CN118325817A - 一种分离肝脏组织来源的细胞外囊泡的方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离肝脏组织来源的细胞外囊泡的方法及其试剂盒。试剂盒包括以下组分：肝细胞膜表面标志物的抗体、抗生物素标记的磁珠、Liberase TM酶溶液、DMEM培养基、含BSA和EDTA的PBS缓冲液；肝细胞膜表面标志物为去唾液酸糖蛋白受体ASGPR。该试剂盒通过组织细胞外囊泡的膜标志物进行抗原抗体染色，并利用抗体对应相应的信息素进行免疫磁珠分选，以筛选出不同的组织细胞外囊泡。本发明还公开了一种分离肝脏组织来源的细胞外囊泡的方法，能够明确且特异有效地分离出特定类型的细胞外囊泡，将有助于深入探索内源性组织细胞外囊泡体外循环生物学及其机制，并推动其在诊断和治疗方面的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离肝脏组织来源的细胞外囊泡的方法及其试剂盒。
背景技术
细胞外囊泡(Extracellularvesicles,EVs)作为细胞分泌的具有脂质双层膜结构的囊状小体，可以携带并传递蛋白质、核酸、脂质等多种生物活性物质，被认为在机体发育、修复、再生、疾病、肿瘤迁移中发挥关键作用。同时EV可进行药物、血清剥夺、缺氧等预处理或基因改造。基于EV新型疗法已成为促进多种组织损伤后修复的有效手段。例如，细胞来源的EV可减轻骨质疏松骨丢失，组织来源的EV具有促进皮肤组织修复的潜能。同时，由于EV具有免疫原性低、稳定性强、生物相容性良好、易于通过生物屏障等显著优势，EV作为一种有潜力的非细胞(Cell-free)途径干细胞治疗策略在再生医学和细胞治疗领域受到广泛关注。
现有提取组织EV技术主要是在酶解组织后提取其中包含的所有类型的EV，导致混杂了来自不同来源的EV。现今组织细胞外囊泡的分类主要根据细胞外囊泡的直径大小进行区分，但此方法无法明确组织细胞外囊泡的来源，进而缺失不同细胞来源的组织细胞外囊泡的功能，同时无法对组织细胞外囊泡进行精准定位。因此，缺乏分类明确且特异有效地分离出特定类型EV工具，在实现精准治疗方面仍然面临许多挑战。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中无法明确且特异有效地分离出特定类型的细胞外囊泡缺陷，提供一种分离肝脏组织来源的细胞外囊泡的方法及其试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案进行。
本发明的第一方面提供一种分离肝脏组织来源的细胞外囊泡的试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：
肝细胞膜表面标志物的抗体、抗生物素标记的磁珠、Liberase TM酶溶液、DMEM培养基、含BSA和EDTA的PBS缓冲液；
所述肝细胞膜表面标志物为去唾液酸糖蛋白受体ASGPR。
本发明的一些实施方式中，所述Liberase TM酶溶液的浓度为3-6mg/L。
本发明的一些实施方式中，所述PBS缓冲液中BSA的质量浓度为0.4-0.6％。
本发明的一些实施方式中，所述PBS缓冲液中EDTA的摩尔浓度为2-3mM。
本发明的一些实施方式中，所述Liberase TM酶溶液是将Liberase TM酶加入DMEM培养基得到的。
本发明的一些实施方式中，所述抗体为ASGPR-PE抗体。
本发明的一些实施方式中，所述抗生物素标记的磁珠为Anti-PE microbeads。
本发明的第二方面提供一种分离肝脏组织来源的细胞外囊泡的方法，使用所述的试剂盒分离肝脏组织来源的细胞外囊泡。
本发明的一些实施方式中，所述方法包括：将用DMEM培养基清洗离体肝脏组织块，然后进行第一次离心，保留沉淀；所述沉淀使用Liberase TM酶重悬，孵育，形成重悬液，去除所述重悬液中的组织块、去除细胞和碎片、去除杂质颗粒，之后将所得产物使用PBS缓冲液洗涤后，再次第二次离心，收集到的沉淀即为组织细胞外囊泡；
将所述组织细胞外囊泡与所述肝细胞膜表面标志物的抗体结合，孵育，进行第三次离心，收集沉淀；所述沉淀经重悬后与抗生物素标记的磁珠结合，孵育，使用色谱柱和磁力分离器将与抗体特异性结合的组织细胞外囊泡和未与抗体特异性结合的组织细胞外囊泡进行分离，与抗体特异性结合的组织细胞外囊泡保留在色谱柱中。
