CN109536504A

CN109536504A - 一种与缺血脑组织特异结合的核酸适配体及其应用、试剂盒

Info

Publication number: CN109536504A
Application number: CN201811487690.2A
Authority: CN
Inventors: 谭蔚泓; 涂海军; 刘超; 蒋伟; 田西彬
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2018-12-06
Filing date: 2018-12-06
Publication date: 2019-03-29
Anticipated expiration: 2038-12-06
Also published as: CN109536504B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种与缺血脑组织特异结合的核酸适配体及其应用、试剂盒。该核酸适配体的二级结构为茎环结构，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。本发明提供的核酸适配体能够特异性识别脑缺血组织及其表达分泌的靶标蛋白Vigilin，且结合能力强，为脑缺血神经损伤程度鉴定提供了新的方法与分子工具。

Description

一种与缺血脑组织特异结合的核酸适配体及其应用、试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种与缺血脑组织特异结合的核酸适配体及其应用、试剂盒。

背景技术

脑中风是仅次于心血管疾病的第二大杀手，全球约3300万中风患者，其中缺血性中风发生率占60％-80％。脑中风不仅致死率高，而且更多的患者在中风后，神经元细胞受到损伤，无法得到有效修复与治疗，从而失去行为能力，瘫痪在床，为家庭和社会带来沉重的经济与心理负担。

核酸适配体通过氢键、范德华力、疏水堆积等分子间相互作用力形成稳定的三维空间结构，能够特异地识别蛋白或其它小分子物质，具有易于在体外合成，靶向分子范围广，亲和力高，化学性质稳定，容易进行化学修饰，免疫原性小，组织穿透能力强等优点，能够通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选出来。该技术通常以癌细胞为对象进行筛选，已经筛选出多个靶向癌细胞的分子探针，并鉴定出了相关靶蛋白，在癌症的早期诊断与治疗，以及分子机制研究中展示了广阔的应用前景。

现有核酸适配体筛选技术主要通过培养的细胞系进行筛选，然而缺血脑组织成分复杂，多种细胞相互作用，且神经元细胞不能进行传代培养，因此通过细胞为靶标对脑缺血疾病进行核酸适配体筛选的研究无法有效进行，至今未曾报道筛选到与脑缺血疾病靶标特异结合的核酸适配体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与缺血脑组织特异结合的核酸适配体及其应用、试剂盒。本发明提供的核酸适配体够特异性识别缺血脑组织及其表达分泌的靶标蛋白Vigilin，且结合能力强。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种与缺血脑组织特异结合的核酸适配体，具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列。

本发明通过构建脑缺血小鼠动物模型，利用冰冻脑组织切片为筛选对象，结合核酸适配体筛选技术，筛选到特异性靶向脑缺血疾病组织的核酸适配体分子探针LCW17，序列如SEQ ID NO：5所示，并鉴定出相关生物标志物Vigilin蛋白。经试验验证，本发明核酸适配体分子探针LCW17与脑缺血组织及Vigilin蛋白结合能力较强，与脑缺血组织的亲和力常数Kd＝17±8nM，与Vigilin蛋白的亲和力常数Kd＝25±3nM，均达到nM级别。本发明提供的核酸适配体是第一种识别脑缺血组织的核酸适配体探针，为脑缺血神经损伤程度鉴定提供了新的方法与分子工具。

本发明提供的核酸适配体，其二级结构为图3所示的茎环结构。

在一些实施方案中，所述核酸适配体的5’端或3’端经修饰物修饰。在一些具体实施例中，所述修饰物为生物素或荧光基团。

本发明还提供一种所述核酸适配体的筛选方法，包括：

构建随机文库，以SEQ ID NO:3～4所示的核苷酸序列为引物构建PCR扩增文库；以缺血脑切片进行正筛，以正常脑切片进行反筛，交替进行正筛选、反筛选共计11次，每轮筛选过程中正筛的时间由2小时逐渐缩短至0.5小时，负筛的时间由10分钟逐渐增至1小时；

筛选获得的ssDNA文库经测序后，选择丰度较高的核酸适配体，获得与缺血脑组织特异结合的核酸适配体，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述随机文库由顺序连接的5’端固定区域、随机区域、3’端固定区域组成；所述5’端固定区域的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述3’端固定区域的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。

