CN104032016A - 一种鸡肠炎沙门氏菌感染相关microRNA的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鸡肠炎沙门氏菌感染相关microRNA的检测方法，通过Solexa高通量测序技术鉴定与鸡肠炎沙门氏菌感染相关的microRNA，并通过生物信息学相关技术进一步分析microRNA相关靶基因的功能及其作用的信号通路，整合microRNA本身及其靶基因的信息，筛选出与肠炎沙门氏菌感染相关的microRNA。选择肠炎沙门氏菌感染后第7天这一时间点，作为样品采集点；对处理组和对照组中多个个体进行混池测序，每个组内的混池≥3；首次大规模分析鉴定与鸡肠炎沙门氏菌感染相关的microRNA，将为深入研究microRNA在肠炎沙门氏菌感染中的作用机制奠定基础，为鸡的分子抗病遗传育种提供理论基础和科学依据。

Description

一种鸡肠炎沙门氏菌感染相关microRNA的检测方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种鸡肠炎沙门氏菌感染相关microRNA的检测方法。
背景技术
肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)为革兰氏阴性菌，是世界公认的食源性致病菌之一，不仅对蛋鸡生产造成重大影响，而且它能通过家禽副产品给人类的健康带来很大的威胁。这种病菌主要是通过动物性食源致人中毒甚至死亡，主要包括肉、蛋和奶及相关制品等。沙门氏菌能侵入细胞内部释放毒素，侵入过程为首先在自己表面形成一个针状突起用来和目标细胞接触，一些特殊的蛋白通过此针状突起到达目标细胞，破坏细胞膜结构，从而使沙门氏菌细胞侵入到目标细胞中释放毒性蛋白。
microRNA是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。microRNA作为重要的基因表达调节因子广泛参与发育、凋亡、肿瘤、免疫和机体-微生物相互作用等生理病理过程。microRNA可对宿主天然免疫和获得性免疫进行精细调控，包括细菌、病毒感染。
近年来，Solexa高通量测序技术成为各物种microRNA分析鉴定的有力工具，并且与病毒感染相关的鸡microRNA已有研究。目前还没有通过Solexa测序鉴定与鸡肠炎沙门氏菌感染相关microRNA的研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种鸡肠炎沙门氏菌感染相关microRNA的检测方法，选择肠炎沙门氏菌感染后第7天这一时间点，作为样品采集点；利用Solexa方法对处理组和对照组中多个个体(≥6)进行混池测序，每个组内混池≥3；首次大规模分析鉴定与鸡肠炎沙门氏菌感染相关的microRNA，将为深入研究microRNA在肠炎沙门氏菌感染中的作用机制奠定基础，为鸡的分子抗病育种提供理论基础和科学依据。其具体技术方案为：
一种鸡肠炎沙门氏菌感染相关microRNA的检测方法，包括以下步骤：
1)将鸡分为试验组与对照组，试验组接种肠炎沙门氏菌，对照组接种磷酸盐缓冲液(PBS)，接种后采集肠道组织样品，提取总RNA。
2)试验组随机选取6-9个个体，混池建3个库(Tp1，Tp2，Tp3)，对照组随机选取5-6个个体，混池建3个库(Cp1，Cp2，Cp3)。用Illumina Hiseq2000测序平台所构建文库进行高通量测序。
3)测序原始数据经过引物与接头序列去除，并经过对测序片段碱基的质量检验和长度筛选，最终选择质量可靠的测序片段。然后统计microRNA的种类及数量，并对microRNA长度分布进行统计。
4)参考基因组比对
将样本预处理后的净读数(clean read)与参考基因组序列比对。与已知microRNA前体及成熟体比对统计信息
5)Rfam数据库比对
选取Rfam数据库来注释测序得到的microRNA序列，尽可能的发现并去除其中可能的核糖体RNA，胞质microRNA，核仁microRNA，核内RNA，转运RNA。
6)microRNA表达量计算
非编码microRNA表达量计算是将与参考基因组序列匹配的干净读数(来自过滤后数据)采用cufflink软件，并通过统计学方法计算每条microRNA表达量。microRNA表达量计算采用FPKM(每1百万个比对上的片段中比对到外显子的每1千个碱基上的片段数目)计算度量指标，计算microRNA区间内microRNA表达量。
7)microRNA差异表达分析及新microRNA的预测
根据统计检验结果，用P＜0.05作为差异表达的标准。
8)microRNA靶基因预测
针对差异表达分析得到的microRNA，利用miRanda算法预测差异microRNA的(已知，潜在或预测的)靶基因(Target Gene)。miRanda算法从(1)microRNA-3′非翻译区序列匹配、与(2)能量稳定性评估计算的二步计算预测步骤，综合预测microRNA的靶基因。3′非翻译区来自加州大学圣克鲁兹分校基因组生物信息学中心(UCSC Genome Bioinformatics)和ENSEMBLE数据库中基因的3′非翻译区序列。为了进行差异microRNA靶基因的功能分析，进一步从靶基因结果中选取可信度得分更好的结果。筛选标准是：得分＞200；自由能＜-20千卡/摩尔(kcal/mol)。
9)microRNA靶基因基因本体(GO)功能分析
基因本体功能聚类常用于对目标组基因特征进行功能注释与分类，即差异表达microRNA靶基因的功能聚类(富集度)分析。分别对基因本体中生物学过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组分(CC)进行富集度分析。本分析方法采用基因本体注释系统，针对高度可信度靶基因预测结果展开分析。富集度分析采用超几何分布算法，并采用多重假设检验校验超几何分布统计量的P值，获得校正后P值，即Q值，选择P＜0.05作为基因本体 富集的标准。
10)microRNA靶基因信号通路功能分析
生物通路分析采用京都基因与基因组百科全书(KEGG)生物通路数据库进行富集度分析(Enrichment Analysis)。富集度分析采用超几何分布算法，并采用多重假设检验校验超几何分布统计量的P值，获得校正后P值，即Q值，选择P＜0.05作为信号通路富集的标准。
优选地，所述相关microRNA具体为：
gga-miR-490-5p其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
gga-miR-216a其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
