CN103045736A - 唐氏综合征21号染色体miRNA差异表达图谱模型、构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

通过Illumina深度测序技术对DS胎儿全基因组miRNA表达谱和染色体分布特征的研究，得到与唐氏综合征21号染色体相关的miRNA差异表达图谱模型，其由1个表达上调的miRNA、4个表达下调的miRNA和9个零表达的miRNA构成。差异显著和特异表达的miRNA分子有助于了解DS疾病临床表型发生发展的分子调控机制，为进一步研究DS患者全基因组基因表达紊乱及其与相关临床症状的关系奠定基础。

Description

唐氏综合征21号染色体miRNA差异表达图谱模型、构建方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种唐氏综合征21号染色体miRNA差异表达图谱模型及构建方法和应用。

背景技术

唐氏综合征（Down syndrome，简称DS），又名21三体综合征，常伴有智力低下、特殊面容、免疫缺陷等80多种临床症状。关于DS患者各临床症状的产生，研究学者认为是21号3染色体和2倍体基因表达紊乱的共同作用结果。而21号3染色体基因如何导致2倍体基因表达紊乱、扰乱正常发育，产生各种临床有害表型的机制仍不清楚。miRNA（微小RNA，又称microRNA，）是一类长度为18~24个核苷酸（nucleotides，简称nt）的内生性单链非编码RNA。miRNA可与其靶基因mRNA的3′-端特异性结合，使靶基因mRNA降解或抑制靶基因编码蛋白的表达，在基因转录后表达调控中具有重要作用，是一种有效的基因表达调控因子。21号染色体miRNA基因的异常表达与DS相关临床表型的发生和发展密切相关。因此，鉴别与DS各临床表型相关miRNA的表达谱和染色体分布特征，将有助于了解DS疾病临床表型发生发展的分子调控机制，为进一步研究DS患者全基因组基因表达紊乱及其与相关临床症状的关系奠定基础。

发明内容

基于此，有必要提供一种唐氏综合征21号染色体miRNA差异表达图谱模型及构建方法和应用。

一种与唐氏综合征21号染色体相关的miRNA差异表达图谱模型，与健康对照组比较，由序列为SEQ ID NO.1的表达上调miRNA、序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.5的表达下调miRNA以及序列为SEQID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14的零表达miRNA构成。

上述miRNA差异表达图谱模型在制备诊断或检测唐氏综合征检测试剂中的应用。

一种用于诊断或检测唐氏综合征患者的基因检测芯片，包括用于检测分类号为miR-3118、miR-3156、miR-3197、miR-3648、miR-3687、miR-4327、miR-4759、miR-4760及miR-548x中至少一种miRNA的检测探针，各所述分类号是国际miRNA数据库的人类miRNA分类号。

一种与唐氏综合征21号染色体相关的miRNA差异表达图谱模型的构建方法，包括如下步骤：

收集唐氏综合征胎儿和健康胎儿的脐带血单个核细胞样品；

提取所述样品中的总RNA，用15wt%聚丙烯胺凝胶电泳分离所述总RNA，回收并纯化长度为18~30nt的小RNA分子，在T4RNA连接酶的作用下，在回收的小RNA的5’端加上SEQ ID NO.15的接头序列，3’端加上SEQ ID NO.16的接头序列，再经RT-PCR扩增生成小RNA文库，用Illumina Hiseq^TM2000测序仪进行深度测序分析；

对测序后所得的小RNA分子进行去接头和去污染处理，用SOAP软件将所得序列与人全基因组序列进行比对分析，除去重复序列、rRNA、tRNA、mRNA降解片段、scRNA、snoRNA、snRNA及piRNA，将剩下的序列与miRNA数据库中人miRNA序列比对，得到两组样品已知miRNA的含量、表达丰度和染色体分布信息；

分别对两组样本中的miRNA作归一化处理，使每个miRNA的表达量处于同一个量级，其中，归一化处理公式为：归一化表达量=(miRNA表达量/样品总表达量)×10⁶；

利用Audic and Claverie test统计学方法比较两组样本miRNA的表达差异，得到所述与唐氏综合征21号染色体相关的miRNA差异表达图谱模型，与健康对照组比较，miRNA差异表达图谱模型由序列为SEQ ID NO.1的表达上调miRNA、序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.5的表达下调miRNA以及序列为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13及SEQID NO.14的零表达miRNA构成。

通过Illumina深度测序技术对DS胎儿全基因组miRNA表达谱和染色体分布特征的研究，得到miRNA与DS全基因组基因表达紊乱之间的关系；差异显著和特异表达的miRNA分子有助于了解DS疾病临床表型发生发展的分子调控机制，为进一步研究DS患者全基因组基因表达紊乱及其与相关临床症状的关系奠定基础。

