CN101880650A - 一种从外周血中快速提取循环的非血缘性有核细胞的组合物和试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于快速高效地从外周血中提取非血缘性有核细胞的组合物和试剂盒。本发明的用于从血液中快速获取循环的非血缘性有核稀有细胞的组合物，包括下述成份：缓冲液，低渗红细胞融破液，包被了抗血缘性有核细胞表面标识物抗体的磁性或非磁性免疫微球，以及一定密度的细胞分离介质。相对于目前市场上通用的商品化离心介质而言，本发明的新的组合物的使用可极大地缩短离心时间，并将细胞回收率从原有的60±20％稳定地提高到95％以上。该组合物与去除白细胞试剂和低渗融破红细胞手段相结合，可以有效地快速富集提取外周血中的非血缘性循环稀有细胞，如肿瘤上皮细胞及血管内皮细胞等，对肿瘤及心脏病的早期诊断具有极大的现实临床意义。
Description
技术领域
本发明主要涉及从一种从外周血中快速提取循环的非血缘性有核细胞的组合物及试剂盒，以及该组合物或试剂盒在用于生物医学实验、或手动临床检验操作或用于借助于自动化检测仪器设备的临床检验操作中的应用。
背景技术
提取并检测外周血中的循环的非血缘性有核细胞(如血管内皮细胞，肿瘤上皮细胞)的巨大临床意义早已被人们所证实。目前常用的提取循环的非血缘性有核细胞的方法是利用抗体与这些细胞表面的特殊标识物相结合从而达到直接捕获的目的。然而这种直接捕获的技术手段敏感性低，重复性差，且因表面标识物对于不同种类的细胞表达量差异极大，从而不能作为一种提取血液样品中的非血缘性有核细胞的通用手段。
近来大量的科研与临床实验已证明通过去除血中的血缘性有核细胞(如白细胞等)从而达到富集提取血中的非血缘性有核细胞是最为有效的手段。虽然此手段过程中涉及的某些单一方法已经有所报道，如免疫磁性颗粒法去除白细胞，血型糖蛋白-A(glycophorin A)交联法去除红细胞，以及必须借助特殊细胞分离器械的免疫磁性颗粒与密度离心结合的初步尝试等，但这些方法耗时长，白细胞去除率低，靶细胞回收率差，且须使用特殊器材从而带来应用的不便。
由于上述原因，本发明将基于利用特殊的密度分离剂的组合物或试剂盒的离心方法与去除白细胞试剂及低渗融破红细胞的手段相结合，令人意料不到的实验结果证明利用此组合物或试剂盒结合上述方法能够快速、高效、特异性地去除血液样品中的绝大部分血缘性有核细胞、红细胞及血浆蛋白质，从而能够快速富集并提取外周血中循环的非血缘性有核细胞，如循环的肿瘤上皮细胞，循环的血管内皮细胞等。
发明内容
本发明将基于特殊的密度分离剂的离心方法与去除血缘性有核细胞试剂及低渗融破红细胞的手段相结合，一方面提供了一种独特高效地从外周血中分离循环的非血缘性有核细胞，如循环的肿瘤上皮细胞和循环的血管内皮细胞等的组合物。
另一方面，本发明还提供了一种独特高效地从外周血中分离循环的非血缘性有核细胞，如循环的肿瘤上皮细胞和循环的血管内皮细胞等的试剂盒。
又一方面，本发明还提供了上述组合物或试剂盒在用于生物医学实验、或手动临床检验操作或用于借助于自动化检测仪器设备的临床检验操作中的应用。
一方面，本发明提供了一种用于从血液中快速获取循环的非血缘性有核稀有细胞的组合物，包括下述成份：缓冲液，低渗红细胞融破液，包被了抗血缘性有核细胞表面标识物抗体的磁性或非磁性免疫微球或免疫颗粒，以及细胞分离介质，其中，所述缓冲液的渗透压介于280～320mOsm/kg H2O、pH为6.8～7.8，所述细胞分离介质在20℃下的比重为1.07156～1.07738克/毫升，所述细胞分离介质包含选自下列试剂中的任意一种或任意两种以上的成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅，多聚糖和泛影酸钠或其衍生物，一种含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物。
优选地，所述免疫微球的比重高于所述细胞分离介质的比重，所述免疫微球或免疫颗粒共价或非共价结合有特异性地识别下述的白细胞表面标示物的一种或多种的抗体：CD3、CD31、CD34、CD45、CD50、CD69、CD84、或CD102。
优选地，所述循环的非血缘性有核稀有细胞选自：循环的具有上皮来源的任何实体瘤细胞、或不具有上皮来源的任何肿瘤细胞，循环的血管内皮细胞，肿瘤干细胞，干细胞，以及免疫细胞。
