CN111487404B - 体液肿瘤细胞dna提取试剂盒 - Google Patents

体液肿瘤细胞dna提取试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN111487404B
CN111487404B CN201910079939.4A CN201910079939A CN111487404B CN 111487404 B CN111487404 B CN 111487404B CN 201910079939 A CN201910079939 A CN 201910079939A CN 111487404 B CN111487404 B CN 111487404B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
dna
body fluid
tumor cells
washing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910079939.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111487404A (zh
Inventor
梁晓飞
宋萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lieyuan Shanghai Biomedical Technology Co ltd
Original Assignee
Lieyuan Shanghai Biomedical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lieyuan Shanghai Biomedical Technology Co ltd filed Critical Lieyuan Shanghai Biomedical Technology Co ltd
Priority to CN201910079939.4A priority Critical patent/CN111487404B/zh
Publication of CN111487404A publication Critical patent/CN111487404A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111487404B publication Critical patent/CN111487404B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒，用于提取已经脱离实体瘤进入体液的肿瘤细胞的DNA，具有这样的特征，包括：特异性免疫磁珠，用于从体液中捕获体液肿瘤细胞；磁分离架，用于通过磁力吸引特异性免疫磁珠；裂解液，用于对被捕获的体液肿瘤细胞进行细胞裂解；第一洗涤液，用于对经过裂解的体液肿瘤细胞进行第一次洗涤；第二洗涤液，用于对经过第一次洗涤的体液肿瘤细胞进行第二次洗涤；以及洗脱液，其中，特异性免疫磁珠为经过上皮细胞黏附分子修饰的磁性纳米微球。

Description

体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术与生物医学领域，具体涉及一种体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒。
背景技术
DNA，中文译名为脱氧核糖核酸，是染色体的主要组成成分。DNA是最重要的生物信息分子，可组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作，主要功能是贮存决定物种性状的几乎所有蛋白质和RNA分子的全部遗传信息；编码和设计生物有机体在一定的时空中有序地转录基因和表达蛋白完成定向发育的所有程序；初步确定了生物独有的性状和个性以及和环境相互作用时所有的应激反应。除了在生物体正常的生长、发育和繁殖等生命活动中具有十分重要的作用外，它与生命的异常情况，如肿瘤发生、放射损伤、遗传疾病等也有密切关系。然而无论是进行DNA结构与功能的研究，还是进行基因工程、蛋白质工程等的研究，首先都需要对其进行提取，因而DNA的提取是分子生物学下游实验和核酸水平临床检测的重要前提。
体液中的肿瘤细胞，简称体液肿瘤细胞，通常是指因自发或诊疗操作引起的从原发灶或转移灶侵入人体液的肿瘤细胞，其中的体液包括液、尿液、唾液、胸腹水、痰液以及脑脊液等。体液肿瘤细胞一般以单细胞或者细胞团的形式存在于循环系统中。大部分侵入循环系统的肿瘤细胞会在短期内死亡，只有极少数具有高度转移倾向和活力的肿瘤细胞才能存活下来，相互聚集成团，并在一定条件下发展为转移灶。肿瘤患者的体液中的肿瘤细胞浓度很低，在肿瘤诊断、预后评估及病情随访中均具有广泛的临床价值。所有的生命信息均可以从DNA中发现，包括与疾病密切相关的基因表达、基因突变等问题，从基因水平分析可以早发现、早诊断所有疾病的发生，在分子遗传学和临床检测中DNA检查已有逐步取代血清学检查(ELISA检测)，而从实体瘤中脱落下来的体液肿瘤细胞中能够获取更多的基因变异信息，且更精准，更全面、检出效果更好。
但是，由于体液中的肿瘤细胞的浓度很低，提取体液肿瘤细胞的DNA非常困难。即使勉强用试剂盒去提取，得到的DNA也主要包括正常细胞的DNA，这给后续专门进行体液肿瘤细胞的DNA分析带来很大困难。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒。
本发明提供了一种体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒，用于提取已经脱离实体瘤进入体液的肿瘤细胞的DNA，具有这样的特征，包括：特异性免疫磁珠，用于从体液中捕获体液肿瘤细胞；磁分离架，用于通过磁力吸引特异性免疫磁珠；裂解液，用于对被捕获的体液肿瘤细胞进行细胞裂解；第一洗涤液，用于对经过裂解的体液肿瘤细胞进行第一次洗涤；第二洗涤液，用于对经过第一次洗涤的体液肿瘤细胞进行第二次洗涤；以及洗脱液，其中，特异性免疫磁珠为经过上皮细胞黏附分子修饰的磁性纳米微球。