附图说明

图1为健康对照组的各种小RNA匹配序列的比例分布图，图中other代表其它小RNA，下同；

图2为DS组的各种小RNA匹配序列的比例分布图；

图3为21号染色体上14个编码miRNA的PCR检测结果图，其中，controlgroup表示健康对照组，DS group表示DS组，下同；

图4为miRNA编码基因在两组样本中的染色体分布图；

图5为两组样本中miRNA表达丰度的染色体分布图。

具体实施方式

下面主要结合附图及具体实施例对与唐氏综合征21号染色体相关的miRNA差异表达图谱模型、其应用及构建方法作进一步详细的说明。

一实施方式的构建方法、结果及相关检测结果如下：

1.构建

1.1、样本收集及胎儿脐带血的采集和保存

脐带血标本由深圳市人民医院临床医学研究中心遗传室提供，标准型DS胎儿脐带血6例（2男性，4女性），正常胎儿脐带血6例（2男性，4女性），分别设为DS组和健康对照组。每例样本均由常规G显带染色体核型分析确诊，孕周18~22周，孕妇年龄30~34岁。该研究经深圳市人民医院伦理委员会批准，且征得所有孕妇知情同意。

按照单个核细胞提取标准步骤，运用淋巴细胞分离液（Invitrogen公司）提取1mL EDTA抗凝脐带血单个核细胞，溶入1mL TRIzol试剂（Invitrogen公司）混合均匀，置于冻存管中，冻存于－80℃备用。

1.2、总RNA的提取

将冻存样本常温下解冻，按照TRIzol试剂盒（Invitrogen公司）操作说明提取总RNA。经Agilent2000Bioanalyzer分析仪检测合格后（RIN≥8.0且28S/18S>1.5），用于small RNA建库Illumina测序分析。

1.3、Small RNA文库构建和Illumina测序

用15%聚丙烯胺凝胶电泳（PAGE电泳）分离混合RNA样本，回收纯化18~30nt长度的小RNA分子。在T4RNA连接酶作用下，给小RNAs分子的加上SEQ ID NO.15的接头序列，3’端加上SEQ ID NO.16的接头序列，再由RT-PCR扩增生成small RNA文库，运用Illumina HiSeq^TM2000测序仪进行深度测序分析。文库的构建和测序均在深圳华大基因研究院的协助下完成。

1.4、Small RNA数据处理和注释

首先对Illumina测序所得序列进行去adaptor、去低质量、去污染、去冗余等处理，获得高质量干净序列并进行长度分布分析；再运用SOAP（2.0）软件将高质量干净序列与相关数据库（repeatmarker、genbank、rfam（10.0）、UCSC和piRNA数据库）进行序列比对分类注释，分析过程中允许碱基错配不大于2个，以尽可能去除重复序列、rRNA、tRNA、mRNA降解片段、scRNA、snoRNA、snRNA及piRNA等非编码RNA序列；再将余下序列与miRNA数据库（miRBase17.0）中人miRNA序列比对，获取两组样本已知miRNA的含量、表达丰度和染色体分布等信息。

1.5、两样本miRNA表达差异比较

首先对两组样本表达miRNA作归一化处理，使每个miRNA的表达量处于同一个量级[公式：归一化表达量（TPM）=(miRNA表达量/样品总表达量)×10⁶]；再利用Audic and Claverie test统计学方法比较两组样本miRNA的表达差异，并计算P值。若miRNA在两组样本间的倍比值≥2且P<0.001，该miRNA在两组样本间的表达差异显著；对于归一化后在两组样本中的表达量都小于10TPM的miRNA不参与差异表达分析。

1.6、两样本miRNA染色体分布

为研究两组样本表达miRNA编码基因的染色体分布，根据miRBase17.0人类miRNA注释基因，作如下处理：1）对miRNA基因表达产物作如上归一化处理，使两组样本miRNA基因表达水平处于同一量级；2）筛除多染色体多位点miRNA编码基因；3）若一个miRNA基因在两组样本中同时表达成熟体miRNA和miRNA^*（miRNA^*：miRNA功能单链的互补链），或miRNA-5p和miRNA-3p(新的miRNA命名，分别位于同一miRNA基因的5′端和3′端)，取两者较高值进行统计。

1.7、stem-loop qRT-PCR验证

提取各样本总RNA等量混合，用含miRNA特异茎环引物的M-MLV反转录试剂盒（Promega公司）合成cDNA，反应条件为85℃5min、42℃60min、85℃10min。real-time PCR反应采用SYBR green real-time PCR Kit(TOYOBO公司)在ABI7500PCR仪上进行。以U6为内参，95℃预反应5min后，在94℃15s、60℃15s、72℃32s条件下，运行40个循环，重复3次。检测结果采用2^-△△Ct法进行分析。

