CN105701364A - 胸腔积液性质的鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

一种胸腔积液性质的鉴定方法，通过高通量测序技术对三种不同疾病来源胸腔积液中的细胞外囊泡总RNA进行分析处理，筛选得到三种标本的差异表达miRNA，据此可实现对胸腔积液性质的鉴定。利用靶基因功能预测深入研究这些差异表达的miRNA，进一步提示miRNA在胸腔积液鉴别中的作用，为胸腔积液及相关疾病的诊断提供新的方法及理论基础。本发明方法设计合理可行，能够有效的协助建立一种无创的精准的胸腔积液诊断方法，为临床诊治工作提供新的思路。

Description

胸腔积液性质的鉴定方法
技术领域
本发明涉及生物医学，尤其涉及一种胸腔积液性质的鉴定方法。
背景技术
胸腔积液简称胸水，是由于全身或局部病变导致胸膜腔内液体形成过快或吸收过缓而产生的，是胸膜疾病最常见的表现。按照不同疾病来源，可分为炎性、恶性和结核性三种胸腔积液，其在外观、成分、脱落细胞学及分子标志物等性质都存在差异，因此胸腔积液的鉴别对于辅助诊治临床疾病具有重要作用。随着医学影像技术、肿瘤标志物鉴定、免疫学鉴定及酶学鉴定等技术的改进和提高，三种胸腔积液性质的差异越来越被人们熟知和发现。胸腔积液产生的原因很多也很复杂，因此在很多情况下，单纯的从宏观表现很难鉴别胸腔积液的性质差异。因此本发明基于高通量测序技术，从微观上鉴定三种胸腔积液中细胞外囊泡miRNA的表达差异，为更好的鉴定胸腔积液性质及临床诊治打下新的基础。
细胞外囊泡是从细胞表面脱落或者细胞向外分泌释放的囊状小泡，直径大约为30nm-1000nm，存在于机体几乎所有的体液中，包括唾液、血液、尿液、胸腔积液等等。细胞外囊泡包括外泌体、微泡和凋亡小体等。最初囊泡被认为是机体组织和细胞外排的废弃物质，其生物学意义在很大程度上被人们忽视。随着近几年研究的深入，囊泡的成分和生物功能也越来越被人们发现和认可。研究表明，微泡中含有蛋白质、脂类和核酸等机体生物功能成分，包括囊泡来源细胞的蛋白质、酶、mRNA和miRNA等，并将这些物质通过相应方式转运至相关靶细胞中，在细胞间信息交流中发挥作用。研究发现人干细胞来源的微泡可以将人的mRNA转运到小鼠细胞中，并导致蛋白的翻译。同样，除了mRNA，囊泡也可以将包含的miRNA转运到靶细胞中，发挥相应作用。miRNA是一类由内源编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，在动植物中参与转录后基因表达的调控。miRNA本身不具有编码蛋白的功能，但研究发现在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异，这就提示miRNA在基因表达的调控中发挥重要作用。最近有研究显示，细胞外囊泡中可以高表达miRNA，并通过多种方式影响靶细胞的分化、增殖及免疫调节等功能。因此，通过高通量测序技术鉴定三种不同性质胸腔积液中细胞外囊泡miRNA的差异表达，发现特异表达或高表达的miRNA，为胸腔积液的鉴定和临床诊治提供新的理论基础，这将会是非常有意义的研究。
发明内容
本发明的目的，就是为了解决上述问题，提供一种新型的胸腔积液性质的鉴定方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种胸腔积液性质的鉴定方法，包括以下步骤：
A、采用超高速离心的方法提取三种不同疾病来源的胸腔积液标本细胞外囊泡；
B、利用Trizol法提取标本细胞外囊泡总RNA；
C、构建cDNA测序文库，主要步骤包括3’端、5’端的连接，第一链cDNA的合成，PCR扩增和片段大小的选择；
D、使用IlluminaHiseq2500进行高通量测序；
E、对测序所得的序列进行去接头、去污染处理得到干净的小RNA分子序列，然后去除重复序列、mRNA降解片段、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA及piRNA，将剩余的序列与miRNA数据库中人miRNA序列进行比对分析，获得三种不同疾病来源的细胞外囊泡miRNA表达量信息；利用Cufflink软件分析三种标本的miRNA表达情况，同时使用BenjiminiandHochberg作为统计学方法，得到三种胸腔积液中细胞外囊泡miRNA的表达差异；
F、采用超高速离心的方法提取待鉴定胸腔积液细胞外囊泡，采用与上述B、C、D、E类似的方法得到待鉴定胸腔积液细胞外囊泡miRNA表达量信息，与三种胸腔积液中细胞外囊泡miRNA的表达差异比对，判断待鉴定胸腔积液的性质。
所述三种不同疾病来源是指临床已经确诊的肺癌、肺结核和肺炎患者，排除具有并发症和已经接受治疗的患者；所述胸腔积液的性质包括炎性、恶性和结核性，炎性对应于肺炎患者的胸腔积液，恶性对应于肺癌患者的胸腔积液，结核性对应于肺结核患者的胸腔积液。
步骤A中的超高速离心选用Beckman-Coulter公司的L-80XP超高速离心机，离心转速为200000g，离心温度为4℃，离心体积为200ml。
步骤E的具体做法是，去除与已知序列位置重合部分大于13nt的重复序列和mRNA降解片段；利用SOAP2.0软件将得到的干净的小RNA分子序列与Genebank、UCSC、NONCODE和Rfam数据库中RNA序列进行比对分析，去除rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA及piRNA；再将剩余的序列与miRNA数据库中人miRNA序列进行比对分析。
步骤E中所述miRNA数据库是指miRBase20.0。
步骤E中所述使用Cufflink软件和BenjiminiandHochberg统计学方法分析三种标本miRNA表达情况时，p≤0.01及∣log2(foldchange)∣≥1.5表示差异有统计学意义。