在本发明提供的体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒中，还可以具有这样的特征：其中，特异性免疫磁珠的制备过程为：步骤一，按二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵：胆固醇＝1:1的质量比，将二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵和胆固醇进行混合，得到第一混合物；步骤二，按去乙醇后的磁珠溶液：CH2Cl2＝1：1～1：5的体积比，将去乙醇后的磁珠溶液溶解于CH2Cl2，得到第一溶液；步骤三，按第一溶液：第一混合物＝1：5～1：10的体积质量比，将第一溶液和第一混合物进行混合，得到第二溶液；步骤四，按二油酰磷脂酰胆碱溶液：羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液：第二溶液＝1：1：5～1：1：12的体积比，将二油酰磷脂酰胆碱溶液、羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液以及第二溶液进行混合，得到第三溶液；步骤五，将第三溶液进行室温超声后除去残留的CH2Cl2，得到第四溶液；步骤六，按照上皮细胞黏附分子：第四溶液＝5：100～7：100的质量体积比，将上皮细胞黏附分子和第四溶液进行混合，得到特异性免疫磁珠。
在本发明提供的体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒中，还可以具有这样的特征：其中，特异性免疫磁珠还经过表皮生长因子受体抗体以及波形蛋白修饰。
在本发明提供的体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒中，还可以具有这样的特征：其中，特异性免疫磁珠的制备过程为：步骤一，按二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵：胆固醇＝1:1的质量比，将二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵和胆固醇进行混合，得到第一混合物；步骤二，按去乙醇后的磁珠溶液：CH2Cl2＝1：1～1：5的体积比，将去乙醇后的磁珠溶液溶解于CH2Cl2，得到第一溶液；步骤三，按第一溶液：第一混合物＝1：5～1：10的体积质量比，将第一溶液和第一混合物进行混合，得到第二溶液；步骤四，按二油酰磷脂酰胆碱溶液：羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液：第二溶液＝1：1：5～1：1：12的体积比，将二油酰磷脂酰胆碱溶液、羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液以及第二溶液进行混合，得到第三溶液；步骤五，将第三溶液进行室温超声后除去残留的CH2Cl2，得到第四溶液；步骤六，按照上皮细胞黏附分子：表皮生长因子受体抗体：波形蛋白：第四溶液＝5：5：5：300～7：7：7：300的质量体积比，将上皮细胞黏附分子、表皮生长因子受体抗体、波形蛋白以及第四溶液进行混合，得到特异性免疫磁珠。
在本发明提供的体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒中，还可以具有这样的特征：其中，体液包括血液、尿液、唾液、胸腹水、痰液以及脑脊液。
在本发明提供的体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒中，还可以具有这样的特征：其中，裂解液包含0.8mol/L～1mol/LNaCl、质量与体积比为0.4g/mL～0.5g/mL的十二烷基硫酸钠、0.8mol/L～1mol/L乙二胺四乙酸钠以及0.8mol/L～1mol/L三羟甲基氨基甲烷，裂解液的PH为7.0～7.25。
在本发明提供的体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒中，还可以具有这样的特征：其中，第一洗涤液包含质量与体积比为0.4g/mL～0.5g/mL的十二烷基硫酸钠、0.8mol/L～1mol/LNaCl以及无水乙醇，第二洗涤液包含体积比为80％的乙醇，洗脱液包含0.8mol/L～1mol/L乙二胺四乙酸钠和0.8mol/L～1mol/L三羟甲基氨基甲烷。
在本发明提供的体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒中，还可以具有这样的特征，还包括：DNA吸附柱；以及DNA保存管，其中，DNA保存管保存管为无菌且无DNase的1.5mL EP管。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒，因为包括特异性免疫磁珠、磁分离架、裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液、洗脱液、DNA吸附柱以及DNA保存管，特异性免疫磁珠为经过上皮细胞黏附分子修饰的磁性纳米微球，因此，能够通过特异性免疫磁珠来对癌症患者体液中的肿瘤细胞进行捕获，然后通过磁分离架将肿瘤细胞-磁珠分离出来，再通过裂解液、洗涤液以及洗脱液的依次处理从肿瘤细胞-磁珠中将肿瘤细胞(体液肿瘤细胞)内的DNA提取出来。通过本发明所提供的试剂盒能够针对性地提取体液肿瘤细胞的DNA，排除了其它正常细胞DNA的干扰，可用于PCR扩增、基因表达、基因测序、芯片检测、文库构建、高通量测序等科研或临床诊断分析，使得后续的检测结果更精准，检出效果更好。
此外，特异性免疫磁珠为经过上皮细胞黏附分子修饰的磁性纳米微球，它对体液肿瘤细胞的捕获能力强，对细胞的毒性较低。
附图说明
图1是本发明的实施例五中体液肿瘤细胞DNA提取方法的流程图；以及
图2是本发明的实施例七中琼脂糖凝胶电泳的结果图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒作具体阐述。
<实施例一>
本实施例提供了一种特异性免疫磁珠及其制备方法。
本实施例中的特异性免疫磁珠为经过上皮细胞黏附分子(EpCAM)修饰的磁性纳米微球。
本实施例中的特异性免疫磁珠的制备过程为：
步骤S1-1，称取二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵(GHDC)、胆固醇各10mg，将GHDC和胆固醇进行混合，得到第一混合物，并将该第一混合物加入到磨口梨形瓶中。
