CN103091491B - 鉴别从人或动物生物体液中富集的非血源性有核细胞的方法 - Google Patents

鉴别从人或动物生物体液中富集的非血源性有核细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于从人的生物体液中将红细胞与非血源性有核细胞进行快速有效分离的方法，该方法不需裂解融破红细胞，不会对人的体液内的靶细胞(如体液中的肿瘤细胞)产生任何影响，从而很好地保持了原有的细胞形态，极为便于后续的细胞识别与判断。本发明还涉及一种鉴别从人或动物生物体液中富集的非血源性有核细胞(如肿瘤细胞，血管上皮细胞等)的方法，其中同步实施抗人白细胞抗体免疫荧光染色以及染色体荧光原位杂交以区别血源性有核细胞，以有效去除在判断肿瘤细胞过程中血源性细胞产生的干扰，从而达到高效快速地从人体液中富集提取并有效鉴别非血源性上皮来源(实体瘤)或非上皮来源(黑色素瘤)的稀有肿瘤细胞。

Description

鉴别从人或动物生物体液中富集的非血源性有核细胞的方法
技术领域
本发明主要涉及使用同步免疫荧光原位杂交技术鉴定从人或动物生物体液中富集的恶性上皮来源(实体肿瘤)或非上皮来源(黑色素瘤)的肿瘤细胞。 
背景技术
提取并检测人生物体液(胸水或胸腔积液，腹水或腹腔积液，脑脊液，淋巴液及/或血液等)中的恶性上皮细胞(肿瘤细胞)的巨大现实及潜在的临床意义早已被人们所证实。在许多采集的人的生物体液样本中，常常混有大量的红细胞及白细胞.从而对实验操作及结果的判别造成极大干扰.目前临床或医学实验中通用的去除红细胞的方法是使用低渗裂解法裂解去除红细胞.然而在低渗裂解过程中，伴随着红细胞的裂缝，许多恶性上皮细胞(肿瘤细胞)也受到了一定程度的损害，使细胞形态与特性发生改变，从而影响对这类细胞的正确判别。 
荧光原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization，FISH)技术用于病理组织中的肿瘤细胞检测已有广泛报道。其中一项主要技术应用即为使用荧光标记的染色体着丝粒特异探针对体液中处于间期的肿瘤细胞进行染色体数目的识别(正常细胞染色体为二倍体)，以发现存在于肿瘤细胞内的非二倍体染色体，即超二倍体或多倍体染色体，从而达到识别肿瘤细胞的目的。FISH方法以往已被较多地使用在血液病肿瘤的诊断中，但用于检测体液包括血液中的实体瘤细胞(非血液病肿瘤)的报道却极为罕见。应用FISH方法从血标本中检测肿瘤细胞最常见的问题就是如何区分血缘性 非正常染色体数目的细胞，这类细胞可见于血小板增生引起的血中某些白细胞染色体数目异常，或人体内自然形成的某些少量白细胞染色体数目异常，以及染色体探针非特异着色引起的血细胞假阳性染色体数目异常。所以在进行FISH识别判断血液中的非血缘性实体瘤细胞时，有效区分血缘性与非血缘性细胞具有极其重要的意义。然而这方面的研究还没有任何报道。 
除此之外，虽然个别文章报道了基于肿瘤上皮细胞染色基础之上的非同步FISH方法用于检测血中的循环肿瘤细胞，即FISH与抗肿瘤细胞标识物抗体染色非同步交替进行，但考虑到大量脱落的实体瘤肿瘤细胞在液体环境中因生长环境发生了彻底改变而丧失了肿瘤上皮细胞的特性，而直接影响对肿瘤细胞的抗体免疫染色，从而造成大量假阴性，所以不具备任何临床使用价值。 
由于上述原因，本发明将基于利用一种密度分离剂(即细胞分离介质)的组合物的离心方法用于将人的生物体液中的红细胞与恶性上皮细胞及其它有核细胞进行快速有效的分离，在无融破裂解红细胞实验步骤的情况下取得了令人意料不到的实验结果，证明利用此组合物能够快速、高效地将人的体液样品中的绝大部分红细胞及血浆蛋白质与体液标本中的其它有核细胞包括肿瘤细胞进行有效分离，不会对人的体液内的靶细胞(如体液中的肿瘤细胞)产生任何影响，从而很好地保持了原有的细胞形态，以极大地便于后续的细胞识别与判断。在使用免疫磁珠去除白细胞后，能够快速富集并提取生物体液中的非血源性恶性上皮细胞(肿瘤细胞)及血管内皮细胞等。在后续使用FISH方法进行鉴别非血源性恶性上皮细胞时，同步使用抗人白细胞表面抗原的抗体进行免疫荧光染色以排除任何血源性细胞的干扰，从而对人的生物体液样本中富集的非血源性恶性肿瘤细胞进行快速、准确的鉴别。 
发明内容
本发明涉及一种鉴别从人或动物生物体液中富集的非血源性恶性有核细胞的方法，其中同步实施抗人或动物白细胞抗体免疫荧光染色以及染色体荧光原位杂交以区别血源性有核细胞。非血源性恶性有核细胞例如是肿瘤细胞或血管上皮细胞。 
