CN108060220A - 弓形虫慢性感染雄性小鼠生殖系统靶标基因的鉴定及其在临床上的应用 - Google Patents

弓形虫慢性感染雄性小鼠生殖系统靶标基因的鉴定及其在临床上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种应用RNA‑seq技术研究弓形虫慢性感染小鼠附睾组织差异表达基因的方法，包含以下步骤：(1)小鼠附睾组织的RNA提取；(2)对步骤(1)所得的RNA进行文库构建和测序；(3)对步骤(2)测序结果进行生物信息学分析，获取弓形虫慢性感染小鼠附睾组织的差异表达基因，筛选并鉴定与生殖相关的基因。本发明提供的弓形虫慢性感染附睾组织差异表达基因的方法能快速有效地进行基因表达差异的研究，用qPCR方法检测筛选的靶标基因来鉴定附睾是否感染弓形虫，对于提高公畜的生殖潜力及动物繁殖率均有重要理论价值和应用前景，将它们作为衡量公畜生殖系统感染弓形虫的分子标记，有利于快速定位到具有研究价值或商业应用价值的检测靶标、防治药物靶点。

Description

弓形虫慢性感染雄性小鼠生殖系统靶标基因的鉴定及其在临 床上的应用
技术领域
本发明涉及寄生虫学领域，涉及一种弓形虫感染雄性小鼠附睾组织损伤机制的研究；具体涉及一种应用RNA-seq技术获取弓形虫慢性感染小鼠附睾组织差异表达基因的方法，揭示弓形虫对雄性生殖系统附睾的表达调控机制，获得应对特定疾病信号主要的基因，还涉及一种弓形虫感染的检测方法。
背景技术
弓形虫是细胞内寄生原虫，几乎可以感染所有的温血动物。孕妇感染弓形虫后，虫体垂直传播给胎儿可造成胎儿畸胎、流产和死亡等现象。弓形虫的感染还可造成男性生殖系统的损伤、性功能和生育力降低等严重后果，直接影响着人类健康和优生优育。其中，附睾是雄性生殖系统中重要的附属性器官，是精子成熟和储存的场所。在睾丸中生成的精子不具备授精能力，且缺乏运动性，精子在附睾中成熟是一个高度程序化的过程，可能受到精子自身因素和附睾微环境的影响。由于附睾的功能专一，是激素作用的终末器官且本身又不合成激素，所以我们的研究有助于发现弓形虫感染在附睾的精子成熟过程中的影响因素。前人研究表明弓形虫感染引起雄性生殖管道受损，性腺功能减退等疾患；Bohring研究发现不育症患者精液中有大量弓形虫速殖子，抗精子抗体(AsAb)呈现阳性；杨连第等也在弓形虫感染的附睾组织切片中证实了精子数量明显减少，输精管上皮细胞有颗粒样变性，曲细精管管腔狭窄。同时其他研究还发现附睾间质中有炎性细胞。弓形虫感染的小鼠附睾内精子密度、精子活动率均显著低于对照组小鼠，但精子畸形率升高(如无头、弯尾、双头等)。
随着后基因组时代的到来，转录组学、蛋白质组学、代谢组学等各种组学技术相继蓬勃发展起来，其中转录组学是当前发展最成熟的技术。转录组学是研究活细胞在某一功能状态下所含mRNA的类型和拷贝数，反应了某一特定时间和空间细胞内所有基因的表达情况。遗传中心法则表明，遗传信息通过mRNA从DNA传递到蛋白质。因此，mRNA作为DNA和蛋白质信息传递的“桥梁”，对它的研究就显得尤为重要。
目前，弓形虫感染对雄性不育的研究大都集中在流行病学方面，通过血清学方法检测出弓形虫抗体、用PCR方法检测到精液中有弓形虫DNA，以及做病理组织切片观察到弓形虫感染引起组织和细胞水平的损伤，但是还未有报道关于应用转录组测序技术研究弓形虫慢性感染小鼠雄性生殖系统中的附睾组织差异表达基因的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种应用RNA-seq技术研究弓形虫慢性感染小鼠附睾组织差异表达基因的方法、弓形虫PRU株慢性感染致雄性小鼠附睾组织损伤机制的转录组分析方法及其应用。
本发明第一方面提供一种应用RNA-seq技术研究弓形虫慢性感染小鼠附睾组织差异表达基因的方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)小鼠附睾组织的RNA提取；
(2)对步骤(1)所得的RNA进行文库构建和测序；
(3)对步骤(2)测序结果进行生物信息学分析，获取弓形虫慢性感染小鼠附睾组织的差异表达基因。
在本发明一实施例中，步骤(1)中，小鼠包括昆明鼠、Balb/c鼠、沙鼠中的一种或多种。
在本发明一实施例中，步骤(3)中所述的差异表达基因包括8个与生殖密切相关的基因，其中6个基因表达上调，记为第一检测靶标组，所述第一检测靶标组包括Piwil2、Spata18、Tnfsf10、Tgtp1、Iigp1、Pgk2，2个基因表达下调，记为第二检测靶标组，所述第二检测靶标组包括Nwd1、Spink2。
