性较强。另外，H-FABP通过肾脏代谢，以原形排出，所以肾功能不全时血里H-FABP的浓度会升高。
目前研究已证实H-FABP对微小心肌损伤敏感，检测血浆H-FABP水平可作为反映心肌不可逆损伤的生化标志物，与心肌损害的程度成正相关，此将为临床法医学对微小心肌损伤及外伤性心肌梗死的判定及预后心功能的诊断提供一灵敏性客观指标，在临床法医检案中有重要的应用价值。
国外较常应用的有Rapicheck和CardioDetect两种定性检测试剂盒，10-15min内得到结果。Lateral-flow是一种准确度更高的定量检测方法，2003年用于临床，15min得到结果。以上检验方法简易快捷，节约时间和费用，不需要特殊检测设备，值得临床推广。夹心酶免法应用两个来源不同的抗人H-FABP的抗体，分别做固相和液相结合抗体，临床常用有一步法和两步法。优点为检测结果准确，与骨骼肌蛋白、肌红蛋白、肌浆球蛋白、肌钙蛋白无交叉反应、不需大型仪器，费用合理，缺点是用时较长，需时45-90min，不利于超早期AMI的诊断及进一步处理。
均相荧光分析法(homogeneous fluoroimmunoassay，HFIA)是在时间分辨荧光免疫分析(time-resolued fluoroimmunoassay，TRFIA)技术的基础上形成的一种新的荧光免疫分析技术。TRFIA技术采用的荧光物质与传统的荧光染料完全不同，采用的是镧系元素铕(Eu)、锝(Tb)等作为荧光材料，灵敏度非常高，稳定性好，低温条件可保存三年，因而成为二十一世纪最热门的免疫分析技术。
均相荧光免疫检测法是用同一抗原的两个抗体分别标记Eu3+和荧光染料Alexa647。Eu3+标记抗体在游离状态时，受到340nm光线激发，只发射平均波长为615nm荧光，而在抗原、抗体复合物形成时，发生能量传递，激发荧光染料Alexa647发射出665nm荧光。标记抗体直接与待测样品进行抗原、抗体反应，如果能形成抗原、抗体复合物，则在665nm出可测得荧光信号。这种方法省却了酶联免疫法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。并且，此法也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。此外，Eu3+和Alexa647这对荧光物质的最大发射光波长之间相差较大，未发生抗原抗体反应的本底荧光值就非常低。而人血清中非特异性物质产生的300～500nm荧光，不能激发Alexa647发射荧光信号650nm激发光。因此非特异性荧光非常低。
本发明采用均相荧光免疫快速检测技术，利用荧光的高灵敏特点，同样也避免了胶体金或者荧光H-FABP干式免疫试纸中的硝酸纤维素膜本身孔隙不均一特性对检测准确度和重复性的不良影响。由于均相荧光免疫检测中样品与荧光标记抗体全过程都在液相中全面接触，反应充分，因此可大幅度提高检测灵敏度和线性范围，同时反应在液相进行也增加了样品的稀释倍数，消除了样品的基质效应影响，使定量结果有很好的可重复性，提高了定量结果的精密度和准确度，可满足临床诊断大规模检测的要求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有H-FABP检测技术的不足，提供一种快速定量检测H-FABP的均相荧光免疫试剂组。本发明根据荧光免疫技术特点和H-FABP抗原抗体系统特点，设计新的原材料，试剂和工艺流程，应用本发明提供的试剂组检测H-FABP水平，具有简单，快速，灵敏和特异性好等特点，可同时定量检测高值和低值样品，并且性价比高，适用于临床快速检测。
本发明的第一个方面是提供一种快速定量检测心脏型脂肪酸结合蛋白的均相荧光免疫试剂组，包括稀土元素螯合物标记的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体(anti-FABP)、近红外荧光化合物标记的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体和系列浓度的心脏型脂肪酸结合蛋白校准品。
优选地，稀土元素螯合物为Eu3+螯合物。
更优选地，稀土元素螯合物为BHHCT-Eu3+或1,2-二(1”,1”,1”,2”,2”,3”,3”-七氟-4”,6”-己二酮-6”-基-对苄基)-4-氯磺酰基苯与铕(Ⅲ)的配合物(BHHBCB-Eu3+)。
优选地，所述近红外荧光化合物为Alexa系列近红外荧光化合物、DyLight系列近红外荧光化合物和CF系列近红外荧光化合物中的至少一种。
更优选地，所述近红外荧光化合物Alexa647、DyLight-DY647和CF647中的至少一种。
优选地，所述系列浓度的心脏型脂肪酸结合蛋白校准品由校准品稀释液稀释心脏型脂肪酸结合蛋白配制而成，所述校准品稀释液为含0.01-0.5wt％PEG800、1-5wt％BSA、5-20wt％甘油、0.01-0.05wt％表面活性剂的MOPS缓冲液。