其中，正筛由2小时逐渐缩短至0.5小时，即由2小时每次缩短30min，逐渐缩短至0.5小时；负筛的时间由20分钟逐渐增至1小时，即由20分钟每次增加20分钟，逐渐增加至1小时。

所述随机区域的长度为30bp。

所述随机区域中各碱基独立的选自A、T、C、G。

高密度脂蛋白结合蛋白(HDLBP)，即VIGILIN蛋白，普遍存在于成纤维细胞、主动脉内皮细胞和肝细胞，在动物的脂肪代谢中发挥重要的作用。

本发明通过核酸适配体分子探针LCW17筛选出脑缺血疾病相关标志物，并鉴定该标志物为高密度脂蛋白结合蛋白Vigilin。因此，本发明还提供了所述核酸适配体在制备脑缺血疾病标志物中的应用。

本发明还提供了所述核酸适配体在制备非诊断目的检测Vigilin蛋白的试剂盒中的应用。

本发明还提供了所述核酸适配体在制备特异性结合Vigilin蛋白的分子探针中的应用。

本发明还提供一种试剂盒，包括核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的核酸适配体。

本发明提供了一种与缺血脑组织特异结合的核酸适配体，具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列。经试验验证，本发明核酸适配体分子探针LCW17与脑缺血组织及Vigilin蛋白结合能力较强，与脑缺血组织的亲和力常数Kd＝17±8nM，与Vigilin蛋白的亲和力常数Kd＝25±3nM，均达到nM级别。本发明提供的核酸适配体是第一种识别脑缺血组织的核酸适配体探针，为脑缺血神经损伤程度鉴定提供了新的方法与分子工具。

附图说明

图1为获取小鼠脑缺血组织切片示意图；

图2为筛选特异性识别脑缺血组织或蛋白靶标核酸适配体的流程图；

图3为本发明核酸适配体LCW17二级结构示意图；

图4为5端修饰有6-羧基荧光素的核酸适配体LCW17在488nm波长激光激发的荧光发射光谱图；

图5为核酸适配体初始文库、LCW17结合脑切片荧光成像结果，标尺为10μm；

图6为核酸适配体文库、LCW17结合脑切片荧光定量分析图；

图7为核酸适配体LCW17与缺血脑组织结合的拟合曲线，横坐标为核酸适配体的浓度，单位nM；纵坐标为平均荧光强度，单位a.u.；

图8为核酸适配体LCW17用于评估脑缺血损伤程度的荧光分析图，标尺为10μm；

图9为核酸适配体LCW7结合靶标分子鉴定为高密度脂蛋白结合蛋白(Vigilin)的结果图；其中，图9A为生物素标记的核酸适配体LCW7与缺血脑组织中提取的总蛋白结合情况的电泳图，其中文库DNA，空白微珠(空白珠子)为对照组；图9B为特异性条带质谱分析结果图；图9C为LCW17捕获的蛋白与Vigilin蛋白抗体的蛋白质免疫印迹结果图；

图10.为不同浓度的核酸适配体LCW17与Vigilin蛋白结合情况的电泳图；

图11.为不同浓度的核酸适配体LCW17与纯化的Vigilin蛋白结合拟合曲线图，测得Kd为25±3nM。

具体实施方式

本发明公开了一种与缺血脑组织特异结合的核酸适配体及其应用、试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1与缺血脑组织特异结合的核酸适配体的筛选

1、合成以下所示的DNA文库序列和引物序列

初始文库DNA序列为：

5’-AGCGTCGAATACCACTACAG-30-nt-CTAATGGAGCTCGTGGTCAG-3’

两端序列用于与引物结合进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，中间30个碱基为随机序列，引物序列分别为：

5’-FAM-AGCGTCGAATACCACTACAG-3’

5’-Biotin-CTGACCACGAGCTCCATTAG-3’。

2、缺血脑组织切片获取

通过线栓阻塞小鼠左侧大脑中动脉(MCAO)的方法，造成小鼠左半脑缺血的状态，缺血时间为4小时。随后，将具备脑缺血行为的小鼠灌注多聚甲醛固定，脱水后将左右两侧大脑分别制成约30-50μm厚冰冻切片，即为缺血脑切片和正常脑切片，如图1所示。本发明采用冰冻切片进行筛选，能够更好地保存样品内蛋白的生物活性，同时减少了组织切片的非特异性吸附。