在本发明一实施例中，步骤(3)所述的生物信息学分析，包括以下步骤：
对测序原始数据进行质控，获得高质量clean reads；
使用序列组装程序对clean reads进行拼接，得到的转录本序列；
比对到数据库进行基因功能注释；
基因表达水平分析和差异表达基因分析；
差异表达基因的Gene Ontology(GO)功能分析；
差异表达基因的生物通路(KEGG)功能分析。
在本发明一具体实施例中，步骤1)包括：对测序原始数据进行过滤，去除带接头的、ploy-N和测序引物的低质量reads，同时计算Q20、Q30、GC含量和clean reads的序列重复性，获得高质量clean reads。
在本发明一具体实施例中，所述的步骤2)包括：使用Trinity程序对clean reads进行拼接，将Trinity拼接得到的转录本序列，作为后续分析的参考序列。取每条基因中最长的转录本作为Unigene，以此进行后续的分析。
在本发明一具体实施例中，所述的步骤4)包括：用DEGseq程序中的MARS模型计算每个基因的RPKM值，若RPKM值大于1000，认为是高表达基因，变化倍数(log2 RPKM -PRU/RPKM-Control)根据标准化的基因表达水平，统计基因的差异表达情况，筛选出的基因为显著差异表达基因。进一步地，所述的步骤4)获取弓形虫慢性感染小鼠附睾组织的差异表达基因不低于422个，其中表达上调的基因不低于357个，表达下调的基因不低于65个。
在本发明一具体实施例中，所述的步骤5)包括：把所有显著性差异表达基因向GO数据库的各term映射，计算每个term的基因数目，然后应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比在显著性差异表达基因中显著富集的GO terms，用校正的P值<0.05作为判断显著性富集GO term的阈值。进一步优选地，所述的步骤5)获得注释为特定GO的具有显著性差异的基因不低于3806个基因，其中得到上调差异基因的显著性GO term不低于3302个，下调差异基因的显著性GO term不低于504个。
在本发明一具体实施例中，所述的步骤6)包括：通路富集分析识别显著性富集的代谢途径或信号转导通路，以校正的P值<0.05作为阈值，找出与整个基因组背景相比在显著性差异表达基因中显著富集的通路。进一步优选地，所述的步骤6)获得注释为特定KEGG的具有显著性差异的基因不低于477个基因，这些差异表达基因显著性富集到100条通路中，差异表达基因数最多的前3个通路分别是细胞粘附分子(31个),吞噬体通路(27个)和自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路(17个)。
本发明第二方面提供一种弓形虫感染宿主的检测方法，所述的检测方法以弓形虫感染宿主附睾组织差异表达基因为检测靶标。
在本发明一实施例中，所述的差异表达基因包括8个与生殖密切相关的基因，其中6个基因表达上调，记为第一检测靶标组，所述第一检测靶标组包括Piwil2、Spata18、Tnfsf10、Tgtp1、Iigp1、Pgk2，2个基因表达下调，记为第二检测靶标组，所述第二检测靶标组包括Nwd1、Spink2。当所述所述第一检测靶标组的至少一个表达上调，且/或第二检测靶标组的至少一个表达下调时，判断宿主感染弓形虫。
在本发明一实施例中，所述的宿主包括但不限于小鼠、猪、犬或猫。
在本发明一实施例中，所述的检测方法采用荧光定量PCR方法结合特异性引物对感染弓形虫的宿主附睾组织进行检测；所述的特异性引物的序列包括表6中SEQ ID NO:1～16所示。
本发明第三方面提供如本发明第一方面所述的应用RNA-seq技术研究弓形虫慢性感染小鼠附睾组织差异表达基因的方法、如本发明第二方面所述的弓形虫感染宿主的检测方法在制备弓形虫慢性感染关联信号通路生物标志物或诊断试剂中的应用，其中，所述信号通路包括细胞凋亡通路、糖酵解通路、MAPK信号通路、细胞因子和细胞因子受体相互作用通路、胞吞通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路、吞噬体通路、细胞粘附分子通路中的一种或多种。
本发明第四方面提供如本发明第一方面所述的应用RNA-seq技术研究弓形虫慢性感染小鼠附睾组织差异表达基因的方法、如本发明第二方面所述的弓形虫感染宿主的检测方法在制备弓形虫慢性感染关联疾病生物标志物、诊断试剂或靶向药物中的应用。