心脏型脂肪酸结合蛋白校准品可用塑料瓶密封包装。
本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的均相荧光免疫试剂组的制备方法，包括以下步骤：
1)稀土元素螯合物标记的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备：
取0.5-5mg/ml的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体溶液，加入0.05-0.5mol/L的NaHCO3溶液后，调pH至8.5-10，滴加10-100μg/ml配体化合物溶液，搅拌反应0.6-2h，分离得到配体化合物标记的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，加入终浓度为0.05-0.5wt％的BSA和0.01-1wt％的NaN3，调pH至5.5-6.5，免疫分析前，加入Eu3+溶液，使配体化合物与Eu3+等摩尔浓度，即得，其中，抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体溶液、NaHCO3溶液和配体化合物溶液的体积比为0.1-1∶1∶0.01-0.05；
2)近红外荧光化合物标记的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备：
将抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体用0.05-0.5mol/L的NaHCO3溶液稀释至0.5-5mg/ml，加入近红外荧光化合物溶解液，搅匀，室温孵育0.5-2h，分离得到近红外荧光化合物标记的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体；
3)系列浓度的心脏型脂肪酸结合蛋白校准品的制备：
将心脏型脂肪酸结合蛋白用校准品稀释液稀释配制成系列浓度，即得，
其中，1)、2)和3)的顺序可以任意颠倒。
其中，稀土元素螯合物标记的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体用于免疫分析时，用标记物稀释液稀释使用，2-8℃分装保存。
其中，近红外荧光化合物标记的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体用磷酸盐缓冲液稀释，2-6℃保存。
其中，心脏型脂肪酸结合蛋白校准品2-6℃保存。
优选地，抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体在于配体化合物反应之前，先进行透析处理。
优选地，步骤1)中配体化合物为BHHCT或BHHBCB。
优选地，步骤1)中分离得到配体化合物标记的anti-FABP通过离心和柱层析方式进行。柱层析采用SephadexG-50柱，0.01-0.1mol/L NH4HCO3(pH8.0)洗脱。
优选地，步骤2)中，分离得到近红外荧光化合物标记的anti-FABP通过柱层析的方式进行。
进一步优选地，步骤2)中，柱层析采用G25凝胶柱。
优选地，步骤2)中，室温孵育时，每隔10-20min混匀一次。
本发明的均相荧光免疫试剂的使用：先将稀土元素螯合物标记的anti-FABP溶液加入反应微孔中，再加入近红外荧光化合物标记的anti-FABP溶液，最后分别加入H-FABP校准品和临床检测样品，37℃反应20分钟后，用均相荧光免疫分析仪检测判读结果。
本发明提供的快速定量检测心脏型脂肪酸结合蛋白的均相荧光免疫试剂组，其反应原理为双抗体夹心法的均相荧光免疫法。待测样品与适当比例的稀土元素(例如Eu3+)和荧光标记抗体在液相均质介质中充分混和均匀，在此过程中样品中的H-FABP既能专一性地与稀土元素标记的抗H-FABP抗体充分结合，也能与荧光标记的H-FABP抗体充分反应，形成“稀土元素-anti-FABP—FABP—anti-FABP-荧光化合物”免疫复合物，荧光强度可用专用均相荧光免疫分析仪器定量测定，荧光强度与样品中H-FABP浓度成正比。
本发明可同时检测高值和低值H-FABP，尤其是低值H-FABP，且成本低廉，操作简单、快速、灵敏，且特异性好，只需要配套专用均相荧光免疫检测仪，因此可广泛应用于各级医疗检验场所，尤其是基层医疗机构，包括乡镇卫生院等均可开展，对于心脑血管事件发生的预防有极为重要的意义。
附图说明
图1为本发明的一种实施例的作用原理图，其中，1：Eu3+标记anti-FABP，2：Alexa647标记anti-FABP，3：校准品或待测样本中H-FABP，4：Eu3+-anti-FABP—FABP—anti-FABP-Alexa647免疫复合物；
图2为H-FABP浓度的标准曲线；