步骤S1-2，量取1.0mL去乙醇后的磁珠溶液溶解于2.0mL CH2Cl2中，得到第一溶液。
步骤S1-3，将第一溶液倒入磨口梨形瓶中使得第一溶液和第一混合物混合，得到第二溶液。此时，第二溶液：混合物＝3：20的体积质量比。
步骤S1-4，用移液管称取200μL 10mg/mL的二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)溶液、200μL10mg/mL的羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐(HQCMC)溶液加入到第二溶液中，混匀，得到第三溶液。此时，DOPC溶液：HQCMC溶液：第二溶液＝1：1：7.5的体积比。
其中，HQCMC溶液的HQCMC的制备过程为：按环氧十六季铵盐：羧甲基壳聚糖＝30:1的质量比，将环氧十六季铵盐和羧甲基壳聚糖共溶于dd H2O中，同时加入与dd H2O等体积的异丙醇，50℃～55℃搅拌过夜，然后用分子量为10000道尔顿的透析袋透析24h，透析过程中每间隔两个小时换一次dd H2O，完成透析后再进行冻干，即得到HQCMC。HQCMC溶液为HQCMC的水溶液。
步骤S1-5，将盛装第三溶液的梨形瓶放入超声波细胞粉碎仪中，启动仪器，超声参数为：功率27％，超声2s，间隔1s，总时间6min，温度25℃，在超声1min后暂停并快速加入6mLdd H2O，继续超声至结束，超声完成后旋蒸除去残留的CH2Cl2，得到第四溶液；
步骤S1-6，按照EpCAM：第四溶液＝5：100～7：100的质量体积比，将EpCAM和第四溶液进行混合，涡旋振荡8小时使其充分混合，得到EpCAM免疫磁球。优选地，按照EpCAM：第四溶液＝6：100的质量体积比(即EpCAM：第四溶液＝60μg：1mL)，将EpCAM和第四溶液进行混合。
<实施例二>
本实施例提供了一种特异性免疫磁珠及其制备方法。
本实施例中的特异性免疫磁珠为经过上皮细胞黏附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体抗体(EGFR)以及波形蛋白(Vimentin)共同修饰的磁性纳米微球。
本实施例中的特异性免疫磁珠的制备过程为：
步骤S2-1，称取二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵(GHDC)、胆固醇各10mg，将GHDC和胆固醇进行混合，得到第一混合物，并将该第一混合物加入到磨口梨形瓶中。
步骤S2-2，量取1.0mL去乙醇后的磁珠溶液溶解于2.0mL CH2Cl2中，得到第一溶液。
步骤S2-3，将第一溶液倒入磨口梨形瓶中使得第一溶液和第一混合物混合，得到第二溶液。此时，第二溶液：混合物＝3：20的体积质量比。
步骤S2-4，用移液管称取200uL 10mg/mL的二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)溶液、200uL10mg/mL的羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐(HQCMC)溶液加入到第二溶液中，混匀，得到第三溶液。此时，DOPC溶液：HQCMC溶液：第二溶液＝1：1：7.5的体积比。
其中，HQCMC溶液的HQCMC的制备过程为：按环氧十六季铵盐：羧甲基壳聚糖＝30:1的质量比，将环氧十六季铵盐和羧甲基壳聚糖共溶于dd H2O中，同时加入与dd H2O等体积的异丙醇，50℃～55℃搅拌过夜，然后用分子量为10000道尔顿的透析袋透析24h，透析过程中每间隔两个小时换一次dd H2O，完成透析后再进行冻干，即得到HQCMC。HQCMC溶液为HQCMC的水溶液。
步骤S2-5，将盛装第三溶液的梨形瓶放入超声波细胞粉碎仪中，启动仪器，超声参数为：功率27％，超声2s，间隔1s，总时间6min，温度25℃，在超声1min后暂停并快速加入6mLdd H2O，继续超声至结束，超声完成后旋蒸除去残留的CH2Cl2，得到第四溶液；
步骤S2-6，按照EpCAM：EGFR：Vimentin：第四溶液＝5：5：5：300～7：7：7：300的质量体积比，将EpCAM、EGFR、Vimentin以及第四溶液进行混合，涡旋振荡8小时使其充分混合，得到EpCAM/EGFR/Vimentin免疫磁球。其中，EpCAM、EGFR以及Vimentin按质量计算，而第四溶液按体积计算。优选地，按照EpCAM：EGFR：Vimentin：第四溶液＝6：6：6：300的质量体积比(即EpCAM：EGFR：Vimentin：第四溶液＝＝60μg：60μg：60μg：3mL)，将EpCAM和第四溶液进行混合。
<实施例三>
本实施例提供了一种体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒。
本实施例中的体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒用于提取已经脱离实体瘤进入体液的肿瘤细胞的DNA，包括特异性免疫磁珠、磁分离架、裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液、洗脱液、DNA吸附柱以及DNA保存管。
本实施例中的特异性免疫磁珠为按照实施例一中的方法所制备的EpCAM免疫磁球。
磁分离架采用塑料材料经过注塑工艺制成，且内含永久磁铁。在使用时，磁分离架能够通过磁铁对磁珠的吸引作用从而对特异性免疫磁珠以及其它溶液(例如体液)进行磁分离。
裂解液用于对被捕获的体液肿瘤细胞进行细胞裂解，包含1mol/LNaCl、质量与体积比为0.5g/mL的十二烷基硫酸钠、1mol/L乙二胺四乙酸钠以及1mol/L三羟甲基氨基甲烷。
裂解液的制备过程为：
步骤S3-1，取58.5g NaCl溶于800mL ddH2O中，用ddH2O定容至1L，在121℃、100千帕压强下高温灭菌20min，配制成1mol/L NaCl。
步骤S3-2，取500g十二烷基硫酸钠(SDS)溶于800mL灭菌后的ddH2O中，60℃下搅拌至完全溶解，用灭菌水定容至1L，配制成0.5g/mL的十二烷基硫酸钠(SDS)。