本发明的一些实施方式中，所述第一次离心的条件为：3-5℃，290-310g条件下，离心8-13min；
去除所述重悬液中的组织块是在3-5℃，290-310g条件下，离心8-13min实现的
所述去除细胞和碎片是在3-5℃，1900-2200g条件下，离心18-23min通过离心实现的；
所述去除杂质颗粒是在3-5℃，15000-17500g条件下，离心28-35min实现的；
所述第二次和第三次离心的条件为：3-5℃，15000-17500g条件下，离心28-35min。
本发明的一些实施方式中，所述孵育的时间为10min-300min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种分离肝脏组织来源的细胞外囊泡的试剂盒，该试剂盒通过组织细胞外囊泡的膜标志物进行抗原抗体染色，并利用抗体对应相应的信息素进行免疫磁珠分选，以筛选出不同膜标志物的组织细胞外囊泡，为利用免疫磁珠根据膜表面标志物分离组织细胞外囊泡的制备及提取新策略。
本发明在体外循环研究中的应用将有助于深入探索内源性组织细胞外囊泡体外循环生物学及其机制，并推动其在诊断和治疗方面的应用。此外，该方法还可用于深入了解细胞外囊泡关键亚群，这些亚群不仅来自特定细胞来源，而且具备特殊膜蛋白特征。未来的研究应当阐明来自不同细胞来源组织中细胞外囊泡所扮演唯一功能在健康与疾病中的作用。
附图说明
图1为本发明实施例中提供的ASGPR+特异性肝脏组织细胞外囊泡提取流程图。
图2为本发明实施例中提供的ASGPR+特异性肝脏组织细胞外囊泡的分选效率；其中，图2的A为流式细胞术实验设计及相关分组；图2的B为PBS和同型对照组中ASGPR的表达情况图；图2的C为免疫磁分选前后肝组织细胞外囊泡中ASGPR的表达变化图。
图3为正常ASGPR+特异性肝脏组织细胞外囊泡和肝切后状态下，肝细胞外囊泡的形态图；其中，图3的A为正常状态下的肝细胞外囊泡的形态图；图3的B为肝切后状态下的肝细胞外囊泡的形态图。
图4为Western blot分析免疫磁珠分选前后肝组织细胞外囊泡的蛋白标志物表达情况图。
图5为免疫磁珠分选前后肝组织细胞外囊泡的粒径分布测定结果图；其中，图5的A表示NTA测定免疫磁珠分选前肝组织细胞外囊泡的粒径分布结果图；
图5的B表示NTA测定免疫磁珠分选后肝组织细胞外囊泡的粒径分布分布结果图。
图6为免疫磁珠分选前后肝组织细胞外囊泡的颗粒数和蛋白量柱状图；其中，图6的A表示NTA测定免疫磁珠分选前肝组织细胞外囊泡的颗粒数定量柱状图；图6的B表示BCA测定免疫磁珠分选前肝组织细胞外囊泡的蛋白量柱状图；图6的C表示NTA测定免疫磁珠分选后肝组织细胞外囊泡的颗粒数定量柱状图；图6的D表示BCA测定免疫磁珠分选后肝组织细胞外囊泡的蛋白量柱状图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
一、实验材料
Liberase TM酶购买于Roche，货号为5401119001。
ASGPR-PE购买于Santa，货号为sc-166633PE。
Anti-PE magnetic beads购买于Miltenyi Biotec，货号为130-048-801。
色谱柱购买于Miltenyi Biotec，货号为130-042-901。
DMEM培养基购买于Gibco，美国，货号为8122086。
现今组织细胞外囊泡的分类主要根据细胞外囊泡的直径大小进行区分，但此方法无法明确组织细胞外囊泡的来源，进而缺失不同细胞来源的组织细胞外囊泡的功能，同时无法对组织细胞外囊泡进行精准定位。因此，缺乏分类明确且特异有效地分离出特定类型EV工具，在实现精准治疗方面仍然面临许多挑战。
本发明中提供了一种分离肝脏组织来源的细胞外囊泡的试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：
肝细胞膜表面标志物的抗体、抗生物素标记的磁珠、Liberase TM酶溶液、DMEM培养基、含BSA和EDTA的PBS缓冲液。使用本发明中所提供的试剂盒通过组织细胞外囊泡的膜标志物进行抗原抗体染色，并利用抗体对应相应的信息素进行免疫磁珠分选，以筛选出不同膜标志物的组织细胞外囊泡，能够准确的对肝脏组织来源的细胞外囊泡进行分离。