gga-miR-193a-3p其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
gga-miR-133b其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
gga-miR-215-5p其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
gga-miR-147其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
gga-miR-1662其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明可以通过Solexa高通量测序技术鉴定与鸡肠炎沙门氏菌感染相关的microRNA，并通过生物信息学相关技术进一步分析microRNA相关靶基因的功能及其作用的信号通路，整合microRNA本身及其靶基因的信息，筛选出与肠炎沙门氏菌感染相关的microRNA。
附图说明
图1是不同长度读数数的分布图，其中图1a为对照组不同长度读数数目的分布图，图1b为试验组不同长度读数数目的分布图；
图2是显著富集的免疫相关基因本体-生物学过程类别；
图3是显著富集的基因本体-分子功能类别；
图4是显著富集的信号通路。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
将白来航蛋鸡分为试验组与对照组，试验组接种肠炎沙门氏菌，对照组接种磷酸盐缓冲液(PBS)，接种后第7天采集小肠组织样品，用试剂盒提取总RNA。
试验组随机选取9个个体，混池建3个库(Tp1，Tp2，Tp3)，对照组随机选取9个个体，混池建3个库(Cp1，Cp2，Cp3)。
利用Solexa高通量测序技术对样品进行高通量测序。
原始数据经过引物与接头序列去除，并经过对测序片段碱基的质量检验和长度筛选，最终选择质量可靠的测序片段(表1)。
统计microRNA(sRNA)的种类(用unique表示)及数量(用total表示)，并统计microRNA的长度分布(图1)。
测序结果采用bowtie软件与参考基因组比对，将microRNA定位到相应染色体，统计各染色体上读数的数目(表2)。
利用生物信息学方法计算试验组与对照组间各microRNA的差异表达，得到差异表达microRNA数目和倍数变化(表3)。
预测差异表达的microRNA的靶基因，并对靶基因进行基因本体和信号通路分析(图2-4)。
综合差异表达microRNA及其靶基因功能分析结果，得出与肠炎沙门氏菌感染相关的microRNA。
表1：各文库测序获得的读数
表2：读数在染色体上的分布
表3：肠炎沙门氏菌感染引起差异表达microRNA的倍数变化
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种鸡肠炎沙门氏菌感染相关microRNA的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将白来航蛋鸡分为试验组与对照组，试验组接种肠炎沙门氏菌，对照组接种磷酸盐缓冲液，接种后第7天采集肠道组织样品，用试剂盒提取总RNA；
2)试验组随机选取6-9个个体，混池建3个库：Tp1，Tp2，Tp3，对照组随机选取5-6个个体，混池建3个库：Cp1，Cp2，Cp3；
3)采用Illumina Hiseq2000测序平台的单端50bp测序模式对样本进行高通量测序；
4)测序原始数据经引物与接头序列去除，并经过对测序片段碱基的质量检验和长度筛选，最终选择质量可靠的测序片段用于后续分析；
5)统计microRNA的种类及数量，并对microRNA做长度分布统计；
6)参考基因组比对
将样本预处理后的干净数据读数与参考基因组序列比对，已知microRNA前体及成熟体比对统计信息；
7)Rfam数据库比对
选取Rfam10.1数据库来注释测序得到的microRNA序列，尽可能的发现并去除其中可能的核糖体RNA，胞质microRNA，核仁microRNA，核内RNA，转运RNA；
8)microRNA表达量计算
非编码microRNA表达量计算是将与参考基因组序列匹配的干净读数，采用cufflink软件，并通过统计学方法计算每条microRNA表达量，microRNA表达量计算采用FPKM计算度量指标，计算microRNA区间内microRNA表达量；
9)microRNA差异表达分析及预测新microRNA
10)microRNA靶基因预测
针对差异表达分析得到的microRNA，利用miRanda算法预测来自比对组所得到的差异microRNA的靶基因，miRanda算法从(1)microRNA-3′非翻译区序列匹配与(2)能量稳定性评估计算的二部计算预测步骤综合预测microRNA的靶基因；
11)microRNA靶基因基因本体功能分析
基因本体功能聚类常用于对目标组基因特征进行功能注释与分类，即差异表达microRNA的预测靶基因的功能聚类分析，采用基因本体注释系统，针对高度可信度靶基因预测结果展开分析，富集度分析采用超几何分布算法，并采用多重假设检验校验超几何分布统计量的P值，获得校正后P值，即Q值；
12)microRNA靶基因生物通路功能分析
生物通路分析采用京都基因与基因组百科全书数据库进行富集度分析；
13)肠炎沙门氏菌感染相关microRNA的鉴定
整合microRNA本身结果与其靶基因功能分析结果，获得鸡与肠炎沙门氏菌感染相关的microRNA。
2.根据权利要求1所述的鸡肠炎沙门氏菌感染相关microRNA的检测方法，其特征在于，所述相关microRNA具体为：
gga-miR-490-5p其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
gga-miR-216a其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
gga-miR-193a-3p其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
gga-miR-133b其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
gga-miR-215-5p其核苷酸序列如SEQID NO：5所示；
gga-miR-147其核苷酸序列如SEQID NO：6所示；
gga-miR-1662其核苷酸序列如SEQID NO：7所示。
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