3筛选

3.1封闭

将脑切片用DPBS缓冲液清洗3次，含1％牛血清蛋白，1％鲑鱼精DNA，1％镁离子的DPBS缓冲液A孵育30分钟。

3.2正筛

将5nmol的初始文库DNA溶于100微升缓冲液A，加热到95度变性5分钟，冰上冷却10分钟，与4片缺血脑切片孵育2小时。随后用含有5mM镁离子的DPBS缓冲液B清洗3次，在清洗后的缺血脑切片加热100度20分钟，10000g转速，4度离心15分钟取上清液。

3.3负筛

将正筛的上清液与封闭后的正常脑切片孵育30分钟，随后加入200微升超纯水，10000g转速，4度离心15分钟取上清液。

3.4PCR反应

将负筛后的产物进行聚合酶链式反应扩增，反应中引物序列为步骤1中所述。

3.5单链DNA富集

将PCR反应产物与亲和素标记的琼脂糖微珠孵育，再利用2M NaOH溶液变性解链，过滤脱盐，收集到FAM标记的ssDNA，进行冻干。

3.6多轮筛选

重复3.2-3.5所述，将冻干的ssDNA用于下一轮筛选。每轮筛选过程中正筛的时间由两小时逐渐缩短至0.5小时，负筛的时间则逐渐增至1小时。

3.7测序与序列分析

经过11论筛选后，将PCR反应产物进行测序分析，挑选出丰度较高的核酸适配体LCW17，利用软件idtdna.com网络平台分析出核酸适配体LCW17。筛选过程如图2所示，核酸适配体LCW17的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，其二级结构示意图如图3所示。

SEQ ID NO：5：AGCGTCGAATACCACTACAGAATACCCTAAAACCTAAACTACCTATCAACCTAATGGAGCTCGTGGTCAG。

实施例2本发明核酸适配体LCW17靶向缺血脑组织验证试验

1、荧光成像验证核酸适配体LCW17靶向缺血脑组织

分别将核酸适配体LCW17的5端修饰6-羧基荧光素，取30pmol溶于200微升DPBS缓冲液A，95度变性5分钟，冰上冷却10分钟，与事先封闭的缺血脑切片、正常脑切片分别孵育40分钟，清洗三次，于共聚焦荧光显微镜下成像。同时将同一浓度的标有6-羧基荧光素的初始文库单链DNA经过同样处理，与事先封闭的脑切片孵育成像，用于对照实验。

结果如图5所示，初始文库基本不结合两种脑切片，LCW17结合在缺血脑切片的荧光团数目明显多于正常切片和文库组。进一步通过软件分析比较四个实验的荧光强度，结果如图6所示，LCW17结合在缺血脑切片的平均荧光强度显著高于其它三组。结果表明，核酸适配体分子LCW17能够特异性识别并结合小鼠缺血脑组织切片。

2、核酸适配体LCW17结合脑缺血组织亲和力测定

将DPBS缓冲液A配置不同浓度的LCW17(5’端修饰有6-羧基荧光素的核酸适配体)试剂，浓度分别为浓度为0nM、10nM、50nM、100nM、200nM、300nM和500nM的溶液，95度变性5分钟，冰上冷却10分钟，分别与事先封闭的缺血脑切片孵育40分钟，清洗三次，于共聚焦荧光显微镜下成像，通过软件得到不同浓度下，脑切片的平均荧光强度。利用OriginPro 8.0软件，拟合利用Y＝BmaxX/(Kd+X)公式，以梯度浓度为横坐标，平均荧光强度为纵坐标绘图，如图7所示，测得Kd＝17±8nM。从而表明核酸适配体LCW17结合缺血脑切片的能力较强，亲和力常数在纳摩尔级别。

3、核酸适配体LCW17有效评估不同时间的脑缺血损伤程度

将不缺血，缺血2，3，4小时的小鼠脑切片，分别与150nM的LCW17(5端修饰有6-羧基荧光素的核酸适配体)孵育共聚焦成像，结果如图8所示，缺血时间越久，荧光颗粒越多，平均荧光强度越强。