使用方法如下所述：
在Liberase TM酶中加入DMEM配备成Liberase TM酶溶液，制备的Liberase TM酶溶液终浓度为5mg/L，并放入冰箱预冷；将0.24g KHPO4，1.44gNazHPO4，0.2g KCl，8.0gNaCl，加蒸馏水定容至1L，调pH值至7.4，制备PBS缓冲液；将重量0.5g离体组织浸泡在DMEM培养基或PBS缓冲液中；将离体组织切成2mm×2mm×2mm大小的组织块，将所述组织块转移至预冷的DMEM培养基中清洗，随后进行离心，离心条件为：4℃，300g离心力下离心10min；弃除离心后的上清液，加入Liberase TM酶溶液重悬，随后置于37℃水浴锅中振荡孵育30min，再用预冷的DMEM培养基终止消化；再次离心去除组织块，离心条件为：4℃，300g离心力下离心10min；再次离心去除细胞和碎片，离心条件为：4℃，2000g离心力下离心20min；再次离心去除杂质颗粒，离心条件为：4℃，16800g离心力下离心30min；将去除杂质颗粒得到的沉淀用PBS缓冲液洗涤，PBS缓冲液洗涤后再次离心，离心条件为：4℃，16800g离心力下离心30min，收集洗涤后的组织细胞外囊泡。
将1mLPBS缓冲液(0.5％BSA，2mM EDTA)重悬组织细胞外囊泡后与10μLASGPR-PE抗体混悬液结合，充分混匀后冰箱内避光孵育4h，再行离心，离心条件为4℃，16800g离心力下离心30min；将400μLPBS缓冲液(0.5％BSA，2mM EDTA)重悬所述沉淀后与20μLAnti-PEmicrobeads磁珠混悬液结合，充分混匀后冰箱内避光孵育15min；将色谱柱至于磁力架上，先使用大量缓冲液润洗色谱柱，然后将所述溶液至于色谱柱中，此时被磁珠标记的ASGPR+细胞外囊泡将留在柱内，未被标记的ASGPR-细胞外囊泡则经过色谱柱进入收集管中。将柱内大量已标记的细胞外囊泡用活塞挤出，再次离心，离心条件为4℃：16800g离心力下离心30min，以收集全部被标记的ASGPR+细胞外囊泡。
实施例1小鼠肝脏组织来源的细胞外囊泡的分离方法
本实施例中使用ASGPR肝细胞膜蛋白，ASGPR-PE作为直标抗体，Anti-PE magneticbeads作为抗生物素标记的磁珠，细胞外囊泡免疫磁珠分选(MACS)采用美天旎磁力架、美天旎色谱柱，但是并不限于此，只要可以达到标记肝细胞膜表面标志物的抗体及其对应磁珠均可使用。实验流程如图1所示。
本实施例中，采用小鼠肝脏0.5g、Liberase TM酶0.05mg、DMEM培养基15mL制备肝脏组织来源的细胞外囊泡：
(1)准备新生大鼠皮肤0.5g、Liberase TM酶0.05mg、DMEM培养基40mL；
(2)在Liberase TM酶中加DMEM配备成Liberase TM酶溶液，Liberase TM酶溶液浓度为5mg/L；
(3)在超净工作台内，无菌取下新生鼠背部皮肤，皮肤浸泡在5mL DMEM培养基中；用手术刀或剪刀将皮肤组织尽量切成2mm×2mm×2mm左右的肝脏组织块，将切好的肝脏组织块移至预冷5mL DMEM中清洗，在4℃，300g条件下离心10min；
(4)弃上清，加入10mL的Liberase TM酶溶液重悬，随后置于37℃水浴锅中振荡孵育30min，随后用大量预冷的20mL DMEM培养基终止消化；
(5)在4℃，300g条件下离心10min去除皮肤组织块；在4℃，2000g条件下离心20min去除细胞和碎片；在4℃，4000g条件下离心30min去除杂质颗粒；在4℃，16800g条件下超速离心30min分离得到肝脏组织细胞外囊泡；
(6)肝脏组织细胞外囊泡用20mLPBS洗涤，随后在4℃，16800g条件下超速离心30min，收集洗涤后的肝脏组织细胞外囊泡；
(7)将1mLPBS缓冲液(0.5％BSA，2mM EDTA)重悬肝脏组织细胞外囊泡，随后将10μLASGPR-PE抗体结合，充分混匀后冰箱内避光孵育4h；在4℃，16800g条件下超速离心30min，收集ASGPR+标记的肝脏组织细胞外囊泡；
(8)将400μLPBS缓冲液(0.5％BSA，2mM EDTA)重悬ASGPR+标记的肝脏组织细胞外囊泡，随后将20μLAnti-PE microbeads结合，充分混匀后冰箱内避光孵育15min；待抗生物素标记的磁珠与抗体充分结合后用1mLPBS缓冲液(0.5％BSA，2mM EDTA)漂洗细胞外囊泡，再次与4℃，16800g条件下超速离心30min，收集结合磁珠的肝脏组织细胞外囊泡；