步骤S3-3，取186.1g乙二胺四乙酸钠(EDTA)溶于400mL ddH2O中，磁力搅拌助溶，加入NaOH调节PH至PH为7.0～7.25，用ddH2O定容至1L，在121℃、100千帕压强下高温灭菌20min，配制成1mol/L乙二胺四乙酸钠(EDTA)。
步骤S3-4，取121.1g Tris碱溶于800mL ddH2O中，用HCl调节PH为7.0～7.25，用ddH2O定容至1L，在121℃、100千帕压强下高温灭菌20min，配制成1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)。
步骤S3-5，分别取1mol/LNaCl 10mL、质量与体积比为0.5g/mL的SDS 50mL、1mol/LEDTA20mL、1mol/L Tris-HCl 10mL，用灭菌ddH2O定容至1L，摇匀后配制成含有1mol/LNaCl、质量与体积比为0.5g/mL的SDS、1mol/L EDTA、1mol/L Tris-HCl的裂解液。
第一洗涤液用于对经过裂解的体液肿瘤细胞进行第一次洗涤，包含质量与体积比为0.5g/mL的SDS、1mol/LNaCl以及无水乙醇。
第一洗涤液的制备过程为：
步骤S4-1，取500g SDS溶于800mL灭菌后的ddH2O中，60℃下搅拌至完全溶解，用灭菌水定容至1L，配制成0.5g/mL的SDS。
步骤S4-2，取58.5g NaCl溶于800mL ddH2O中，用ddH2O定容至1L，在121℃、100千帕压强下高温灭菌20min，配制成1mol/L NaCl。
步骤S4-3，分别取0.5g/mL的SDS 50mL、1mol/L的NaCl 10mL、用无水乙醇定容至1L，可制成含0.5g/mL的SDS、1mol/LNaCl以及无水乙醇的第一洗涤液。
第二洗涤液用于对经过第一次洗涤的体液肿瘤细胞进行第二次洗涤，包含体积比为80％的乙醇。第二洗涤液的制备过程为：取800mL无水乙醇，用灭菌后的ddH2O定容至1L。
洗脱液包含1mol/L EDTA和1mol/LTris-HCl。
洗脱液的制备过程为：
步骤S5-1，：取186.1g EDTA溶于400mL ddH2O中，磁力搅拌助溶，加入NaOH调节PH至PH为7.0～7.25，用ddH2O定容至1L，在121℃、100千帕压强下高温灭菌20min，配制成1mol/L EDTA。
步骤S5-2，取121.1g Tris碱溶于800mL ddH2O中，用HCl调节PH为7.0～7.25，用ddH2O定容至1L，在121℃、100千帕压强下高温灭菌20min，配制成1mol/LTris-HCl。
步骤S5-3，分别取1mol/L EDTA 5mL、1mol/L Tris-HCl 10mL、用灭菌的ddH2O定容至1L，可配制成含1mol/L EDTA和1mol/L Tris-HCl的洗脱液。
DNA吸附柱为微流体兼容色谱柱，可装入1.5mL及2mL EP管中。
DNA保存管为无菌且无DNase的1.5mL EP管。
本实施例中的体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒可用于2mL体液中的DNA提取，并可组成50次、100次、200次、500次等的DNA提取试剂盒，4℃冰箱保存，有效期为1年。
其中，体液可以为血液、尿液、唾液、胸腹水、痰液以及脑脊液等。
<实施例四>
本实施例提供了一种体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒。
本实施例中的体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒用于提取已经脱离实体瘤进入体液的肿瘤细胞的DNA，包括特异性免疫磁珠、磁分离架、裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液、洗脱液、DNA吸附柱以及DNA保存管。
本实施例中的特异性免疫磁珠为按照实施例二中的方法所制备的EpCAM/EGFR/Vimentin免疫磁球。
本实施例中的磁分离架、裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液、洗脱液、DNA吸附柱以及DNA保存管与实施例三中的完全相同。
本实施例中的体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒也可用于2mL体液中的DNA提取，并可组成50次、100次、200次、500次等的DNA提取试剂盒，4℃冰箱保存，有效期为1年。
其中，体液可以为血液、尿液、唾液、胸腹水、痰液以及脑脊液等。
<实施例五>
本实施例提供了一种利用实施例四中的体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒来对体液肿瘤细胞的DNA进行提取的方法。
图1是本发明的实施例五中体液肿瘤细胞DNA提取方法的流程图。
如图1所示，本实施例中的体液肿瘤细胞DNA提取方法包括以下步骤：
步骤S6-1，体液肿瘤细胞的捕获。即，按体液样品：特异性免疫磁珠＝100：1的体积比，向体液样品中加入特异性免疫磁珠捕获30min，并每隔5min手动振荡混匀，之后放在磁分离架上分离15min，吸弃废液并取下EP管。此时EP管内包含特异性免疫磁珠以及被特异性免疫磁珠所捕获的体液肿瘤细胞。然后进入步骤S6-2。
其中，体液样品为癌症患者的体液，该体液可以为血液、尿液、唾液、胸腹水、痰液以及脑脊液等的任意一种。
并且，如果体液为除血液以外的其它液体，则该体液可以直接作为体液样品进行本步骤的处理。例如，该体液为尿液，则可以直接向尿液样本中加入特异性免疫磁珠。
如果体液为血液，那么体液样品必须是血液经过离心后的上清液。此时，体液样品与特异性免疫磁珠之间的比例关系仍按照血液的体积进行计算，而不按照离心后的上清液的体积进行计算。
在本实施例中，体液样品的体积为2mL，特异性免疫磁珠的体积为20μL。
步骤S6-2体液肿瘤细胞的洗涤。即，在取下的EP管中加入1mL PBS后轻轻吸打混匀，之后放在磁分离架上分离15min，吸弃废液并取下EP管。然后进入步骤S6-3。
步骤S6-3，体液肿瘤细胞裂解。即，在取下的EP管中加入500μL裂解液，用涡旋振荡器高速振荡20s，得到裂解产物。然后进入步骤S6-4。