2.结果

2.1、两样本small RNA数据处理和注释

DS组（以P表示）和健康对照组（以N表示）分别获得高质量干净序列21770729（P）和17482100（N）条，主要分布在22nt长度左右。其中分别有8087250（P）和12536630（N）条序列与全基因组匹配，如图1和图2所示。两组样本表达miRNA/miRNA*序列共有395种编码于316个miRNA基因，其中DS组miRNA表达序列243种（218种miRNA和25种miRNA*），共计2208096条（约占28%）；对照组miRNA表达序列349种（295种miRNA和54种miRNA*），共计6369123条（约占51%）。在两组样本中都有表达的miRNA和miRNA*序列分别有178种和19种。

2.2、两样本miRNA表达谱的差异

两组样本显著差异表达的miRNA共有149种，如表1所示，其中有6种在DS组中表达上调，143种表达下调。此外，如表2所示，有51种miRNA特异性表达于对照组。如图3所示为21号染色体上14个miRNA基因stem-loopqRT-PCR验证结果，其中，P值小于0.05，其中1-14号miRNA的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.14的miRNA序列所示。

表1归一化后表达量大于1000TPM的差异表达miRNA/miRNA*

附注：折叠变化测定过程中P值（P-value）小于0.001。

表251个特异表达于对照组样本的miRNA/miRNA*

2.3两样本miRNA的染色体分布

如图4所示，两样本表达miRNA编码基因的染色体分布。图5为两样本miRNA基因的表达丰度染色体分布，其中，表达丰度百分比=每条染色体编码miRNA基因累积表达个数/全基因组总表达数。

通过Illumina深度测序技术对DS胎儿全基因组miRNA表达谱和染色体分布特征的研究，得到miRNA与DS全基因组基因表达紊乱之间的关系；差异显著和特异表达的miRNA分子有助于了解DS疾病临床表型发生发展的分子调控机制，为进一步研究DS患者全基因组基因表达紊乱及其与相关临床症状的关系奠定基础。得到的miRNA差异表达图谱模型可应用于制备诊断或检测唐氏综合征检测试剂，制备得到试剂可以用于DS胎儿的检测，不需要进行染色体核型分析，方便易行。特别是对于零表达的miRNA，可以设计特异性探针用于唐氏综合征胎儿或患者的检测，当探针没有检测到相应的信号或信号为空时，即可诊断为唐氏综合征患者，较之传统的染色体核型分析更简便。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种与唐氏综合征21号染色体相关的miRNA差异表达图谱模型，其特征在于，与健康对照组比较，由序列为SEQ ID NO.1的表达上调miRNA、序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.5的表达下调miRNA以及序列为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14的零表达miRNA构成。

2.如权利要求1所述的miRNA差异表达图谱模型在制备诊断或检测唐氏综合征检测试剂中的应用。

3.一种用于诊断或检测唐氏综合征患者的基因检测芯片，其特征在于，包括用于检测分类号为miR-3118、miR-3156、miR-3197、miR-3648、miR-3687、miR-4327、miR-4759、miR-4760及miR-548x中至少一种miRNA的检测探针，各所述分类号是国际miRNA数据库的人类miRNA分类号。

4.一种与唐氏综合征21号染色体相关的miRNA差异表达图谱模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

收集唐氏综合征胎儿和健康胎儿的脐带血单个核细胞样品；

提取所述样品中的总RNA，用15wt%聚丙烯胺凝胶电泳分离所述总RNA，回收并纯化长度为18~30nt的小RNA分子，在T4RNA连接酶的作用下，在回收的小RNA的5’端加上SEQ ID NO.15的接头序列，3’端加上SEQ ID NO.16的接头序列，再经RT-PCR扩增生成小RNA文库，用Illumina Hiseq^TM2000测序仪进行深度测序分析；

对测序后所得的小RNA分子进行去接头和去污染处理，用SOAP软件将所得序列与人全基因组序列进行比对分析，除去重复序列、rRNA、tRNA、mRNA降解片段、scRNA、snoRNA、snRNA及piRNA，将剩下的序列与miRNA数据库中人miRNA序列比对，得到两组样品已知miRNA的含量、表达丰度和染色体分布信息；

分别对两组样本中的miRNA作归一化处理，使每个miRNA的表达量处于同一个量级，其中，归一化处理公式为：归一化表达量=(miRNA表达量/样品总表达量)×10⁶；

利用Audic and Claverie test统计学方法比较两组样本miRNA的表达差异，得到所述与唐氏综合征21号染色体相关的miRNA差异表达图谱模型，与健康对照组比较，miRNA差异表达图谱模型由序列为SEQ ID NO.1的表达上调miRNA、序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.5的表达下调miRNA以及序列为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13及SEQID NO.14的零表达miRNA构成。

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