(9)用移液管完全除去上清液后，PBS缓冲液(0.5％BSA，2mM EDTA)重悬。分离细胞外囊泡时，将色谱柱至于磁力分离器上，先用3mL PBS缓冲液(0.5％BSA，2mM EDTA)活化平衡色谱柱，然后上样，此时与特异性抗体结合的ASGPR+肝脏组织细胞外囊泡(阳性EVs)将吸附于磁场中，未被吸附的ASGPR-细胞外囊泡(阴性EVs)流经磁场后用收集管收集，并分3次加入3mL缓冲液充分洗脱未被磁力吸附的ASGPR-细胞外囊泡。
(10)将柱内已标记的细胞外囊泡用活塞挤出，在4℃，16800g条件下超速离心30min收集全部被标记的ASGPR+细胞外囊泡。
实施例2小鼠肝脏组织来源的细胞外囊泡的分离方法
本实施例中，采用小鼠肝脏0.5g、Liberase TM酶0.05mg、DMEM培养基15mL制备肝脏组织来源的细胞外囊泡：
(1)准备新生大鼠皮肤0.5g、Liberase TM酶0.05mg、DMEM培养基40mL；
(2)在Liberase TM酶中加DMEM配备成Liberase TM酶溶液，Liberase TM酶溶液浓度为3mg/L；
(3)在超净工作台内，无菌取下新生鼠背部皮肤，皮肤浸泡在5mL DMEM培养基中；用手术刀或剪刀将皮肤组织尽量切成2mm×2mm×2mm左右的肝脏组织块，将切好的肝脏组织块移至预冷5mL DMEM中清洗，在4℃，300g条件下离心8min；
(4)弃上清，加入10mL的Liberase TM酶溶液重悬，随后置于37℃水浴锅中振荡孵育30min，随后用大量预冷的20mL DMEM培养基终止消化；
(5)在4℃，300g条件下离心18min去除皮肤组织块；在4℃，2000g条件下离心18min去除细胞和碎片；在4℃，4000g条件下离心60min去除杂质颗粒；在4℃，16800g条件下超速离心28min分离得到肝脏组织细胞外囊泡；
(6)肝脏组织细胞外囊泡用20mLPBS洗涤，随后在4℃，16800g条件下超速离心35min，收集洗涤后的肝脏组织细胞外囊泡；
(7)将1mLPBS缓冲液(0.5％BSA，3mM EDTA)重悬肝脏组织细胞外囊泡，随后将10μLASGPR-PE抗体结合，充分混匀后冰箱内避光孵育4h；在4℃，16800g条件下超速离心30min，收集ASGPR+标记的肝脏组织细胞外囊泡；
(8)将400μL PBS缓冲液(0.5％BSA，3mM EDTA)重悬ASGPR+标记的肝脏组织细胞外囊泡，随后将20μLAnti-PE microbeads结合，充分混匀后冰箱内避光孵育15min；待抗生物素标记的磁珠与抗体充分结合后用1mL PBS缓冲液(0.5％BSA，2mM EDTA)漂洗细胞外囊泡，再次与4℃，16800g条件下超速离心28min，收集结合磁珠的肝脏组织细胞外囊泡；
(9)用移液管完全除去上清液后，PBS缓冲液(0.5％BSA，3mM EDTA)重悬。分离细胞外囊泡时，将色谱柱至于磁力分离器上，先用3mL PBS缓冲液(0.5％BSA，3mM EDTA)活化平衡色谱柱，然后上样，此时与特异性抗体结合的ASGPR+肝脏组织细胞外囊泡将吸附于磁场中，未被吸附的ASGPR-细胞外囊泡流经磁场后用收集管收集，并分3次加入3mL缓冲液充分洗脱未被磁力吸附的ASGPR-细胞外囊泡。
(10)将柱内已标记的细胞外囊泡用活塞挤出，在4℃，16800g条件下超速离心35min收集全部被标记的ASGPR+细胞外囊泡。
实施例3小鼠肝脏组织来源的细胞外囊泡的分离方法
本实施例中，采用小鼠肝脏0.5g、Liberase TM酶0.05mg、DMEM培养基15mL制备肝脏组织来源的细胞外囊泡：
(1)准备新生大鼠皮肤0.5g、Liberase TM酶0.05mg、DMEM培养基40mL；
(2)在Liberase TM酶中加DMEM配备成Liberase TM酶溶液，Liberase TM酶溶液浓度为6mg/L；
(3)在超净工作台内，无菌取下新生鼠背部皮肤，皮肤浸泡在5mL DMEM培养基中；用手术刀或剪刀将皮肤组织尽量切成2mm×2mm×2mm左右的肝脏组织块，将切好的肝脏组织块移至预冷5mL DMEM中清洗，在4℃，300g条件下离心13min；