图3为H-FABP相关性分析曲线。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明做进一步的说明，以更好地理解本发明。其中，下述内容中若无特别规定物质浓度均为质量百分比浓度。
实施例1
1、标记用anti-FABP的准备：
选用纯化的基因工程表达的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体。Eu3+标记用抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体商品编号为10E1；荧光素标记用抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体商品编号为9F3和5B5。
2、稀土元素螯合物标记anti-FABP的制备：
用3L 0.9％NaCl于4℃透析鼠抗人H-FABP单抗10E1溶液(3mg/ml)两次，每次24hr。加水调浓度至1.5mg/ml。取0.6ml该抗体溶液，加入1ml NaHCO3(0.2mol/L)，并用1mol/L NaOH调pH至9.1。将20μl BHHCT甲醇溶液(30μg/ml)滴加到搅拌下的抗体溶液中，并继续搅拌反应lhr。离心(10000rpm，10min)除去不溶物后，上SephadexG-50柱，用0.05mol/L NH4HCO3(pH8.0)洗脱，分离标记蛋白质和游离的标记物。紫外/可见分光光度计检测各收集液的A330值，合并含有标记抗体的溶液。加入终浓度为0.1％的BSA和0.05％的NaN3，用1mol/L HCl调pH至6.2。分装后-20℃储存备用。用于免疫分析前，加入EuC13溶液(BHHCT与Eu3+等摩尔浓度)。用于免疫分析时，用标记物稀释液稀释使用，2-8℃分装保存。
3、Alexa647标记抗体的制备：
将抗H-FABP单克隆抗体9F3、5B5，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，各取5ml抗体溶液，分别加入30mg荧光素Alexa647溶解液，搅匀，室温孵育1小时，每隔15分钟混匀一次。最后用G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的荧光素标记抗体，用含0.01％PEG、1％BSA、5％甘油、0.01％表面活性剂的0.01M磷酸盐缓冲液稀释，用塑料瓶密封包装，于4℃保存。
4、系列浓度H-FABP校准品的制备：
用含0.05％PEG800、2.5％BSA、0.025％表面活性剂的0.01M的MOPOS缓冲液，按照0ng/ml、15ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的浓度稀释溶解H-FABP纯品，混匀后于4℃保存。
实施例2
本实施例的制备方法与实施例1基本相同，不同点在于：
步骤2中，稀土元素螯合物标记anti-FABP的制备方法是：用3L 0.9％NaCl于4℃透析鼠抗人H-FABP溶液(3mg/ml)两次，每次24hr。加水调浓度至1.5mg/ml。取0.6ml该抗体溶液，加入1ml NaHCO3(0.2mol/L)，并用1mol/LNaOH调pH至9.1。将20μl BHHBCB甲醇溶液(30μg/ml)滴加到搅拌下的抗体溶液中，并继续搅拌反应lhr。离心(10000rpm，10min)除去不溶物后，上SephadexG-25柱，用0.05mol/L NH4HCO3(pH8.0)洗脱，分离标记蛋白质和游离的标记物。紫外/可见分光光度计检测各收集液的A330值，合并含有标记抗体的溶液。加入终浓度为0.1％的BSA和0.05％的NaN3，用1mol/L HCl调pH至6.2。分装后-20℃储存备用。用于免疫分析前，加入EuC13溶液(BHHBCB与Eu3+等摩尔浓度)。用于免疫分析时，用标记物稀释液稀释使用，2-8℃分装保存。
实施例3
本实施例的制备方法与实施例1基本相同，不同点在于：
步骤3中，将抗H-FABP单克隆抗体9F3、5B5，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，各取5ml抗体溶液，分别加入40mg荧光素DyLight-DY647溶解液，搅匀，室温孵育1.5小时，每隔15分钟混匀一次。最后用G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的荧光素标记抗体，用含0.025％PEG、2.5％BSA、15％甘油、0.03％表面活性剂的0.01M磷酸盐缓冲液稀释，用塑料瓶密封包装，于4℃保存。
实施例4
本实施例的制备方法与实施例1基本相同，不同点在于：