优选地，其中，所述缓冲液的渗透压介于280～320mOsm/kgH2O、pH为6.85～7.75，所述细胞分离介质包含选自下列试剂中的任意一种或任意两种以上的成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅，多聚糖和泛影酸钠或其衍生物，一种含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物，所述含糖溶液为选自以下的糖的溶液：如右旋糖苷、多聚糖和泛影酸钠或其衍生物、或蔗糖等，所述细胞分离介质在20℃下的比重为1.07260～1.07650克/毫升。
优选地，所述循环的非血缘性有核稀有细胞在所采集的所述血液样本中的比例占所有有核细胞的0.1％以下，所述肿瘤细胞选自所有上皮来源的实体瘤细胞，如肺癌、宫颈癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮来源的肿瘤细胞，如黑色素瘤等；循环的血管内皮细胞，肿瘤干细胞，血中胎儿细胞，干细胞，以及免疫细胞等。
另一方面，本发明提供了一种用于从血液中快速获取循环的非血缘性有核稀有细胞的试剂盒，包括：
一种组合物，所述组合物包括下述成份：缓冲液，低渗红细胞融破液，包被了抗血缘性有核细胞表面标识物抗体的磁性或非磁性免疫微球或免疫颗粒，以及细胞分离介质；其中，所述缓冲液的渗透压介于280～320mOsm/kg H2O、pH为6.8～7.8，所述细胞分离介质在20℃下的比重为1.07156～1.07738克/毫升，所述细胞分离介质包含选自下列试剂中的任意一种或任意两种以上的成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅，多聚糖和泛影酸钠或其衍生物，一种含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物；
容纳该组合物的容器以及带有抗凝剂的采血管；以及
所述试剂盒的使用说明书。
优选地，所述免疫微球或免疫颗粒的比重高于所述细胞分离介质的比重，所述免疫微球或免疫颗粒共价或非共价结合有特异性地识别下述的白细胞表面标示物的一种或多种的抗体：CD3、CD31、CD34、CD45、CD50、CD69、CD84、或CD102。
优选地，其中，所述缓冲液的渗透压介于280～320mOsm/kgH2O、pH为6.85～7.75，所述含糖溶液为选自以下的糖的溶液：如右旋糖苷，多聚糖和泛影酸钠或其衍生物，或蔗糖等。
优选地，所述循环的非血缘性有核稀有细胞选自：循环的具有上皮来源的任何实体瘤细胞、或不具有上皮来源的任何肿瘤细胞，循环的血管内皮细胞，肿瘤干细胞，血中胎儿细胞，干细胞，以及免疫细胞。
优选地，所述循环的非血缘性有核稀有细胞在所采集的所述血液样本中的比例占所有有核细胞的0.1％以下，所述肿瘤细胞选自所有上皮来源的实体瘤细胞，如肺癌、宫颈癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮来源的肿瘤细胞，如黑色素瘤等；循环的血管内皮细胞，肿瘤干细胞，血中胎儿细胞，干细胞，以及免疫细胞等。
又一方面，本发明还提供了上述组合物或试剂盒在用于生物医学实验、或手动临床检验操作或用于借助于自动化检测仪器设备的临床检验操作中的应用。
相对于目前市场上通用的商品化离心介质而言，本发明的新的组合物或试剂盒的使用可极大地缩短离心时间，并将细胞回收率从原有的60±20％稳定地提高到95％以上。该组合物与去除白细胞试剂和低渗融破红细胞的手段相结合，可以有效地快速富集提取外周血中循环的非血缘性有核稀有细胞，如肿瘤上皮细胞及血管内皮细胞等，对肿瘤及心脏病的早期诊断具有极大的现实临床意义。而且本发明提供的上述组合物或试剂盒用于生物医学实验，或手动临床检验操作或用于借助于自动化检测仪器设备的临床检验操作中可极大地简化操作并提高效率。
具体实施方式
本发明将基于特殊密度的分离剂的离心方法与去除血缘性有核细胞试剂及低渗融破红细胞的手段相结合，在一具体实施例中提供了一种独特高效地从外周血中分离循环的非血缘性有核细胞，如循环的肿瘤上皮细胞和循环的血管内皮细胞等的组合物。
在另一具体实施例中，本发明还提供了一种独特高效地从外周血中分离循环的非血缘性有核细胞，如循环的肿瘤上皮细胞和循环的血管内皮细胞等的试剂盒。
在又一具体实施例中，本发明还提供了上述组合物或试剂盒在用于生物医学实验、或手动临床检验操作或用于借助于自动化检测仪器设备的临床检验操作中的应用。