(4)弃上清，加入10mL的Liberase TM酶溶液重悬，随后置于37℃水浴锅中振荡孵育30min，随后用大量预冷的20mL DMEM培养基终止消化；
(5)在4℃，300g条件下离心13min去除皮肤组织块；在4℃，2000g条件下离心23min去除细胞和碎片；在4℃，4000g条件下离心60min去除杂质颗粒；在4℃，16800g条件下超速离心35min分离得到肝脏组织细胞外囊泡；
(6)肝脏组织细胞外囊泡用20mLPBS洗涤，随后在4℃，16800g条件下超速离心35min，收集洗涤后的肝脏组织细胞外囊泡；
(7)将1mLPBS缓冲液(0.5％BSA，3mM EDTA)重悬肝脏组织细胞外囊泡，随后将10μLASGPR-PE抗体结合，充分混匀后冰箱内避光孵育4h；在4℃，16800g条件下超速离心30min，收集ASGPR+标记的肝脏组织细胞外囊泡；
(8)将400μL PBS缓冲液(0.5％BSA，3mM EDTA)重悬ASGPR+标记的肝脏组织细胞外囊泡，随后将20μLAnti-PE microbeads结合，充分混匀后冰箱内避光孵育15min；待抗生物素标记的磁珠与抗体充分结合后用1mL PBS缓冲液(0.5％BSA，2mM EDTA)漂洗细胞外囊泡，再次与4℃，16800g条件下超速离心30min，收集结合磁珠的肝脏组织细胞外囊泡；
(9)用移液管完全除去上清液后，PBS缓冲液(0.5％BSA，3mM EDTA)重悬。分离细胞外囊泡时，将色谱柱至于磁力分离器上，先用3mL PBS缓冲液(0.5％BSA，3mM EDTA)活化平衡色谱柱，然后上样，此时与特异性抗体结合的ASGPR+肝脏组织细胞外囊泡将吸附于磁场中，未被吸附的ASGPR-细胞外囊泡流经磁场后用收集管收集，并分3次加入3mL缓冲液充分洗脱未被磁力吸附的ASGPR-细胞外囊泡。
(10)将柱内已标记的细胞外囊泡用活塞挤出，在4℃，16800g条件下超速离心35min收集全部被标记的ASGPR+细胞外囊泡。
实施例4ASGPR+特异性肝脏组织来源的细胞外囊泡的鉴定和分选效率分析
1、ASGPR+特异性肝脏组织来源的细胞外囊泡的高效分选效率。
流式细胞分析揭示了免疫磁珠分选前后肝组织细胞外囊泡分选效率，我们将细胞外囊泡进行了流式细胞分析术检测，流式细胞术实验设计及相关分组如图2的A所示。此实验设置5组分别为：TubeA为单PBS组，为了排除PBS中杂质颗粒对流式分析的影响；Tube B为PE-isotype同型对照组，为了排除直标抗体自身荧光对流式分析的影响；Tube C为分选前细胞外囊泡；Tube D为分选后ASGPR-的细胞外囊泡；Tube D为分选后ASGPR+的细胞外囊泡。结果如图2的B所示，流式细胞分析结果展示了PBS(TubeA)和同型对照组(Tube B)中颗粒分布及PE荧光的表达情况。结果如图2的C所示，流式细胞分析结果展示了免疫磁珠分选前肝组织细胞外囊泡(Tube C)PE荧光表达率为33.79％，免疫磁珠分选后ASGPR-的肝组织细胞外(Tube D)囊泡PE荧光表达率为0.10％，免疫磁珠分选后ASGPR+的肝组织细胞外(Tube E)囊泡PE荧光表达率为98.34％。综上结果得出，免疫磁珠可以根据膜表面标志物成功分选相对应的细胞外囊泡。
2、不同状态下ASGPR+组织来源细胞外囊泡的特性
利用肝切除术后，观察到肝脏释放了大量的细胞外囊泡。我们对免疫磁珠分选前后的肝组织细胞外囊泡进行了特征鉴定。结果如图3的A和B所示，透射电镜图像显示，正常状态(Sham)和肝切(PHx)后状态，两种状态下，肝细胞外囊泡形态均未发生变化，呈现出双层膜小泡样结构。标尺＝250nm。
根据MISEV2018指南评估分选后的细胞外囊泡质量，结果如图4所示，Westernblot分析显示免疫磁珠分选前后的肝组织细胞外囊泡都表达了具有代表性蛋白标记物，包括四联蛋白CD63、内体分选复合物(Endosomal sorting complex requiredfortransport，ESCRT)、肿瘤抑制基因101(Tumor suppressor gene 101，TSG101)以及脂质蛋白(Lipidraftprotein,Flotillin-1)，同时未检测到阴性标记物高尔基成分蛋白(Golgicomponentprotein，Golgin84)。