本发明通过高通量测序技术，对炎性、结核性和恶性三种胸腔积液中细胞外囊泡miRNA分析处理，有效地得到了三种胸腔积液中细胞外囊泡miRNA的差异表达情况，深入研究这些差异表达的miRNA将有助于进一步阐明胸腔积液及相关疾病的发病及致病机理，据此可实现对胸腔积液性质的鉴定。
附图说明
图1为炎性胸腔积液组高通量测序所得干净小RNA片段的分类与注释图；
图2为结核性胸腔积液组高通量测序所得干净小RNA片段的分类与注释图；
图3为恶性胸腔积液组高通量测序所得干净小RNA片段的分类与注释图；
图4为三组标本高通量测序所得miRNA数量分布图；
图5为炎性胸腔积液组与结核性胸腔积液组的细胞外囊泡miRNA差异表达聚类分析图；
图6为炎性胸腔积液组与恶性胸腔积液组的细胞外囊泡miRNA差异表达聚类分析图；
图7为结核性胸腔积液组和恶性胸腔积液组的细胞外囊泡miRNA差异表达聚类分析图。
具体实施方式
以下通过具体实施步骤，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。除了特别指明，以下实施例中所使用的技术手段和操作方法为本领域技术人员所熟知的常规手段和方法，所使用原料均为市售商品。
1、胸腔积液标本的收集
本实施例分别选取9例临床已被诊断为肺炎、肺结核和肺癌的患者，分别收集200ml的胸腔积液，分别作为炎性、结核性及恶性胸腔积液组用于后续实验操作。27例患者均来自南昌大学第二附属医院，临床已确诊，排除具有其他能引起胸腔积液增多的疾病及并发症的患者，所有胸腔积液标本均在治疗和用药前收集。
2、细胞外囊泡及其总RNA的提取
将收集的胸腔积液标本按以下离心步骤提取囊泡：先依次按400g，2000g和10000g离心力分别离心10min，20min和30min，以去除胸腔积液中的细胞及细胞碎片等大颗粒，收集上清液；然后利用超高速离心机以200000g离心力离心之前收集的上清液，时间为1小时，弃上清得胶状沉淀；最后用PBS缓冲液重悬沉淀，再次200000g离心1小时；收集沉淀，加入Trizol试剂，-80℃保存以备RNA提取。
分别将按上述步骤得到的三组实验组样本同组等量混合，按照Trizol法提取样本总RNA，步骤简述如下：常温下解冻样本，加入0.2ml/1mlTrizol氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min，4℃12000g离心15min；吸取上层水相，加入0.5ml/1mlTrizol异丙醇，室温放置10min，4℃12000g离心10min；去上清，用1ml75％乙醇洗涤RNA沉淀，4℃7500g离心5min；去沉淀，干燥8min，加入RNA溶解液，-80℃保存备用。
利用Agilent2200TapeStation和ND-1000Nanodrop仪器对提取的RNA样品进行浓度及质量检测。
3、cDNA文库的建立及Illumina测序
上述质检通过的样品，以1μg起始量，用Illumina公司配套的TruSeq○RSmallRNASamplePrepKit进行文库构建，步骤简述如下：先对RNA进行3’端和5’端连接修饰，然后利用逆转录试剂合成第一链cDNA，利用PCR扩增得到DNA产物，最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出小分子DNA，最终获得高通量测序DNA文库，并用Agilent2200TapeStation对文库进行质检。
将制备的文库按照IlluminaHiseq2500测序仪操作指南进行上机测序，上级样本的终浓度为10pM。DNA文库的制备和高通量测序均在广州锐博生物科技有限公司的协助下完成。
4、测序结果的处理和注释
IlluminaHiseq2500测序所得的序列集，通过去接头、去掉低质量序列及去污染等过程完成数据的初步过滤，得到干净序列；将获得的干净序列与miRBase、Genebank、UCSC、NONCODE和Rfam数据库进行比对，获得三组样本的小RNA分类与注释结果(参见图1、图2、图3)；将所有小RNA片段注释后，用剩下的未注释片段进行新miRNA预测。
5、三组样本miRNA表达量的分析
将所得的测序数据通过与miRNA的生物信息数据库(miRBase20.0)进行比较，获取各组miRNA的表达信息。使用Cufflink软件和BenjiminiandHochberg统计学方法分析三组标本中两两比较的miRNA差异表达情况，p≤0.01及∣log2(foldchange)∣≥1.5表示差异有统计学意义。
6、三组样本间差异表达miRNA结果
通过上述分析，结果显示，结核性胸腔积液组与炎性胸腔积液组间有20个差异表达的miRNA，如表1所示。恶性胸腔积液组与炎性胸腔积液组间有27个差异表达的miRNA，如表2所示。结核性胸腔积液组与恶性胸腔积液组间有32个差异表达的miRNA，如表3所示。
表1结核胸腔积液组与炎性胸腔积液组差异表达的miRNA
表2恶性胸腔积液组与炎性胸腔积液组差异表达的miRNA
表3结核性胸腔积液组与恶性胸腔积液组差异表达的miRNA
图4为三组标本高通量测序所得miRNA数量分布图；图5为炎性胸腔积液组与结核性胸腔积液组的细胞外囊泡miRNA差异表达聚类分析图；图6为炎性胸腔积液组与恶性胸腔积液组的细胞外囊泡miRNA差异表达聚类分析图；图7为结核性胸腔积液组和恶性胸腔积液组的细胞外囊泡miRNA差异表达聚类分析图。
对于未知胸腔积液性质的鉴定，采用与上述步骤类似的方法得到待鉴定胸腔积液细胞外囊泡miRNA表达量信息，与三种胸腔积液中细胞外囊泡miRNA的表达差异比对，以判断待鉴定胸腔积液的性质。