本发明通过比较弓形虫慢性感染小鼠与健康小鼠的附睾组织，筛选差异表达基因，来研究宿主的差异表达基因与弓形虫之间的作用机制，并为寻找生物标志物提供靶标。本发明提供的应用RNA-seq技术研究弓形虫慢性感染小鼠附睾组织差异表达基因的方法能快速有效地进行转录组学研究，同时可通过检测宿主的差异表达基因间接确认宿主是否感染弓形虫，为研究弓形虫慢性感染致宿主生殖损伤机制以及发现新的生物标志物提供参考。
附图说明
图1为弓形虫慢性感染小鼠附睾的基因表达值分布统计图，其中左边为弓形虫感染组，右边为对照组；
图2为弓形虫慢性感染小鼠附睾的差异表达基因的火山图，其中上方方框标注部分代表显著性差异表达基因，下方方框外的部分为非显著性差异表达基因；
图3为弓形虫慢性感染小鼠附睾的显著性差异表达基因的GO分析图；
图4为弓形虫慢性感染小鼠附睾的差异表达基因最富集通路图；
图5为弓形虫慢性感染小鼠附睾的基因组qPCR分析与RNA-seq比对结果图；
图6为弓形虫慢性感染小鼠附睾的Western blot分析结果图，其中，通道1、2分别代表对照组和弓形虫感染组，从上到下依次是Piwil2、Spata18，Tnfsf10基因和内参β-actin；
图7为利用qPCR检测弓形虫慢性感染附睾的靶标基因表达差异的结果图，其中，标出的实线代表log2 (fold change)＝1，虚线代表log2 (fold change)＝-1。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
在本发明第一实施例中，本发明提供了一种应用RNA-seq技术对感染弓形虫慢性感染小鼠附睾组织差异表达基因的方法。
本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。
6～8周龄的SPF级昆明小鼠，购于广东省实验动物中心；
弓形虫PRU株，由华南农业大学兽医学院寄生虫实验室保存。
1材料与方法
1.1样品制备
弓形虫慢性感染小鼠模型建立
从广东省实验动物中心处购买SPF级8周龄雄性昆明小鼠50只，将其中30只小鼠标记为实验组，另20只为对照组。实验组中将弓形虫PRU株的包囊以灌胃方式攻入小鼠体内，包囊数量为4个/只，用生理盐水脑匀浆稀释到0.5mL/只。对照组用相同数量的生理盐水灌胃到小鼠体内，观察小鼠每天的状态。本实验取感染后第35天时将小鼠处死。为降低个体差异性，我们挑选从外观上看变化最显著的15只小鼠处死，每5只小鼠的附睾组织为一个生物学重复，重复三次。对照组的分组方法如上。在无菌环境中快速取出附睾，在体视显微镜下仔细分离附睾周围的脂肪组织及血管，液氮速冻后置于-80℃保存。
1.2RNA提取
用Trizol法从昆明小鼠附睾组织的样品中提取总RNA。将样品放入用液氮预冷的研钵中，加适量液氮迅速研磨，转移到经DEPC处理过的2mL离心管中，加入1mL Trizol(Invitrogen,CA,USA)，旋涡振荡混匀，室温静置10min；4℃、12000rpm/min离心10min，将上清液移入新的1.5mL离心管，加入0.2mL氯仿，盖紧管盖，用力摇15s充分混匀，室温静置10min；4℃、12000rpm/min离心10min，将上清液移至新的1.5mL离心管，加入0.5mL的异丙醇，室温静置10min；4℃、12000rpm/min离心15min，去除上清液，用RNase-free水配制的75％乙醇洗涤；4℃、12000rpm/min离心15min，去除上清液；室温中自然干燥，用RNase-free水溶解，保存于-80℃备用。用Agilent 2100Bioanalyzer和RNA6000 Nano LabChip试剂盒(Agilent,CA,USA)来检测提取的总RNA质量和纯度。
1.3RNA文库构建和测序
提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。经抽提的mRNA在高温下被二价阳离子裂解成小片段，以这些短序列为模板，用六碱基随机引物合成第1条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I(Invitrogen,CA,USA)合成第2条cDNA链。AMPure XP beads纯化双链产物，利用T4DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶活性将DNA的黏性末端修复为平末端，3'末端加碱基A并加接头，AMPure XP beads进行片段选择，最后进行PCR扩增获得最终测序文库，文库质检合格后用Illumina Hiseq2000/2500进行测序，测序读长为双端2x100bp。