一个具体实施例，本发明提供了一种用于从血液中快速获取循环的非血缘性有核稀有细胞的组合物，包括下述成份：缓冲液，低渗红细胞融破液，包被了抗血缘性有核细胞表面标识物抗体的磁性或非磁性免疫微球或免疫颗粒，以及细胞分离介质，其中，所述缓冲液的渗透压介于280～320mOsm/kg H2O、pH为6.8～7.8，所述细胞分离介质在20℃下的比重为1.07156～1.07738克/毫升，所述细胞分离介质包含选自下列试剂中的任意一种或任意两种以上的成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅，多聚糖和泛影酸钠或其衍生物，一种含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物。
在一优选实施例中，所述免疫微球或免疫颗粒的比重高于所述细胞分离介质的比重，所述免疫微球或免疫颗粒共价或非共价结合有特异性地识别下述的白细胞表面标示物的一种或多种的抗体：CD3，CD31，CD34，CD45，CD50，CD69，CD84，或CD102。
在另一优选实施例中，所述循环的非血缘性有核稀有细胞选自：循环的具有上皮来源的任何实体瘤细胞、或不具有上皮来源的任何肿瘤细胞，循环的血管内皮细胞，肿瘤干细胞，血中胎儿细胞，干细胞，以及免疫细胞等。
在另一优选实施例中，所述缓冲液的渗透压介于280～320mOsm/kg H2O、pH为6.85～7.75，所述含糖溶液为选自以下糖的溶液：如右旋糖苷、多聚糖和泛影酸钠或其衍生物、或蔗糖等，所述细胞分离介质在20℃下的比重为1.07260～1.07650克/毫升。
在另一优选实施例中，所述循环的非血缘性有核稀有细胞在所采集的所述血液样本中的比例占所有有核细胞的0.1％以下，所述肿瘤细胞选自所有上皮来源的实体瘤细胞，如肺癌、宫颈癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮来源的肿瘤细胞，如黑色素瘤等。
在另一具体实施例中，本发明提供了一种用于从血液中快速获取循环的非血缘性有核稀有细胞的试剂盒，包括：
一种组合物，所述组合物包括下述成份：缓冲液，低渗红细胞融破液，包被了抗血缘性有核细胞表面标识物抗体的磁性或非磁性免疫微球，以及细胞分离介质；其中，所述缓冲液的渗透压介于280～320mOsm/kg H2O、pH为6.8～7.8，所述细胞分离介质在20℃下的比重为1.07156～1.07738克/毫升，所述细胞分离介质包含选自下列试剂中的任意一种或任意两种以上的成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅，聚糖，泛影酸钠或其衍生物，一种含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物；
容纳所述组合物的容器以及带有抗凝剂的采血管；以及
所述试剂盒的使用说明书。
在另一优选实施例中，所述免疫微球或免疫颗粒的比重高于所述细胞分离介质的比重，所述免疫微球或免疫颗粒共价或非共价结合有特异性地识别下述的白细胞表面标示物的一种或多种的抗体：CD3，CD31，CD34，CD45，CD50，CD69，CD84，或CD102。在另一优选实施例中，所述缓冲液的渗透压介于280～320mOsm/kgH2O、pH为6.85～7.75，所述含糖溶液为选自以下的糖的溶液：如右旋糖苷、多聚糖和泛影酸钠或其衍生物、或蔗糖等。
在另一优选实施例中，所述循环的非血缘性有核稀有细胞选自：循环的具有上皮来源的任何实体瘤细胞、或不具有上皮来源的任何实体瘤细胞，循环的血管内皮细胞，肿瘤干细胞，干细胞，以及免疫细胞。
在另一优选实施例中，所述循环的非血缘性有核稀有细胞在所采集的所述血液样本中的比例占所有有核细胞的0.1％以下，所述肿瘤细胞选自所有上皮来源的实体瘤细胞，如肺癌、宫颈癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮来源的肿瘤细胞，如黑色素瘤等。
在本发明的具体实施方式中，去除血缘性有核细胞的试剂是将一种或多种识别白细胞表面标识物的抗体与磁性或非磁性固体颗粒或固体表面共价偶联而成为免疫颗粒。离心分离介质的密度为1.07156～1.07738克/毫升，比重可用任何渗透压介于280～320mOsm/kg H2O、pH6.8～7.8的缓冲液调制而成。此分离介质可将非血缘性有核细胞从红细胞及结合了血缘性有核细胞的免疫颗粒中进行有效的分离。