步骤3中，将抗H-FABP单克隆抗体9F3、5B5，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，各取5ml抗体溶液，分别加入50mg荧光素CF647溶解液，搅匀，室温孵育2小时，每隔15分钟混匀一次。最后用G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的荧光素标记抗体，用含0.03％PEG、5％BSA、10％甘油、0.05％表面活性剂的0.01M磷酸盐缓冲液稀释，用塑料瓶密封包装，于4℃保存。
实施例5
在临床检测中，实验步骤为：先将50μl的稀土元素螯合物标记anti-FABP溶液加入反应微孔中，再加入50μl的近红外荧光化合物标记的anti-FABP溶液，最后分别加入50μl的H-FABP校准品、临床检测样品，37℃反应20分钟后，用均相荧光免疫分析仪检测判读结果。
实施例6
用专用的均相荧光免疫分析仪检测荧光强度，各浓度校准品检测结果如下：
H-FABP浓度(ng/ml) 0 15 25 50 100
相对荧光强度 566 1278 2256 3637 7364
依据相对荧光强度数据，制作H-FABP的标准曲线，见图2。H-FABP的标准曲线计算公式为Y＝68.513X+416.72，R2＝0.9959。
实施例7
采用本发明实施例1，用专用的均相荧光免疫分析仪检测53例临床冠心病患者血清样本，同步采用瑞士Roche公司的电化学法H-FABP试剂进行对比检测，进行相关性分析，见图3，结果说明本研究方法与以上市产品检测结果一致，具有临床等效性。实施例2-4的临床试验结果与实施例1一致。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (3)

1.一种快速定量检测心脏型脂肪酸结合蛋白的均相荧光免疫试剂组，其特征在于，包括稀土元素螯合物标记的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体、荧光化合物标记的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体和系列浓度的心脏型脂肪酸结合蛋白校准品，稀土元素螯合物为BHHCT-Eu3+或BHHBCB-Eu3+，荧光化合物为Alexa Fluor647、DyLight-DY647和CF647中的至少一种；且所述试剂组的制备方法包括以下步骤：
1)稀土元素螯合物标记的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备：
取0.5-5mg/ml的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体溶液，加入0.05-0.5mol/L的NaHCO3溶液后，调pH至8.5-10，滴加10-100μg/ml配体化合物溶液，搅拌反应0.6-2h，分离得到配体化合物标记的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，加入终浓度为0.05-0.5wt％的BSA和0.01-1wt％的NaN3，调pH至5.5-6.5，免疫分析前，加入Eu3+溶液，使配体化合物与Eu3+等摩尔浓度，即得，其中，抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体溶液、NaHCO3溶液和配体化合物溶液的体积比为0.1-1∶1∶0.01-0.05；
2)荧光化合物标记的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备：
将抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体用0.05-0.5mol/L的NaHCO3溶液稀释至0.5-5mg/ml，加入荧光化合物溶解液，搅匀，室温孵育0.5-2h，分离得到荧光化合物标记的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体；
3)系列浓度的心脏型脂肪酸结合蛋白校准品的制备：
将心脏型脂肪酸结合蛋白用校准品稀释液稀释配制成系列浓度，即得，
其中，1)、2)和3)的顺序可以任意颠倒。
2.根据权利要求1所述的均相荧光免疫试剂组，其特征在于，所述系列浓度的心脏型脂肪酸结合蛋白校准品由校准品稀释液稀释心脏型脂肪酸结合蛋白配制而成，所述校准品稀释液为含0.01-0.5wt％PEG800、1-5wt％BSA、0.01-0.05wt％表面活性剂的MOPS缓冲液。
3.根据权利要求1所述的均相荧光免疫试剂组，其特征在于，抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体在与配体化合物反应之前，先进行透析处理。
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