用于所述免疫荧光染色的抗人或动物白细胞抗体特异性地识别下述人的白细胞表面标示物的一种或多种的抗原：CD3、CD31、CD34、CD45、CD50、CD69、CD84、或CD102。 
用于所述染色体荧光原位杂交的荧光标记的探针或探针组合群可特异性地识别人或动物的任何一个或多个染色体。 
本发明还涉及一种用于从人的生物体液中将红细胞与非血源性有核细胞如肿瘤细胞，血管上皮细胞等进行快速有效分离的方法，其中所述方法无需融破裂解红细胞的步骤，其中利用一种细胞分离介质来进行分离，所述细胞分离介质在20℃下的比重为1.07156～1.07738克/毫升，所述细胞分离介质包含选自下列试剂中的任意一种或任意两种以上的成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅(polyvinylpyrrolidine coated colloidal silica)；多聚糖(polysucrose)；泛影酸钠(sodium diatrizoate)或其衍生物；由蔗糖和表氯醇构成的非离子聚合物；或任何一种含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖；碘化小分子化合物，如甲泛影酰胺(metrizamide)；或任意蛋白溶液。本发明的新的细胞分离介质的使用可极大地缩短离心时间，并将细胞回收率从原有的60±20％稳定地提高到95％-100％。 
本发明还涉及一种用于从人的生物体液中富集非血源性恶性有核细胞的方法，其中所述方法无需融破裂解红细胞的步骤，该方法包括离心以去除血浆蛋白；将离心后的上清液置于细胞分离介质顶层再次进行离心，取上清液，加入抗白细胞抗体偶联的免疫磁珠进行孵育后吸附磁珠，离心以富集细胞沉淀。 
本发明还涉及一种从人或动物生物体液中富集非血源性有核细胞并对其进行鉴别的方法，包括：离心以去除血浆蛋白；将离心后的上清液置于细胞分离介质顶层再次进行离心，取上清液，加入抗白细胞抗体偶联的免疫磁珠进行孵育后吸附磁珠，离心，取富集的细胞沉淀，其中对该富集的细胞沉淀同步实施抗人或动物白细胞抗体免疫荧光染色以及染色体荧光原位杂交来区别血源性有核细胞。 
人或动物的生物体液包括但并不限于胸水或胸腔积液，腹水或腹腔积液，脑脊液，淋巴液及/或血液。人或动物生物体液内的非血源性有核细胞选自由以下组成的组：具有上皮来源的任何实体瘤细胞、或不具有上皮来源的任何肿瘤细胞，循环的血管内皮细胞和肿瘤干细胞。非血缘性有核细胞来自人的所有上皮来源的实体瘤细胞，包括但不局限于胰腺癌、肺癌、宫颈癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮来源的肿瘤细胞，如黑色素瘤。 
相对于目前市场上通用的商品化红细胞裂解液而言，本发明的细胞分离介质的使用仅针对人或病人，在不影响所有细胞形态与特性基础上可快速完成与红细胞的分离，并将靶细胞的回收率从原有的60±20％稳定地提高到95％以上。该细胞分离介质与去除白细胞试剂手段及同步免疫-FISH方法相结合，在免除融破红细胞实验步骤的前提下，可以有效地快速富集提取并准确鉴定人或动物生物体液中的非血缘性有核细胞，如肿瘤上皮细胞等，对肿瘤的早期诊断，恶性胸、腹水的判别，脑脊液中神经肿瘤细胞(如神经胶质瘤)的判别，抗肿瘤新药及治疗心血管疾病新药的研发等方面，都具有极大的现实与潜在的临床意义。 
具体实施方式
本发明一方面提供了利用一种密度分离剂(即细胞分离介质)将人的生物体液中的红细胞与恶性上皮细胞及其它有核细胞进行快速有效分离的方法。另一方面，本发明还提供了一种独特地使用同步免疫-荧光原位杂交技术用于快速、准确地鉴别从人或动物生物体液中富集的非血缘性有 核细胞，如肿瘤细胞的方法，其中该方法将抗人或动物白细胞表面抗原的免疫荧光抗体染色与FISH相结合，同步染色。 
在一个具体实施例中，所述细胞分离介质在20℃下的比重为1.07156～1.07738克/毫升，所述细胞分离介质包含选自下列试剂中的任意一种或任意两种以上的成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅(polyvinylpyrrolidine coated colloidal silica)；多聚糖(polysucrose)；泛影酸钠(sodium diatrizoate)或其衍生物；由蔗糖和表氯醇构成的非离子聚合物；或任何一种含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖；碘化小分子化合物，如甲泛影酰胺(metrizamide)；或任意蛋白溶液。优选地，所述细胞分离介质在20℃下的比重为1.07224～1.07568克/毫升。 