在又一具体实施例中，本发明还提供了上述组合物或试剂盒在用于生物医学实验，或手动临床检验操作或用于借助于自动化检测仪器设备的临床检验操作中的应用。
名词解释
血缘性有核细胞：指白细胞，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞等)；嗜中性粒细胞；嗜酸性粒细胞；嗜碱性粒细胞等。
循环的非血缘性有核细胞：主要指在血液中循环的具有上皮来源的或不具有上皮来源的肿瘤细胞和循环的血管内皮细胞；肿瘤干细胞，干细胞，血中胎儿细胞，某些免疫细胞等稀有细胞。
本发明主要用于从血液样品中快速去除血浆蛋白、红细胞以及血缘性有核细胞，从而达到富集血液样品中的非血缘性有核细胞的目的。
在本发明的实施过程中，将血液采集于任意一种商品化的含抗凝剂的采血管中。
采用本发明的组合物用于富集血液样品中非血缘性有核细胞的主要步骤，包括：
去除血浆蛋白；
加入低渗裂解液融破红细胞；
应用抗血缘性有核细胞表面标志的抗体包被的免疫微球或免疫颗粒(将抗体共价或非共价偶联于固体表面)；
加入比重为1.07156～1.07738克/毫升的细胞分离介质，进行基于特殊密度的细胞分离介质的离心，
从而富集血中的非血缘性有核细胞。
在本发明的组合物中，细胞分离介质的比重为1.07156～1.07738克/毫升(gr/ml或gr/cm3)。细胞分离介质包含下列任何一种或任意两种以上的试剂成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅(polyvinylpyrrolidine coated colloidal silica)；多聚糖(polysucrose)与泛影酸钠(sodium diatrizoate)或其衍生物的混合物；由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物；以及可选的任意蛋白溶液。细胞分离介质的比重可用任何渗透压介于280～320mOsm/kg H2O、pH6.8～7.8的缓冲液调制而成。
在另一优选实施例中，所述缓冲液的渗透压介于280～320mOsm/kg H2O、pH为6.85～7.75。
在另一优选实施例中，所述细胞分离介质在20℃下的比重为1.07260～1.07650克/毫升。
实施例1
利用本发明组合物从人的血液样品中快速获取非血缘性循环有核细胞
采集10ml人的外周血于任何一种含抗凝剂(如EDTA、肝素、或ACD等)的采血管中(BD，New Jersey，USA)。离心(1000×g，15分钟)后，去掉血浆蛋白。
加50毫升低渗红细胞融破液(BD Pharmingen，California，USA)后，于4℃孵育30分钟。将样品标本再次离心(1000×g，15分钟)。
将沉积的细胞重悬于30毫升缓冲液中。向其中加入2毫升包被有抗CD45和/或CD50的单克隆抗体的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，室温孵育30分钟。将反应液加到20毫升的细胞分离介质上方(该细胞分离介质在20℃下的比重为1.07260～1.07650克/毫升，该细胞分离介质包含下列成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅；多聚糖和泛影酸钠；含右旋糖苷的糖溶液；由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物)，然后离心1000×g，15分钟。
取上清液，将上清液再离心1500×g，10分钟。
弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的非血缘性有核细胞。
离心后得到的沉积细胞重悬于磷酸盐缓冲液后可做进一步分析。
该实施例中本发明的组合物中的细胞分离介质是这样制备的：将5.8％的多聚糖(polysucrose)与9.1％的泛影酸钠(Sigma，Missouri，UDA)的混合物在高精度数字密度仪于20℃监测下，用磷酸盐缓冲液(PBS)将其密度准确调节至1.07260～1.07650克/毫升之间。
利用本发明的组合物，相对于目前市场上通用的商品化离心介质而言，可极大地缩短利用上述步骤从人的血液样品中获取循环的非血缘性有核细胞的离心时间，并将循环的非血缘性有核细胞回收率从原有的60±20％稳定地提高到96％。