1.4原始数据分析和序列组装
测序得到原始测序序列(raw reads)，里面含有带接头的、ploy-N和测序引物的低质量reads，为了保证信息分析质量,必须对测序数据进行过滤得到clean reads。同时，计算Q20、Q30、GC含量和clean reads的序列重复性。所有下游分析均以高质量clean reads为基础。在各种可用的程序中，我们使用Trinity程序(http://trinityrnaseq.sourceforge.net/)。对clean reads进行拼接，将Trinity拼接得到的转录本序列，作为后续分析的参考序列。取每条基因中最长的转录本作为Unigene，以此进行后续的分析。
1.5转录物的功能注释
为获得全面的基因功能信息，将clean reads比对到5个数据库进行基因功能注释，比对到某基因的clean reads中，如果至少有1条是与参考基因的唯一比对(uniquematch)，则将该参考基因定义为一个表达基因。基于以下数据库进行序列的功能注释：SWISS-PROT(SwissProt protein sequence database)，NCBI非冗余核酸数据库NR(non-redundant protein database)，KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)，KOG(Karyotic Orthologous Group database)和广泛用于蛋白家族和结构域的数据库Pfam。所有的搜索都是在Blast进行。
1.6基因丰度评估和差异表达基因阈值设置
基因表达水平通过RPKM值(Reads Per Kilobase of exon model per Millionmapped reads)来度量基因表达的丰度值，测序深度和基因长度对reads计数的影响是目前最常用的评估基因表达水平的方法。用DEGseq程序中的MARS(MA-plot-based method withrandom sampling model)模型计算每个基因的RPKM值。若RPKM值大于1000，认为是高表达基因。变化倍数(log2 RPKM-PRU/RPKM-Control)根据标准化的基因表达水平。统计基因的差异表达情况，筛选出的基因为显著差异表达基因。在本实验中，设置“FDR(false discovery rate)<0.001和|log2 fold change|≥1”作为判断差异表达基因的阈值。
1.7差异表达基因的GO和KEGG pathway富集
GO(Gene Ontology)是一个国际化的基因功能性分类系统。GO功能显著性富集分析首先把所有显著性差异表达基因向GO数据库(http://www.geneontology.org/)的各term映射，计算每个term的基因数目，然后应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比在显著性差异表达基因中显著富集的GO terms。用校正的P值<0.05作为判断显著性富集GOterm的阈值。P值计算公式如下：
其中，N代表基因组中GO注释基因数量，n代表在N中的差异表达基因数量，M代表基因组中特异性GO注释基因数量，m代表M中特异性GO注释基因中差异表达基因的数量。
KEGG是通路分析的主要公共数据库(http://www.genome.jp/kegg/)，帮助我们更好地理解生物体内不同基因相互协调并行使各自的生物学功能过程。通路富集分析识别显著性富集的代谢途径或信号转导通路，以校正的P值<0.05作为阈值，找出与整个基因组背景相比在显著性差异表达基因中显著富集的通路，计算公式同上。
1.8实时荧光定量PCR分析验证mRNA的表达水平
根据RNA-seq，我们用实时荧光定量PCR(qPCR)分析验证基因表达水平。从弓形虫PRU株慢性感染的附睾组织中用RNAiso Plus(Takara,Dalian,China)提取样品总RNA，最后用RNase-free水重悬。总RNA的浓度与纯度用超微分光光度计(Thermo,ScientificNanodrop 2000,Waltham,MA,USA)进行测量。用SYBR PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa,Dalian,China)合成cDNA。