如图5的A所示，通过NTA测量发现，在分选前的肝组织中，细胞外囊泡粒径范围为50-500nm，并且峰值在150-200nm之间。如图5的B所示，分选前后细胞外囊泡粒径没有明显变化。
如图6的A-D所示，通过NTA测定免疫磁珠分选前后肝组织细胞外囊泡的颗粒数和通过BCA测定免疫磁珠分选前后肝组织细胞外囊泡的蛋白含量。进一步检测分选后肝组织来源的细胞外囊泡时，NTA颗粒数目定量和BCA蛋白含量也表明分选过程对细胞外囊泡在机体正常生理过程的作用无影响，并能反应机体处于正常生理状态下情况。每组N＝3；与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，NS＝无显著学差异。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种分离肝脏组织来源的细胞外囊泡的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：
肝细胞膜表面标志物的抗体、抗生物素标记的磁珠、Liberase TM酶溶液、DMEM培养基、含BSA和EDTA的PBS缓冲液；
所述肝细胞膜表面标志物为去唾液酸糖蛋白受体ASGPR。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Liberase TM酶溶液的浓度为3-6mg/L。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PBS缓冲液中BSA的质量浓度为0.4-0.6％。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PBS缓冲液中EDTA的摩尔浓度为2-3mM。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体为ASGPR-PE抗体。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗生物素标记的磁珠为Anti-PEmicrobeads。
7.一种分离肝脏组织来源的细胞外囊泡的方法，其特征在于，使用权利要求1-6任一项所述的试剂盒分离肝脏组织来源的细胞外囊泡。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将用DMEM培养基清洗离体肝脏组织块，然后进行第一次离心，保留沉淀；所述沉淀使用Liberase TM酶重悬，孵育，形成重悬液，去除所述重悬液中的组织块、去除细胞和碎片、去除杂质颗粒，之后将所得产物使用PBS缓冲液洗涤后，再次第二次离心，收集到的沉淀即为组织细胞外囊泡；
将所述组织细胞外囊泡与所述肝细胞膜表面标志物的抗体结合，孵育，进行第三次离心，收集沉淀；所述沉淀经重悬后与抗生物素标记的磁珠结合，孵育，使用色谱柱和磁力分离器将与抗体特异性结合的组织细胞外囊泡和未与抗体特异性结合的组织细胞外囊泡进行分离，与抗体特异性结合的组织细胞外囊泡保留在色谱柱中。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一次离心的条件为：3-5℃，290-310g条件下，离心8-13min；
去除所述重悬液中的组织块是在3-5℃，290-310g条件下，离心8-13min实现的；
所述去除细胞和碎片是在3-5℃，1900-2200g条件下，离心18-23min通过离心实现的；
所述去除杂质颗粒是在3-5℃，15000-17500g条件下，离心28-35min实现的；
所述第二次和第三次离心的条件为：3-5℃，15000-17500g条件下，离心28-35min。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述孵育的时间为10min-300min。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN118325817A true CN118325817A (zh) | 2024-07-12 |
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