具体地，在本发明的组合物中，免疫微球或免疫颗粒由特异性识别白细胞标示物的抗体与微球表面进行共价或非共价偶联而形成，所述微球的表面可经过或没有经过化学处理以适于与蛋白质相偶联，所述微球的直径介于10纳米～100微米，所述免疫微球或免疫颗粒包含或部分包含任何一种下列成份：二氧化硅，右旋糖苷，琼脂糖，或交联葡聚糖。用于制备所述免疫微球的微球为磁性或非磁性的。
在本发明的组合物中，用于制备免疫微球或免疫颗粒的抗体特异性地识别下述但不局限于这些白细胞表面标示物的一种或几种：CD3，CD31，CD34，CD45，CD50，CD69，CD84，或CD102等。
在本发明的组合物中，所述免疫微球或免疫颗粒是将任何经过或没有经过化学处理的适宜结合蛋白的固体表面如二氧化硅颗粒与配体或特异的单克隆或多克隆抗体包括抗白细胞表面标示物如CD45和/或CD50的抗体进行共价或非共价偶联而制备而成。
在本发明的组合物中，所述独特的细胞分离介质在20℃温度下比重范围优选介于1.07260～1.07650克/毫升(gr/ml or gr/cm3)，这一特定范围内的密度适于将几乎所有有核细胞与红细胞及免疫微球或免疫颗粒进行分离。所述细胞分离介质包含下列任何一种或任意两种或两种以上的试剂成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅；多聚糖；泛影酸钠或其衍生物；由蔗糖和表氯醇构成的非离子聚合物；或任何一种含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖；碘化小分子化合物(如甲泛影酰胺(metrizamide))；或任意蛋白溶液。所述细胞分离介质的比重可用任何渗透压介于285～315mOsm/kgH2O、pH6.8～7.8的缓冲液在20℃温度下调制在1.07260～1.07650克/毫升范围内。所述免疫微球或免疫颗粒的比重高于所述细胞分离介质的比重。基于所述细胞分离介质的离心在普通的商品化的离心管内进行。
迄今所有检测循环稀有细胞的技术手段都基于免疫荧光方法。但来源于荧光染料自身负电荷引起的与靶细胞的非特异结合这一主要缺点却无可避免。该缺点给人们在区分真假阳性染色信号的过程中带来了极大的困扰。本发明提供的组合物或试剂盒，能够克服免疫荧光带来的非特异染色，并使得对染色的循环稀有细胞的检测得以在普通光学显微镜下或者基于显微镜原理的扫描仪下进行。已被证明为一种高特异性，快速，简单，低成本的技术手段，而且不再需要任何荧光染料及昂贵的荧光显微镜。
在本发明的组合物中，可识别角蛋白，如角蛋白8，18，19或广谱角蛋白中任意一种或任意两种或两种以上的单克隆或多克隆抗体被用于识别从具有上皮来源的任何实体肿瘤脱落入血液的循环肿瘤细胞。另外一种可识别白细胞表面标志CD45的单克隆或多克隆抗体用于白细胞染色以区分假阳性。
本发明的目的还在于提供了一种用于从血液中快速获取循环的非血缘性有核稀有细胞的试剂盒，包括：
一种组合物，所述组合物包括下述成份：缓冲液，低渗红细胞融破液，包被了抗血缘性有核细胞表面标识物抗体的磁性或非磁性免疫微球或免疫颗粒，以及细胞分离介质；其中，所述缓冲液的渗透压介于280～320mOsm/kg H2O、pH为6.8～7.8，所述细胞分离介质在20℃下的比重为1.07156～1.07738克/毫升，所述细胞分离介质包含选自下列试剂中的任意一种或任意两种或两种以上的成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅，多聚糖，泛影酸钠或其衍生物，一种含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物。
该试剂盒还包括用于容纳所述组合物的容器以及可选地带有抗凝剂的采血管。
该试剂盒还包括说明书，用于说明试剂盒的使用。
在本发明的试剂盒中，缓冲液，低渗红细胞融破液，包被了抗血缘性有核细胞表面标识物抗体的磁性或非磁性免疫微球或免疫颗粒，以及细胞分离介质被分开容纳在不同的容器中。
该容器可以是安瓿瓶或密封的袋。带有抗凝剂的采血管可以含有如EDTA、肝素、或ACD等任一种抗凝剂。