步骤S6-4，DNA结合。即，将DNA吸附柱装入另一个2mL EP管中，并将裂解产物全部转移至DNA吸附柱内，然后12000rpm高速离心1min，弃掉离心后EP管中的废液。然后进入步骤S6-5。
步骤S6-5，DNA洗涤。即，在DNA吸附柱中加入400μL～500μL第一洗涤液，12000rpm高速离心1min，弃掉离心后EP管中的废液；然后再向DNA吸附柱中加入400μL～500μL第二洗涤液，12000
rpm高速离心1min，将DNA吸附柱转移至DNA保存管中，打开盖子放置在超洁净台开风机放置使洗涤液B风干。然后进入步骤S6-6。
步骤S6-6，DNA洗脱。即，向风干后的DNA吸附柱中加入20μL～100μL洗脱液，室温放置至DNA完全溶解，然后在12000rpm高速离心1min，即可得到体液肿瘤细胞的DNA，后置于-20℃保存备用。
根据本实施中的方法所提取的DNA可用于PCR扩增、基因表达、基因测序、芯片检测、文库构建、高通量测序等科研或临床诊断分析上的应用。
<实施例六>
本实施例为利用实施例四中的体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒并按照实施例五中的体液肿瘤细胞DNA提取方法来提取肺癌患者外周血中的肿瘤细胞的DNA。
具体实验过程如下：
首先，用医用抗凝采血管分别采集7位肺癌患者外周血7.5mL，抗凝剂为EDTA·K2(样本采集单位有科研合作项目，经医院伦理委员会同意，并与患者签署知情同意书)。
然后，每份血样进行如下处理：
先取2mL血液进行800rpm低速离心3min，取上清液置于2mL EP管中，加入20μL特异性免疫磁珠孵育捕获30min，并隔5min手动振荡混匀，之后放在磁分离架上分离15min，吸弃废液并取下EP管；在取下的EP管中加入1mLPBS后轻轻吸打混匀，之后放在磁分离架上分离15min，吸弃废液并取下EP管；在取下的EP管中加入500μL裂解液，用涡旋振荡器高速振荡20s；将DNA吸附柱装入另一个2mL EP管中，并将裂解产物全部转移至DNA吸附柱，然后12000rpm高速离心1min，弃掉离心后EP管中的废液；在DNA吸附柱中加入第一洗涤液，12000rpm高速离心1min，弃掉离心后EP管中的废液；然后再向DNA吸附柱中加入第二洗涤液，12000rpm高速离心1min，将DNA吸附柱转移至DNA保存管中，打开盖子放置在超洁净台开风机放置使洗涤液B风干；向风干后的DNA吸附柱中加入20μL洗脱液，室温放置至DNA完全溶解，然后在12000rpm高速离心1min，即可得到血液中的肿瘤细胞的DNA，也就是体液肿瘤细胞DNA。
<实施例七>
本实施例为采用1％的琼脂糖凝胶电泳来对实施例六所提取的DNA进行纯度检测实验。
具体实验过程如下：
取20mL(50×TAE)用ddH2O定容到1L，配制成TAE缓冲液；称取琼脂糖1g，加入100mlTAE缓冲液于锥形瓶中，放入微波炉(中火2min)，拿出稍冷，加入一定量溴化乙锭(EB)溶液(琼脂糖溶液：EB溶液1:10000)，将溶液倒入定型槽中，成胶后取出放入电泳槽；加样：取10×Loading Buffer 1μL，加入DNA样品9μL混合后加入胶孔内，同时加入标准品marker，设置电泳条件为电压120V，电泳25min，电泳结果用凝胶成像系统观察拍照，结果如图2所示。
图2是本发明的实施例七中琼脂糖凝胶电泳的结果图。
如图2所示，图中1～7分别为1组DNA样品，M为标准品marker，从图中可以看出，实施例六所提取的7组DNA均为单一条带，没有发生拖尾现象，也没有杂带，表面提取的DNA较纯且无污染。
<实施例八>
本实施例为对实施例六所提取的DNA进行定量检测实验。
具体实验过程如下：
取实施例六中提取的7组DNA样品各1μL，用Invitrogen QubitTM 4 Fluorometer荧光计检测DNA浓度，计算提取的DNA含量，实验结果见表1。
表1：血液DNA定量检测实验结果表
<实施例九>
本实施例为对实施例六所提取的DNA与采用TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，天根公司)所提取的DNA进行浓度对比实验。
具体实验过程如下：
首先，对实施例六所采集的7位肺癌患者外周血采用TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，天根公司)提取血液DNA。即，对每份血样进行如下处理：取2mL血液样本加入15mL EP管中，再加入4mL细胞裂解液CL，颠倒混匀，10000rpm离心1min，吸弃上清，留下细胞核沉淀，向离心收集到的细胞核沉淀中加200μL缓冲液GS，振荡至彻底混匀；加入20μL Proteinase K溶液，混匀；加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮；加200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；重复上一操作步骤；12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20μL洗脱缓冲液TB，室温放置2min～5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，得到提取的DNA溶液。
然后，实施例六所提取的DNA与采用TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，天根公司)所提取的DNA各取1μL，通过Invitrogen QubitTM 4Fluorometer荧光计检测DNA浓度，计算提取的DNA含量，结果见表2。
表2：体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒与TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，天根公司)提取的DNA浓度对比表
从表2中可以看出，通过本发明的体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒及提取方法比TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒及提取方法所提取出来的DNA浓度略低，原因是TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒是将全血中的所有细胞裂解提取DNA，而本发明所提取的DNA是已经脱离实体瘤进入外周血中的肿瘤细胞的DNA，