在优选实施例中，用于免疫荧光染色的单克隆抗体特异性地识别下述人或动物白细胞表面标示物的一种或多种的抗原：CD3、CD31、CD34、CD45、CD50，CD69、CD84、或CD102。 
用于所述染色体荧光原位杂交的荧光标记的探针或探针组合群可特异性地识别人或动物的任何一个或多个染色体。 
在优选实施例中，所述体液中的非血缘性有核细胞选自：人或动物的生物体液中具有上皮来源的任何实体瘤细胞(恶性上皮细胞)、或不具有上皮来源的任何肿瘤细胞，循环的血管内皮细胞，肿瘤干细胞。 
在优选实施例中，肿瘤细胞选自具有上皮来源的实体瘤细胞例如肺癌、宫颈癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮来源的肿瘤细胞，如黑色素瘤等。 
在优选实施例中，所述体液中的非血缘性有核(稀有)细胞选自：体液中具有上皮来源的任何实体瘤细胞、或不具有上皮来源的任何实体瘤细胞，循环的血管内皮细胞，肿瘤干细胞，干细胞，以及免疫细胞。 
名词解释 
人生物体液中的血缘性有核细胞：指白细胞，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞等)；嗜中性粒细胞；嗜酸性粒细胞；嗜碱性粒细胞等。 
生物体液：包括但不限于胸水或胸腔积液，腹水或腹腔积液，脑脊液，淋巴液及/或血液等。 
人或动物生物体液中的非血缘性有核细胞：主要指在人或动物的生物体液中具有上皮来源的或不具有上皮来源的肿瘤细胞和循环的血管内皮细胞；肿瘤干细胞，干细胞，血中胎儿细胞，某些免疫细胞等稀有细胞。 
本发明主要用于从人或动物生物体液中将人的生物体液中的红细胞与恶性上皮细胞及其它有核细胞进行快速有效的分离，并使用同步免疫-荧光原位杂交技术将抗人或动物白细胞表面抗原的免疫荧光抗体染色与FISH相结合，以用于快速、准确地鉴别从人或动物生物体液中富集的非血缘性有核细胞，如肿瘤细胞等。 
采用本发明用于富集生物体液样品中非血缘性有核细胞的方法的主要步骤包括： 
离心以收集或去除血浆蛋白； 
将血液置于细胞分离介质顶层进行离心 
取上清，加抗白细胞抗体偶联的免疫磁珠孵育后吸附磁珠 
离心，取富集的细胞沉淀。 
将该富集的细胞沉淀涂片用于后续的鉴别。 
本发明的鉴别从生物体液中富集的非血缘性有核细胞，如肿瘤细胞的方法包括： 
同步FISH+抗人或动物白细胞抗体染色， 
其中特殊单克隆抗体指的是抗下述人或动物任意一个或几个CD的抗体组合：CD3、CD31、CD34、CD45、CD50，CD69、CD84、或CD102； 
在本发明的组合物中，细胞分离介质的比重为1.07156～1.07738克/毫升(gr/ml或gr/cm3)。所述细胞分离介质包含选自下列试剂中的任意一种或任意两种以上的成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅(polyvinylpyrrolidine coated colloidal silica)；多聚糖(polysucrose)；泛影酸钠(sodium diatrizoate)或其衍生物；由蔗糖和表氯醇构成的非离子聚合物；或任何一种含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖；碘化小分子化合物，如甲泛影酰胺(metrizamide)；或任意蛋白溶液。细胞分离介质的比重可用任何渗透压介于260～320mOsm/kg H2O、pH 6.8～7.8的缓冲液调制而成。 
实施例 
利用本发明从病人生物体液(血液或胸水等)中快速富集并鉴别非血缘性恶性上皮细胞 
将采集的7.5毫升抗凝血室温离心5分钟(700xg)。去掉上清血浆后，将血液加入到10毫升细胞分离介质顶层，室温离心5分钟(500xg)以分离红细胞。收集上层有核细胞，加入0.5毫升包被有人白细胞表面抗原的单克隆抗体的磁珠后室温孵育60分钟。使用磁力架去除磁珠。收集上清去，室温离心3分钟(1200xg)。得到的沉积细胞即富集的非血缘性有核细胞涂片。后续鉴定实验使用CEP-7，CEP-8人染色体探针+抗人白细胞抗体进行同步染色。FISH信号异常但抗人白细胞抗体染色不着色的细胞可判断为体液中非血源性恶性肿瘤细胞。 
具体地，在本发明的组合物中，所述独特的细胞分离介质在20℃温度下比重范围优选介于1.07260～1.07650克/毫升(gr/ml或gr/cm3)，这一特定范围内的密度适于将几乎所有有核细胞与红细胞及免疫微球或免疫颗粒进行分离。 