Claims (6)

1.一种胸腔积液性质的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、采用超高速离心的方法提取三种不同疾病来源的胸腔积液标本细胞外囊泡；
B、利用Trizol法提取标本细胞外囊泡总RNA；
C、构建cDNA测序文库，主要步骤包括3’端、5’端的连接，第一链cDNA的合成，PCR扩增和片段大小的选择；
D、使用IlluminaHiseq2500进行高通量测序；
E、对测序所得的序列进行去接头、去污染处理得到干净的小RNA分子序列，然后去除重复序列、mRNA降解片段、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA及piRNA，将剩余的序列与miRNA数据库中人miRNA序列进行比对分析，获得三种不同疾病来源的细胞外囊泡miRNA表达量信息；利用Cufflink软件分析三种标本的miRNA表达情况，同时使用BenjiminiandHochberg作为统计学方法，得到三种胸腔积液中细胞外囊泡miRNA的表达差异；
F、采用超高速离心的方法提取待鉴定胸腔积液细胞外囊泡，采用与上述B、C、D、E类似的方法得到待鉴定胸腔积液细胞外囊泡miRNA表达量信息，与三种胸腔积液中细胞外囊泡miRNA的表达差异比对，判断待鉴定胸腔积液的性质。
2.如权利要求1所述的胸腔积液性质的鉴定方法，其特征在于：所述三种不同疾病来源是指临床已经确诊的肺癌、肺结核和肺炎患者，排除具有并发症和已经接受治疗的患者；所述胸腔积液的性质包括炎性、恶性和结核性，炎性对应于肺炎患者的胸腔积液，恶性对应于肺癌患者的胸腔积液，结核性对应于肺结核患者的胸腔积液。
3.如权利要求2所述的胸腔积液性质的鉴定方法，其特征在于：步骤A中的超高速离心选用Beckman-Coulter公司的L-80XP超高速离心机，离心转速为200000g，离心温度为4℃，离心体积为200ml。
4.如权利要求1所述的胸腔积液性质的鉴定方法，其特征在于：步骤E的具体做法是，去除与已知序列位置重合部分大于13nt的重复序列和mRNA降解片段；利用SOAP2.0软件将得到的干净的小RNA分子序列与Genebank、UCSC、NONCODE和Rfam数据库中RNA序列进行比对分析，去除rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA及piRNA；再将剩余的序列与miRNA数据库中人miRNA序列进行比对分析。
5.如权利要求1所述的胸腔积液性质的鉴定方法，其特征在于：步骤E中所述miRNA数据库是指miRBase20.0。
6.如权利要求1所述的胸腔积液性质的鉴定方法，其特征在于：步骤E中所述使用Cufflink软件和BenjiminiandHochberg统计学方法分析三种标本miRNA表达情况时，p≤0.01及∣log2(foldchange)∣≥1.5表示差异有统计学意义。
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