虽然上述两种试剂盒所提取的DNA浓度相差不大，都可以满足下游的实验，但本发明的体液肿瘤细胞DNA试剂盒所提取的DNA是已经脱离实体瘤进入外周血中的肿瘤细胞的DNA，排除了正常细胞DNA的干扰，而针对性地从实体瘤中脱落下来发生病变的肿瘤细胞DNA中能够获取更多的基因变异信息，且更精准，更全面、检出效果更好。
<实施例十>
本实施例为利用实施例四中的体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒并按照实施例五中的体液肿瘤细胞DNA提取方法来提取胃癌患者尿液中的肿瘤细胞的DNA。
具体实验过程如下：
首先，用尿液采集管采集3位胃癌患者尿液5mL(样本采集单位有科研合作项目，经医院伦理委员会同意，并与患者签署知情同意书)。
然后，每份尿样进行如下处理：
先取2mL尿液置于2mL EP管中，加入20μL特异性免疫磁珠孵育捕获30min，并隔5min手动振荡混匀，之后放在磁分离架上分离15min，吸弃废液并取下EP管；在取下的EP管中加入1mL PBS后轻轻吸打混匀，之后放在磁分离架上分离15min，吸弃废液并取下EP管；在取下的EP管中加入500μL裂解液，用涡旋振荡器高速振荡20s；将DNA吸附柱装入另一个2mLEP管中，并将裂解产物全部转移至DNA吸附柱，然后12000rpm高速离心1min，弃掉离心后EP管中的废液；在DNA吸附柱中加入第一洗涤液，12000rpm高速离心1min，弃掉离心后EP管中的废液；然后再向DNA吸附柱中加入第二洗涤液，12000rpm高速离心1min，将DNA吸附柱转移至DNA保存管中，打开盖子放置在超洁净台开风机放置使洗涤液B风干；向风干后的DNA吸附柱中加入20μL洗脱液，室温放置至DNA完全溶解，然后在12000rpm高速离心1min，即可得到尿液中的肿瘤细胞的DNA，也就是体液肿瘤细胞DNA。
<实施例十一>
本实施例为对实施例十所提取的DNA进行定量检测实验。
具体实验过程如下：
取实施例十中提取的3组DNA样品各1μL，用Invitrogen Qubit TM 4 Fluorometer荧光计检测DNA浓度，计算提取的DNA含量，实验结果见表3。
表3：尿液DNA定量检测实验结果表
实验结果表明，本发明的体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒能够从胃癌患者尿液中提肿瘤细胞DNA，所获DNA浓度可满足于PCR扩增、基因表达、基因测序、芯片检测、文库构建、高通量测序等实验要求。
实施例的作用与效果
根据实施例三所涉及的体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒，因为包括特异性免疫磁珠、磁分离架、裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液、洗脱液、DNA吸附柱以及DNA保存管，特异性免疫磁珠为经过上皮细胞黏附分子修饰的磁性纳米微球，因此，能够通过特异性免疫磁珠来对癌症患者体液中的肿瘤细胞进行捕获，然后通过磁分离架将肿瘤细胞-磁珠分离出来，再通过裂解液、洗涤液以及洗脱液的依次处理从肿瘤细胞-磁珠中将肿瘤细胞(体液肿瘤细胞)内的DNA提取出来。通过本发明所提供的试剂盒能够针对性地提取体液肿瘤细胞的DNA，排除了其它正常细胞DNA的干扰，可用于PCR扩增、基因表达、基因测序、芯片检测、文库构建、高通量测序等科研或临床诊断分析，使得后续的检测结果更精准，检出效果更好。
此外，实施例三中的特异性免疫磁珠为经过上皮细胞黏附分子修饰的磁性纳米微球，它对体液肿瘤细胞的捕获能力强，对细胞的毒性较低。
进一步地，实施例四中的特异性免疫磁珠为经过上皮细胞黏附分子、表皮生长因子受体抗体以及波形蛋白修饰的磁性纳米微球，因此具有更高的对体液肿瘤细胞的捕获能力。
进一步地，实施例一和实施例二中制备特异性免疫磁珠的过程都是通过将乳化剂二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵与链接分子的骨架材料胆固醇与磁珠溶液混合，然后加入基质材料二油酰磷脂酰胆碱溶液以及表面活性剂羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液进行室温超声，最后加入对应的抗体从而制备而成的，因此，所制备的特异性免疫磁珠能够对体液中的肿瘤细胞进行特异性靶向快速分离从而肿瘤细胞。并且，由于对应的抗体是最后添加进去的，避免了提前添加抗体后的后续步骤对抗体的活性产生不利的影响使其活力降低从而影响所制备的特异性免疫磁珠对体液肿瘤细胞的捕获效率的问题，因此，特异性免疫磁珠具有高活性、高纯度且能够强特异性、高灵敏度、最大程度上捕获受检者体液中的肿瘤细胞，尽可能减少肿瘤细胞漏捕。此外，整个特异性免疫磁珠的制备过程在室温条件下即可完成，制备工艺简单，生产成本较低。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

Claims (4)

1.特异性免疫磁珠在制备一种体液肿瘤细胞DNA提取试剂盒中的应用，其特征在于，用于提取已经脱离实体瘤进入体液的肿瘤细胞的DNA，试剂盒包括：
特异性免疫磁珠，用于从所述体液中捕获所述体液肿瘤细胞；
磁分离架，用于通过磁力吸引所述特异性免疫磁珠；
裂解液，用于对被捕获的所述体液肿瘤细胞进行细胞裂解；
第一洗涤液，用于对经过裂解的所述体液肿瘤细胞进行第一次洗涤；
第二洗涤液，用于对经过第一次洗涤的所述体液肿瘤细胞进行第二次洗涤；
洗脱液；
DNA吸附柱；以及
DNA保存管；
其中，所述特异性免疫磁珠为经过上皮细胞黏附分子、表皮生长因子受体抗体以及波形蛋白修饰的磁性纳米微球；
所述特异性免疫磁珠的制备过程为：
步骤一，按二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵：胆固醇=1:1的质量比，将二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵和胆固醇进行混合，得到第一混合物；
步骤二，按去乙醇后的磁珠溶液：CH2Cl2=1：1~1：5的体积比，将去乙醇后的磁珠溶液溶解于CH2Cl2，得到第一溶液；