根据基因的参考序列我们用Premier 5.0软件(Premier Biosoft International,Palo Alto,CA,USA)设计特异性qPCR引物，基因特异性qPCR引物及目的产物长度如表1所示。qPCR反应用SYBR Green(SYBRPremix Ex Tag TMII；TaKaRa Bio)染色法在Rotor-Gene Q(Qiagen)实时系统中进行。qPCR反应体系(20μL)：10μL SYBR Premix Ex TaqII，ddH2O 6μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，模板2μL(cDNA浓度统一稀释成40ng/μL)。qPCR程序：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火1min，共进行40个循环。每个样品重复三次。为了使基因表达更加标准化，我们以β-actin为内参基因，对照组为标准样品并设置为1，各基因相对表达量采用2–ΔΔCt法计算。
1.9 Western blot验证部分基因的蛋白表达水平
挑选3个与雄性生殖相关的差异表达基因进行蛋白质表达水平鉴定(Piwil2,Spata18和Tnfsf10)，同样地，选取β-actin作为实验内参基因。预处理蛋白样品在10％SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)中，先设置电压80V，30min后再调成120V，电泳60min。转膜时将尼龙膜(Roche,Indianapolis,USA)切成适当大小，按海绵-3层滤纸-SDS-PAGE蛋白胶-尼龙膜-3层滤纸-海绵顺序排放，150mA转膜45min。将尼龙膜置于4℃预冷的含0.1％吐温-20的浓度为5％脱脂牛奶中封闭1h，分别加特异性抗体进行孵育2h，包括小鼠单克隆抗体Piwil2(1:800,Abcam)，兔单克隆抗体Spata18(1:1000,Abcam)，小鼠单克隆抗体Tnfsf10(1:400,Abcam)和内参β-actin(1:5000,Abcam)，使用TBST洗膜，每10min更换一次TBST液，重复3次。然后分别加入羊抗鼠和羊抗兔的IgG-HRP(辣根过氧化物酶)(1:2500,Tiangen Biotech(Beijing)Co.Ltd.,China)在37℃中孵育1h，重复上述洗膜过程。使用DAB显色液(TiangenBiotech(Beijing)Co.Ltd.,China)及ECL-plus Western Blotting检测分析系统(Tiannon,Shanghai,China)观察结果。
2结果
2.1RNA提取结果及质量分析
检测结果显示，总RNA溶液的纯度较高(OD260/OD280和OD260/OD230均大于2.0)，浓度≥800ng/μL，RNA integrity number(RIN)值≥7，且rRNA 28S/18S≥0.8，如表2所示，说明提取的总RNA的完整性较好，符合后续实验要求。
表2 RNA提取质量结果
2.2RNA测序及数据预处理
在本实验中，利用RNA-Seq技术对弓形虫感染前后的雄性昆明小鼠附睾组织进行转录组测序。对两组样品中提取的总RNA用来构建RNA文库并用Illumina Hiseq 2000/2500测序，测序后得到大约48.17G数据量的raw reads。经数据过滤后，共得到约47.21G的cleanreads，每个样本测序数据量均在6G以上。大约97.92％数据是有效的，可以进行下一步分析。测序数据质量预处理结果如表3所示。
表3测序数据质量预处理结果一览表
Q20％：错误识别的概率是1％，即错误率1％，或者正确率是99％；
Q30％：错误识别的概率0.1％，即错误率0.1％，或者正确率是99.9％；
2.3基因表达水平分析
在转录组中，我们用FPKM(Fragments Per Kilobase of exon model perMillion mapped fragments)来评估样品中的基因表达丰度。经过新的转录本构建，共有69907转录本，产生29128个Unigene。为了更直观地观察两组数据的数值分布，我们绘制了箱形图来显示两组数据的五个统计量，从上到下分别是最大值、上四分位数、中值、下四分位数、最小值，如图1所示。从图中看出，整体上两组数据没有很大的差别，只是在数据的中值上实验组较对照组更偏离上四分位数，而最大值比对照组略低。
2.4基因差异表达分析
我们将差异基因的阈值设置为P<0.05，|log2 (fold change)|≧1，FDR校正的q值<0.05，满足条件的差异显著阈值标为significant。分析弓形虫感染组与对照组对比的显著性差异表达基因，总共422个基因在表达水平上存在显著差异。其中有65个下调和357个上调的差异表达基因。部分上调和下调差异表达基因分别列于表4和表5中。同时，我们通过绘制了火山图以便更加直观地从所有检测到的基因中观察显著性差异表达基因的分布情况，如图2所示。
表4部分上调表达的差异表达基因
表5部分下调表达的差异表达基因
2.5差异表达基因的生物信息学分析
对显著性差异表达基因进行进一步研究，将每个差异表达基因与GO数据库进行比对(显著性筛选的标准：P<0.05)。附睾数据中参与GO注释的基因总数有8856个，其中注释为特定GO的具有显著性差异的基因总共有3806个基因，主要涉及应激反应、免疫反应、细胞增殖和粘附、凋亡等。得到上调差异基因的显著性GO term共有3302个，下调差异基因的显著性GO term共有504个。对这些Unigene做GO功能分类统计，主要分为三部分内容，包括生物学过程(1746个)，细胞组分(1275个)和分子功能(785个)。图3是GO分类中差异表达基因数目最显著的GO term分布图，其中，在生物学过程中主要有免疫系统过程，应激反应和信号传导，在细胞组分中主要有细胞，细胞内区域和细胞器，在分子功能中包括蛋白结合、离子结合和信号转导活性。
基因通常都有其生物学功能，KEGG通路分析能帮助我们更好地理解差异表达基因的生物学功能。通过KEGG通路分析附睾中所有差异基因(显著性筛选的标准：P<0.05)，参与KEGG注释的基因总数有4483个，其中注释为特定KEGG的具有显著性差异的基因总共有477个基因。这些差异表达基因显著性富集到100条通路中。图4是部分差异表达基因最富集的通路，其中特异注释到KEGG上的差异表达基因数最多的前3个通路分别是细胞粘附分子(CAMs)(31个),吞噬体通路(27个)和自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路(17个)。
2.6qPCR和Western blot验证
挑选了8个与生殖密切相关的基因进行qPCR验证，同时将其与RNA-seq结果进行比对，结果如图5所示。由于我们做的是相对定量qPCR，基因的表达水平与RNA-seq相比不是完全一致的，但是这些基因的表达趋势与RNA-seq结果相一致。另外，从这8个基因中挑选三个差异表达基因(Piwil2,Spata18和Tnfsf10)进行Western blot来验证它们的蛋白表达水平，结果如图6所示。同样地，将Western blot结果与RNA-seq结果进行比对，我们发现它们的上/下调变化趋势相一致。
表6用于qPCR分析的引物设计
2.7利用qPCR检测附睾组织差异表达基因来确定是否被弓形虫慢性感染
为了进一步分析这些基因在弓形虫慢性感染后附睾组织中的表达水平变化，我们用相同的方法制备了沙鼠的附睾组织样品，同时从检测到弓形虫感染的猪、犬和猫上获得其附睾组织样品，用Trizol法提取样品总RNA，用表6中的各个基因的特异性引物进行qPCR验证。反应体系、程序及计算方法同上。我们将这些基因的引物用于验证弓形虫PRU株慢性感染沙鼠的附睾组织，发现沙鼠、猪、犬和猫的检测样品中这些基因的表达变化趋势与RNA-seq也基本一致，结果如图7所示，标出的实线代表log2 (fold change)＝1，虚线代表log2 (fold change)＝-1，各检测样品的qPCR结果若大于1或小于-1，则被认为是显著性上调或下调。其中感染组中，Piwil2、Spata18、Tnfsf10、Tgtp1、Iigp1、Pgk2等6个基因表达上调，Nwd1、Spink2基因表达下调，实验结果验证了可通过检测表6中的8个与生殖密切相关的基因的表达差异来确定宿主附睾组织是否被弓形虫慢性感染。
2.8针对生殖密切相关的靶标基因的qPCR方法的检测灵敏度试验
为了进一步测试本发明提供的针对生殖密切相关的靶标基因的qPCR方法的检测灵敏度，我们将120只8周龄昆明雄性小鼠分成6组，每组20只。将弓形虫II型虫株PRU株以灌胃方式感染小鼠，每只小鼠攻入4个包囊，分别在感染后第1d、3d、6d、9d、12d和15d时取小鼠血液和附睾中的精液，采用天根试剂盒提取样品DNA。分别用中国发明专利CN106834504A中的特异性引物进行普通PCR反应、中国发明专利CN107012237A中的一对特异性引物和探针的荧光PCR反应和用与生殖密切相关的8个靶标基因进行qPCR反应进行检测。结果发现，在精液样品检测中，qPCR反应灵敏性较强，在感染后第6天时能检测出阳性样品，且阳性检出率较高，从第12天开始，阳性检出率为100％，而在普通PCR中，最早检测出阳性的时间在感染后第12天，阳性率为15％，在荧光PCR反应中，针对精子的灵敏性相对较弱，最早检测出阳性的时间在感染后第9d，阳性率为25％；血液样品中用普通PCR和荧光PCR方法检测时，也是在感染后第6天时检出，但阳性率分别为30％和65％。比较三种检测方法，用针对生殖密切相关的靶标基因的qPCR反应灵敏性好且阳性检出率高。
表7用两种方法检测弓形虫感染小鼠样品的比较
注：普通PCR检测方法来自一种猪弓形虫病的特异性检测引物和检测试剂盒(CN106834504A)；荧光PCR检测方法来自一种特异性检测弓形虫核酸的荧光PCR方法和试剂盒(CN107012237A)；—代表阴性；+代表阳性；N代表所使用的qPCR方法是针对雄性生殖系统的特异性分子标记，不能应用在血液中弓形虫的检测。
本发明提供的方法通过比较弓形虫慢性感染小鼠与健康小鼠的附睾组织，筛选出了的差异表达的基因，有助于从转录组学角度挖掘弓形虫慢性感染小鼠导致生殖损伤的机制，可为寻找生物标志物提供靶标，同时可通过检测宿主的差异表达基因来确认宿主是否感染弓形虫。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 弓形虫慢性感染雄性小鼠生殖系统靶标基因的鉴定及其在临床上的应用
<130> 2017
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcagaggcc ttgtgtttag 20
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgttttgaag gaggccggaa 20
<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttatcacgtg tggcctgctc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttaagctcct gctacggcac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgcttccaa gatggtctca 20
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acagtccgta ctcggcatct 20
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgccacgtct tctcactgtc 20
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caccaagtgg aatggtggct 20
<210> 9
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<212> DNA
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tcactatgac ttccccgtcc t 21
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgcttcagaa attgccgctt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctgtgcca acccagataa 20
<210> 12
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acagtgatgc ttggaaggct 20
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ctctttggac caccaggcat 20
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aggctcagct ttgatgtccc 20
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gcatgcccta ggaacctcaa 20
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<210> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agagaagctg tgctatgttg ct 22
<210> 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggaaccgctc gttgccaata 20

Claims (10)

1.一种应用RNA-seq技术研究弓形虫慢性感染小鼠附睾组织差异表达基因的方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)小鼠附睾组织的RNA提取；
(2)对步骤(1)所得的RNA进行文库构建和测序；
(3)对步骤(2)测序结果进行生物信息学分析，获取弓形虫慢性感染小鼠附睾组织的差异表达基因。
2.如权利要求1所述的应用RNA-seq技术研究弓形虫慢性感染小鼠附睾组织差异表达基因的方法，其特征在于，步骤(1)中，小鼠包括昆明鼠、Balb/c鼠、沙鼠中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的应用RNA-seq技术研究弓形虫慢性感染小鼠附睾组织差异表达基因的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的差异表达基因包括8个与生殖密切相关的基因，其中6个基因表达上调，记为第一检测靶标组，所述第一检测靶标组包括Piwil2、Spata18、Tnfsf10、Tgtp1、Iigp1、Pgk2，2个基因表达下调，记为第二检测靶标组，所述第二检测靶标组包括Nwd1、Spink2。
4.如权利要求1步骤(3)所述的生物信息学分析，其特征在于，所述的生物信息学分析包括以下步骤：
1)对测序原始数据进行质控，去除带接头的、ploy-N和测序引物的低质量reads，同时计算Q20、Q30、GC含量和clean reads的序列重复性，获得高质量clean reads；
2)使用序列组装程序对clean reads进行拼接，得到的转录本序列；
3)比对到数据库进行基因功能注释；
4)基因表达水平分析和差异表达基因分析，获得差异表达基因；
5)差异表达基因的Gene Ontology(GO)功能分析；
6)差异表达基因的生物通路(KEGG)功能分析。
5.如权利要求4所述的生物信息分析，其特征在于，所述的步骤4)包括：用DEGseq程序中的MARS模型计算每个基因的RPKM值，若RPKM值大于1000，认为是高表达基因，变化倍数(log2 RPKM-PRU/RPKM-Control)根据标准化的基因表达水平，统计基因的差异表达情况，筛选出的基因为显著差异表达基因。
6.如权利要求4所述的生物信息学分析，其特征在于，所述的步骤4)获取弓形虫慢性感染小鼠附睾组织的差异表达基因不低于422个，其中，表达上调的基因不低于357个，表达下调的基因不低于65个。
7.一种弓形虫感染宿主的检测方法，其特征在于，所述的检测方法以弓形虫感染宿主附睾组织差异表达基因为检测靶标，所述的差异表达基因包括8个与生殖密切相关的基因，其中6个基因表达上调，记为第一检测靶标组，所述第一检测靶标组包括Piwil2、Spata18、Tnfsf10、Tgtp1、Iigp1、Pgk2，2个基因表达下调，记为第二检测靶标组，所述第二检测靶标组包括Nwd1、Spink2；
当所述所述第一检测靶标组的至少一个表达上调，且/或第二检测靶标组的至少一个表达下调时，判断雄性宿主生殖系统感染弓形虫。
8.如权利要求7所述的弓形虫感染宿主的检测方法，其特征在于，所述的检测方法采用荧光定量PCR方法结合特异性引物对感染弓形虫的宿主附睾组织进行检测；所述的特异性引物的序列包括表6中SEQ ID NO:1～16所示。
9.如权利要求1所述的应用RNA-seq技术研究弓形虫慢性感染小鼠附睾组织差异表达基因的方法、如权利要求7所述的弓形虫感染宿主的检测方法在制备弓形虫慢性感染关联信号通路生物标志物或诊断试剂中的应用，其中，所述信号通路包括细胞凋亡通路、糖酵解通路、MAPK信号通路、细胞因子和细胞因子受体相互作用通路、胞吞通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路、吞噬体通路、细胞粘附分子通路中的一种或多种。
10.如权利要求1所述的应用RNA-seq技术研究弓形虫慢性感染小鼠附睾组织差异表达基因的方法、如权利要求7所述的弓形虫感染宿主的检测方法在制备弓形虫慢性感染关联疾病生物标志物、诊断试剂或靶向药物中的应用。
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