4、核酸适配体LCW17探针靶标分子鉴定

4.1全脑蛋白样品制备

将缺血后小鼠大脑通过组织研磨器研碎，放入EP管中，加入1mL细胞裂解液，4度12000rpm离心30分钟，去上清4度保存。

4.2核酸序列捕获靶标分子

将LCW17的5端标记生物素，95度变性5分钟，冰上冷却10分钟。将全脑蛋白提取液500微升，标记链霉亲和素的琼脂糖微珠100微升，LCW17最终浓度为250nM，4度摇床混合40分钟，离心清洗三次，去上清，得到核酸序列捕获蛋白。

4.3蛋白电泳与质谱鉴定靶标分子

将捕获的蛋白加入凝胶电泳样品缓冲液，100度变性10分钟，冰上冷却，进行SDS-PAGE胶电泳，考马斯亮蓝染色，与初始文库结合的蛋白条带比较，得到LCW17特异性结合条带，如图9-A中箭头所示，将特异性条带切割，胰酶酶解，质谱分析，结果如图9-B所示，LCW17特异性结合蛋白为高密度脂蛋白结合蛋白Vigilin。

4.4蛋白质免疫印迹验证靶标分子

通过购买获得Vigilin蛋白抗体进行蛋白质免疫印迹实验，如图8-C所示，结果表明LCW17捕获的蛋白能够有效的被Vigilin蛋白抗体所识别，初始文库不能捕获Vigilin蛋白抗体所识别的抗体。同时我们将纯化的带有组氨酸标签的Vigilin蛋白与不同浓度的LCW17孵育，通过组氨酸标签抗体检测，结果如图10所示，LCW17浓度升高，捕获到的Vigilin蛋白增加，从而条带加深。从而有效证明核酸适配体LCW17结合的靶标蛋白为Vigilin蛋白。

4.5LCW17与靶标蛋白Vigilin亲和力测定

将LCW17探针5端修饰生物素，不同浓度的LCW17生物素探针孵育包被有0.3μg/μL的Vigilin蛋白96孔板，清洗后，通过检测生物素含量的酶联免疫试剂盒测得生物素含量及LCW17含量，获得LCW17与Vigilin蛋白结合的动力学曲线，通过用OriginPro 8.0软件，拟合利用Y＝BmaxX/(Kd+X)公式，以梯度浓度为横坐标，平均荧光强度为纵坐标绘图，如图11所示，测得Kd＝25±3nM，表明核酸适配体LCW17结合Vigilin蛋白的能力较强，亲和力常数在纳摩尔级别。

实施例3试剂盒的制备

合成SEQ ID NO：5所示的核酸适配体，制备成试剂盒。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 湖南大学

<120> 一种与缺血脑组织特异结合的核酸适配体及其应用、试剂盒

<130> MP1827440

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcgtcgaat accactacag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctaatggagc tcgtggtcag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcgtcgaat accactacag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgaccacga gctccattag 20

<210> 5

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcgtcgaat accactacag aataccctaa aacctaaact acctatcaac ctaatggagc 60

tcgtggtcag 70

Claims

1.一种与缺血脑组织特异结合的核酸适配体，其特征在于，具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述核酸适配体，其特征在于，其二级结构为图3所示的茎环结构。

3.根据权利要求1所述核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的5’端或3’端经修饰物修饰。

4.根据权利要求3所述核酸适配体，其特征在于，所述修饰物为生物素或荧光基团。

5.权利要求1所述的核酸适配体的筛选方法，其特征在于，包括：

筛选获得的ssDNA文库经测序后，选择丰度较高的核酸适配体，获得与缺血脑组织特异结合的核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述随机文库由顺序连接的5’端固定区域、随机区域和3’端固定区域组成；所述5’端固定区域的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述3’端固定区域的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。

6.权利要求1～4任一项所述核酸适配体在制备脑缺血疾病标志物中的应用。

7.权利要求1～4任一项所述核酸适配体在制备非诊断目的检测Vigilin蛋白的试剂盒中的应用。

8.权利要求1～4任一项所述核酸适配体在制备特异性结合Vigilin蛋白的分子探针中的应用。

9.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至4中任一项所述核酸适配体。