步骤三，按所述第一溶液：所述第一混合物=1：5~1：10的体积质量比，将所述第一溶液和所述第一混合物进行混合，得到第二溶液；
步骤四，按二油酰磷脂酰胆碱溶液：羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液=1：1的体积比，羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液：所述第二溶液=1：5~1：12的体积比，将二油酰磷脂酰胆碱溶液、羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液以及所述第二溶液进行混合，得到第三溶液；
步骤五，将所述第三溶液进行室温超声后除去残留的CH2Cl2，得到第四溶液；
步骤六，按照上皮细胞黏附分子：表皮生长因子受体抗体：波形蛋白：所述第四溶液=60μg：60μg：60μg：3mL的质量体积比，将上皮细胞黏附分子、表皮生长因子受体抗体、波形蛋白以及所述第四溶液进行混合，得到所述特异性免疫磁珠；
所述裂解液包含0.8mol/L~1mol/LNaCl、质量与体积比为0.4g/mL~0.5g/mL的十二烷基硫酸钠、0.8mol/L~1mol/L乙二胺四乙酸以及0.8mol/L~1mol/L三羟甲基氨基甲烷，所述裂解液的pH为7.0～7.25；
所述体液肿瘤细胞DNA提取方法包括以下步骤：
步骤1，体液肿瘤细胞的捕获，即向体液样品中加入特异性免疫磁珠捕获，振荡混匀后进行磁分离；
步骤2，体液肿瘤细胞的洗涤；
步骤3，体液肿瘤细胞的裂解，即加入裂解液并高速振荡得到裂解产品；
步骤4，DNA结合；
步骤5，DNA洗涤，即先后加入第一洗涤液、第二洗涤液进行洗涤；
步骤6，DNA洗脱。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述体液包括血液、尿液、唾液、胸腹水、痰液以及脑脊液。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述第一洗涤液包含质量与体积比为0.4g/mL~0.5g/mL的十二烷基硫酸钠、0.8mol/L~1mol/L NaCl以及无水乙醇；
所述第二洗涤液包含体积比为80%的乙醇；
所述洗脱液包含0.8mol/L~1mol/L乙二胺四乙酸和0.8mol/L~1mol/L三羟甲基氨基甲烷。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
所述DNA保存管为无菌且无DNase的1.5mL EP管。
CN201910079939.4A 2019-01-28 2019-01-28 体液肿瘤细胞dna提取试剂盒 Active CN111487404B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910079939.4A CN111487404B (zh) 2019-01-28 2019-01-28 体液肿瘤细胞dna提取试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910079939.4A CN111487404B (zh) 2019-01-28 2019-01-28 体液肿瘤细胞dna提取试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111487404A CN111487404A (zh) 2020-08-04
CN111487404B true CN111487404B (zh) 2024-01-05

Family

ID=71812253

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910079939.4A Active CN111487404B (zh) 2019-01-28 2019-01-28 体液肿瘤细胞dna提取试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111487404B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113667643A (zh) * 2021-07-25 2021-11-19 李国雷 一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合及制备方法
CN113720666A (zh) * 2021-09-01 2021-11-30 致慧医疗科技(上海)有限公司 人尿样分离癌细胞的分离方法
CN114276992A (zh) * 2021-12-14 2022-04-05 南通举健生物科技有限公司 一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法
CN114577746B (zh) * 2022-03-03 2022-11-25 云南大学 金掺杂共价有机框架材料及制备方法和应用、共价有机框架纳米酶生物探针及应用、试剂盒

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104956226A (zh) * 2013-01-25 2015-09-30 艾克斯赛尔生物科学公司 用于选择性富集靶细胞的方法、组合物、试剂盒及系统
CN106366197A (zh) * 2016-08-31 2017-02-01 上海美吉生物医药科技有限公司 一种HER2、EGFR、EpCAM、MUC1多重抗体免疫磁珠及其制备方法
CN106645726A (zh) * 2016-10-09 2017-05-10 天津普拉德生物科技有限公司 一种循环肿瘤细胞快速检测试剂盒及其制备和应用方法
CN108031442A (zh) * 2017-12-29 2018-05-15 猎源（上海）生物医药科技有限公司 一种纳米脂质磁球及其制备方法、分离提取游离dna的试剂盒及其应用
CN108342478A (zh) * 2018-01-18 2018-07-31 南方医科大学南方医院 循环肿瘤细胞代谢分型标志物及其应用
CN108351347A (zh) * 2015-09-22 2018-07-31 普渡研究基金会 稀有细胞的无离心机分离和检测