在本发明的试剂盒中，免疫微球或免疫颗粒由特异性识别白细胞标示物的抗体与微球或颗粒的表面进行共价或非共价偶联而形成，所述微球或颗粒的表面可经过或没有经过化学处理以适于与蛋白质相偶联，所述微球或颗粒的直径介于10纳米～100微米，所述微球或颗粒包含或部分包含任何一种下列成份：二氧化硅，右旋糖苷，琼脂糖，或交联葡聚糖。用于制备所述免疫微球的微球为磁性或非磁性的。
在本发明的试剂盒中，用于制备免疫微球或免疫颗粒的抗体特异性地识别下述但不局限于这些白细胞表面标示物中的一种或多种：CD3，CD31，CD34，CD45，CD50，CD69，CD84，或CD102等。
在本发明的试剂盒中，免疫微球或免疫颗粒是将任何经过或没有经过化学处理的适宜结合蛋白的固体表面如二氧化硅微球，或右旋糖苷、琼脂糖、或交联葡聚糖微球与配体或特异的单克隆或多克隆抗体包括抗白细胞表面标示物如CD45和/或CD50的抗体进行共价或非共价偶联而制备而成。
在本发明的试剂盒中，优选该细胞分离介质在20℃温度下比重范围优选介于1.07260～1.07650克/毫升(gr/ml或gr/cm3)，这一特定范围内的密度适于将几乎所有有核细胞与红细胞及免疫微球进行分离。
所述细胞分离介质包含下列任何一种或任意两种或两种以上的试剂成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅；多聚糖加泛影酸钠或其衍生物；由蔗糖和表氯醇构成的非离子聚合物；或任何一种含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖；碘化小分子化合物(如甲泛影酰胺(metrizamide))；或任意蛋白溶液。所述细胞分离介质的比重可用任何渗透压介于280～320mOsm/kg H2O、pH6.8～7.8的缓冲液在20℃温度下调制在1.07260～1.07650克/毫升范围内。所述免疫微球或免疫颗粒的比重高于所述细胞分离介质的比重。基于所述细胞分离介质的离心在普通商品化的离心管内进行。
实施例2
利用本发明的试剂盒从人的血液样品中快速获取非血缘性循环有核细胞
采集10ml人的外周血于试剂盒中携带的含以下任何一种抗凝剂，如EDTA、肝素、或ACD等的采血管中。离心(1000×g，15分钟)后，去掉血浆蛋白。
加入试剂盒中携带的50毫升低渗红细胞融破液(BDPharmingen，California，USA)后，于4℃孵育30分钟。将样品标本再次离心(1000×g，15分钟)。
将沉积的细胞重悬于试剂盒中携带的30毫升缓冲液中。向其中加入试剂盒中携带的2毫升包被有抗CD45和/或CD50的单克隆抗体的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，室温孵育30分钟。将反应液加到试剂盒中携带的20毫升的细胞分离介质上方(该细胞分离介质在20℃下的比重为1.07260～1.07650克/毫升，该细胞分离介质包含下列成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅；含右旋糖苷的糖溶液，其中聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅为0.2％，含右旋糖苷的糖溶液为0.35％，在糖溶液中的右旋糖苷为60％)。然后离心1000×g，15分钟。
取上清液，将上清液再离心1500×g，10分钟。
弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的非血缘性有核细胞。
将离心后得到的沉积细胞重悬于试剂盒携带的磷酸盐缓冲液后可做进一步分析。
利用本发明的试剂盒，相对于目前市场上通用的商品化离心介质而言，可极大地缩短利用上述步骤从人的血液样品中获取循环的非血缘性有核细胞的离心时间，并将循环的非血缘性有核细胞回收率提高到95％。
本发明提供的上述组合物或试剂盒可以用于生物医学实验，或手动临床检验操作或用于借助于自动化检测仪器设备的临床检验操作中，上述操作都属于本领域技术人员所熟知的常规操作，在此无需赘述。
本领域的技术人员应当明了，上述优选实施例只是对本发明的具体说明，并不构成对本发明的限制。根据需要可以对其进行多种改进，组合，亚组合以及变换，所有的改进，组合，亚组合、变换以及等效替换都落入在所附的权利要求的范围内。
Claims (10)
1.一种用于从血液中快速获取循环的非血缘性有核稀有细胞的组合物，包括下述成份：缓冲液，低渗红细胞融破液，包被了抗血缘性有核细胞表面标识物抗体的磁性或非磁性免疫微球或免疫颗粒，以及细胞分离介质，其中，所述缓冲液的渗透压介于280～320mOsm/kg H2O、pH为6.8～7.8，所述细胞分离介质在20℃下的比重为1.07156～1.07738克/毫升，所述细胞分离介质包含选自下列试剂中的任意一种或任意两种或两种以上的成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅，多聚糖和泛影酸钠或其衍生物，一种含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述免疫微球或免疫颗粒的比重高于所述细胞分离介质的比重，所述免疫微球或免疫颗粒共价或非共价结合有特异性地识别下述的白细胞表面标示物的一种或多种的抗体：CD3、CD31、CD34、CD45、CD50、CD69、CD84、或CD102。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述循环的非血缘性有核稀有细胞选自：循环的具有上皮来源的任何实体瘤细胞、或不具有上皮来源的任何肿瘤细胞，循环的血管内皮细胞，肿瘤干细胞，干细胞，以及免疫细胞。
4.根据权利要求1～3任一项所述的组合物，其中，所述缓冲液的渗透压介于280～320mOsm/kg H2O、pH为6.85～7.75，所述含糖溶液为选自以下的糖的溶液：右旋糖苷，多聚糖和泛影酸钠或其衍生物，或蔗糖，所述细胞分离介质在20℃下的比重为1.07260～1.07650克/毫升。
5.根据权利要求1～4任一项所述的组合物，其中，所述循环的非血缘性有核稀有细胞在所采集的所述血液样本中的比例占所有有核细胞的0.1％以下，所述肿瘤细胞选自所有上皮来源的实体瘤细胞，如肺癌、宫颈癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮来源的肿瘤细胞，如黑色素瘤；循环的血管内皮细胞，肿瘤干细胞，血中胎儿细胞，干细胞，以及免疫细胞等。
6.一种用于从血液中快速获取循环的非血缘性有核稀有细胞的试剂盒，包括：
一种组合物，所述组合物包括下述成份：缓冲液，低渗红细胞融破液，包被了抗血缘性有核细胞表面标识物抗体的磁性或非磁性免疫微球或免疫颗粒，以及细胞分离介质；其中，所述缓冲液的渗透压介于280～320mOsm/kg H2O、pH为6.8～7.8，所述细胞分离介质在20℃下的比重为1.07156～1.07738克/毫升，所述细胞分离介质包含选自下列试剂中的任意一种或任意两种或两种以上的成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅，多聚糖和泛影酸钠或其衍生物，一种含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物；
容纳所述组合物的容器以及可选择地带有抗凝剂的采血管；载玻片以及
所述试剂盒的使用说明书。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述免疫微球或免疫颗粒的比重高于所述细胞分离介质的比重，所述免疫微球或免疫颗粒共价或非共价结合有特异性地识别下述的白细胞表面标示物的一种或多种的抗体：CD3、CD31、CD34、CD45、CD50、CD69、CD84、或CD102。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其中，所述循环的非血缘性有核稀有细胞选自：循环的具有上皮来源的任何实体瘤细胞、或不具有上皮来源的任何肿瘤细胞，循环的血管内皮细胞，肿瘤干细胞，血中胎儿细胞，干细胞，以及免疫细胞等。
9.根据权利要求6～8任一项所述的试剂盒，其中，所述循环的非血缘性有核稀有细胞在所采集的所述血液样本中的比例占所有有核细胞的0.1％以下，所述肿瘤细胞选自所有上皮来源的实体瘤细胞，如肺癌、宫颈癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮来源的实体瘤细胞，如黑色素瘤；循环的血管内皮细胞，血中胎儿细胞，肿瘤干细胞，干细胞，以及免疫细胞等。
10.根据权利要求1～5任一项所述的组合物或根据权利要求6～9任一项所述的试剂盒在用于生物医学实验、或手动临床检验操作或用于借助于自动化检测仪器设备的临床检验操作中的应用。
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