所述细胞分离介质包含下列任何一种或任意两种或两种以上的试剂成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅；多聚糖；泛影酸钠或其衍生物；由蔗糖和表氯醇构成的非离子聚合物；或任何一种含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖；碘化小分子化合物(如甲泛影酰胺(metrizamide)；或任意蛋白溶液。所述细胞分离介质的比重可用任何渗透压介于285～315mOsm/kg H2O、pH 6.8～7.8的缓冲液在20℃温度下调制在1.07260～1.07650克/毫升范围内。所述免疫微球或免疫颗粒的比重高于所述细胞分离介质的比重。基于所述细胞分离介质的离心在普通的商品化的离心管内进行。 
在本发明中，用于抗人或动物白细胞抗体染色的单克隆抗体可特异性地识别下述但不局限于这些白细胞表面标示物中的一种或多种：CD3，CD31，CD34，CD45，CD50，CD69，CD84，或CD102等。 
本领域的技术人员应当明了，上述优选实施例只是对本发明的具体说明，并不构成对本发明的限制。根据需要可以对其进行多种改进，组合，亚组合以及变换，所有的改进，组合，亚组合、变换以及等效替换都落入在所附的权利要求的范围内。 

Claims (10)

1.一种从人或动物的生物体液中富集非血源性有核细胞并对其进行鉴别的方法，其中所述方法无需融破裂解红细胞的步骤，所述方法包括： 
离心以去除血浆蛋白； 
将离心后的上清液置于细胞分离介质顶层再次进行离心， 
取上清液，加入抗白细胞抗体偶联的免疫磁珠进行孵育后吸附磁珠， 
离心，取富集的细胞沉淀， 
其中对该富集的细胞沉淀同步实施抗人或动物白细胞抗体免疫荧光染色以及染色体荧光原位杂交来区别血源性有核细胞。 
2.根据权利要求1所述的方法，其中用于所述免疫荧光染色的抗人或动物白细胞抗体特异性地识别下述人或动物的白细胞表面标示物的一种或多种的抗原：CD3、CD31、CD34、CD45、CD50、CD69、CD84、或CD102。 
3.根据权利要求1所述的方法，其中用于所述染色体荧光原位杂交的荧光标记的探针或探针组合群可特异性地识别人或动物的任何一个或多个染色体。 
4.根据权利要求1所述的方法，其中无需融破裂解红细胞的步骤，利用一种细胞分离介质来进行分离，所述细胞分离介质在20℃下的比重为1.07156～1.07738克/毫升，所述细胞分离介质包含选自下列试剂中的任意一种或任意两种以上的成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅(polyvinylpyrrolidine coated colloidal silica)；由蔗糖和 表氯醇构成的非离子聚合物；或任何一种含糖的溶液；碘化小分子化合物或任意蛋白溶液。 
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述任一种含糖的溶液为右旋糖苷溶液、蔗糖溶液或聚蔗糖溶液。 
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述碘化小分子化合物为甲泛影酰胺(metrizamide)或泛影酸钠(sodium diatrizoate)。 
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，人或动物的生物体液包括胸腔积液、腹腔积液、脑脊液、淋巴液和/或血液。 
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述人或动物生物体液内的非血源性有核细胞选自由以下组成的组：具有上皮来源的任何实体瘤细胞、不具有上皮来源的任何肿瘤细胞、循环的血管内皮细胞和肿瘤干细胞。 
9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述非血源性有核细胞来自人或动物的具有上皮来源的实体瘤细胞，所述实体瘤包括胰腺癌、肺癌、宫颈癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、肝癌；或不具有上皮来源的肿瘤细胞，所述肿瘤为黑色素瘤。 
10.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述非血源性有核细胞包括肿瘤细胞和血管内皮细胞。 
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