CN108795869A (zh) * 2018-06-28 2018-11-13 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种循环肿瘤细胞阳性富集方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103091491B (zh) * 2011-11-01 2015-01-07 李彦萍 鉴别从人或动物生物体液中富集的非血源性有核细胞的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104956226A (zh) * 2013-01-25 2015-09-30 艾克斯赛尔生物科学公司 用于选择性富集靶细胞的方法、组合物、试剂盒及系统
CN108351347A (zh) * 2015-09-22 2018-07-31 普渡研究基金会 稀有细胞的无离心机分离和检测
CN106366197A (zh) * 2016-08-31 2017-02-01 上海美吉生物医药科技有限公司 一种HER2、EGFR、EpCAM、MUC1多重抗体免疫磁珠及其制备方法
CN106645726A (zh) * 2016-10-09 2017-05-10 天津普拉德生物科技有限公司 一种循环肿瘤细胞快速检测试剂盒及其制备和应用方法
CN108031442A (zh) * 2017-12-29 2018-05-15 猎源（上海）生物医药科技有限公司 一种纳米脂质磁球及其制备方法、分离提取游离dna的试剂盒及其应用
CN108342478A (zh) * 2018-01-18 2018-07-31 南方医科大学南方医院 循环肿瘤细胞代谢分型标志物及其应用
CN108795869A (zh) * 2018-06-28 2018-11-13 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种循环肿瘤细胞阳性富集方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Construction of Epidermal Growth Factor Receptor Peptide Magnetic Nanovesicles with Lipid Bilayers for Enhanced Capture of Liver Cancer Circulating Tumor Cells;Jian Ding 等;《Analytical Chemistry》;第88卷(第18期);8997-9003 *
朱立平 等.免疫学常用实验方法.《免疫学常用实验方法》.人民军医出版社,2000,第293-298页. *
闫国超 等.《肿瘤疾病临床检验与诊断》.北京：科学技术文献出版社,2017,101-102. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111487404A (zh) 2020-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111487404B (zh) 体液肿瘤细胞dna提取试剂盒
CN104350152B (zh) 选择性核酸片段回收
KR101005924B1 (ko) 핵산 추출 장치
CN101935646B (zh) 一种从微量样品中提取dna的试剂盒及其方法
EP2315619B1 (en) Nucleic acid extraction method
CN107254430A (zh) 一种基于正电荷吸附分离外泌体的方法
CN114317762B (zh) 用于检测早期肝癌的三标记物组合物及其试剂盒
CN106845154B (zh) 一种用于ffpe样本拷贝数变异检测的装置
CN108929873A (zh) 一种特异性结合转移性胃癌细胞的核酸适配体及其应用
CN108796075A (zh) 检测circRNF13和LOC284454试剂的应用及试剂盒
Akutsu et al. Development of an integrated automation system with a magnetic bead‐mediated nucleic acid purification device for genetic analysis and gene manipulation
CN116116385B (zh) 一种血液中外泌体的提取及其蛋白质组学分析方法
CN112941067A (zh) 一种全血核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用
CN111484976A (zh) 肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测系统
CN109266653B (zh) 一种耐药异质性循环肿瘤细胞捕获与基因分析的试剂、装置和方法
CN111239271A (zh) 利用同位素标记技术定量微量生物样本蛋白质组的方法
US20220090166A1 (en) Preparation methods and apparatus adapted to filter small nucleic acids from biological samples
CN112195239B (zh) 一种食管鳞癌转移组织及血清外泌体标志物及其应用
CN109439655A (zh) 适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法
CN113106085B (zh) 核酸分离方法及核酸分离系统
CN105701364A (zh) 胸腔积液性质的鉴定方法
CN109337908A (zh) 一组特异性结合胶霉毒素的核酸适配体及其应用
CN109187405B (zh) 一种1-(3-氯苯基)-5-苯基-1h-三唑与血清作用的差异蛋白检测方法
CN109187403B (zh) 一种5-苯基-1-(对甲基苯基)-1h-三唑与血清作用的差异蛋白检测方法
CN112501163B (zh) 核酸的纯化方法及核酸纯化设备

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant