CN109326326A - 一种云芝木糖苷转移酶的分离及应用 - Google Patents
一种云芝木糖苷转移酶的分离及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种云芝木糖苷转移酶的分离及应用，对云芝基因组利用antismash软件进行产物分析以及糖苷转移酶同源分析，筛选潜在的目的基因；利用转录组测序分析，进一步对目的木糖苷转移酶基因进行定位；木糖苷转移酶基因的克隆、表达、分离和纯化；木糖苷转移酶功能活性鉴定。本发明的有益效果是充分利用转录组和代谢组学体系对真菌产物进行了基因定位，表达并鉴定了一种木糖苷转移酶，并对相关的酶学性质和应用进行了充分的研究。
Description
技术领域
本发明属于真菌酶学活性技术领域，涉及一种云芝木糖苷转移酶的分离及应用。
背景技术
担子菌多孔菌科能够产生各种高药用价值的次级代谢产物，其中糖苷化合物(glycosides)因具有丰富的结构多样性和显著的抗氧化、抗肿瘤、免疫等生物学活性成为近年研究热点。申请者在研究多孔菌科真菌云芝和树舌灵芝的共培养体系产物潜能，发现云芝能产生以木糖(xylose)为糖体的一系列新颖木糖苷衍生物，特别是鉴定到一个云芝来源的以PKS化合物苔色酸氨基衍生物作为糖苷配基的双木糖基衍生物C18H25NO11(图1)，具有显著抑制酵母、新型隐球菌、革兰氏阳性细菌的活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种云芝木糖苷转移酶的分离及应用，本发明的有益效果是充分利用转录组和代谢组学体系对真菌产物进行了基因定位，表达并鉴定了一种木糖苷转移酶，并对相关的酶学性质和应用进行了充分的研究。
本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：
步骤1，对云芝基因组利用antismash软件进行产物分析以及糖苷转移酶同源分析，筛选潜在的目的基因；
步骤2，利用转录组测序分析，进一步对目的木糖苷转移酶基因进行定位；
步骤3，木糖苷转移酶基因的克隆、表达、分离和纯化；
步骤4，木糖苷转移酶功能活性鉴定。
进一步，步骤1：对已测序的云芝基因组，利用生物信息学软件进行基因组扫描与预测分析，用antismash软件进行次级代谢产物基因簇的预测分析，找到与目标产物合成相关的基因簇，接着利用糖苷转移酶的同源序列比对相似度分析，对基因组内存在的与糖基转移相关的候选基因。
进一步，步骤2：选取单独液体培养的云芝菌丝球和共培养后分离的云芝菌丝球作为实验样本，分别进行转录组测序分析，分析转录组峰差异表达的基因，并进一步针对这些基因进行富集GO分析和KEGG代谢通路分析，进一步定位合成糖基转移酶相关的基因。结合步骤1的预测分析，最终确定目的合成基因。
进一步，步骤3：提取云芝基因组，利用cDNA进行目的基因的PCR克隆，利用pET表达性质粒在E.coli(DE3)宿主中构建表达木糖基转移酶的重组菌株，IPTG诱导、纯化木糖基转移酶，构建体外木糖基转移酶检测系统，利用LC-MS检测产物的生成和底物消耗，测定转移酶对不同底物(苔色酸、苯乳酸、UDP-葡萄糖等)的Km和Kcat值。
进一步，步骤4：建立木糖基转移酶的同源建模和分子对接：通过PDB数据库，搜索结构相近的蛋白质作为建模模板，利用同源建模软件(Modeller)构建并优化目标蛋白整个结构模型，并对模型进行质量检测与评估；利用Autodock将各种底物与木糖基转移酶对接，通过ZINC数据库获取底物配体结构文件，选择对接靶点和合适的对接参数，分析对接结果。
附图说明
图1是化合物结构图；
图2是云芝新颖糖苷化合物的基因簇鉴定及其苔色酸的结构域组成及生物合成分析；
图3是单培养与共培养模式下云芝差异表达基因聚类图；
图4是差异基因GO分析和KEGG分析。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
发明材料：菌株：云芝、酵母菌
实验试剂：培养基、基因组提取试剂盒、酶学实验用品等。
实验器材：恒温培养箱、摇床、蛋白电泳仪、水浴锅、超净工作台等。
实验方法：
(一)筛选潜在的木糖苷转移酶基因；
在云芝基因组中进行预测并定位代谢产物合成基因簇，找到糖苷配基苔色酸的PKS编码基因为TRAVEDRAFT_66181(orseT)(图2)，在此基础上，从该化合物的双木糖基结构特性出发，根据云芝基因组注释信息进行相关功能酶基因的挖掘，找到3个编码UDP-木糖合成酶基因及19个糖基转移酶基因，进一步对糖基转移酶基因通过CAZy数据库结构活性预测及系统进化树分析，确定其中6个潜在基因。
(二)转录组测序确定目标糖苷转移酶基因
对单培养和共培养的云芝分别进行转录组测序，比对，根据基因转录水平差异分析(图3)，从上调表达的5609个基因中，结合转录组KOG、GO、KEGG(图4)分类注释结果以及上述预测分析结果最终确定与木糖苷转移酶基因合成相关的3个基因，进一步对3个候选基因经过荧光定量PCR验证，确定目的基因为TRAVEDRAFT_31538。
(三)木糖苷转移酶的分离与纯化
提取云芝基因组，利用cDNA进行目的基因的PCR克隆，利用pET表达性质粒在E.coli(DE3)宿主中构建表达木糖基转移酶的重组菌株，IPTG诱导、纯化木糖基转移酶，构建体外木糖基转移酶检测系统，利用LC-MS检测产物的生成和底物消耗，测定转移酶对不同底物(苔色酸、苯乳酸、UDP-葡萄糖等)的Km和Kcat值。
(四)木糖苷转移酶的功能研究及应用
建立木糖基转移酶的同源建模和分子对接：通过PDB数据库，搜索结构相近的蛋白质作为建模模板，利用同源建模软件(Modeller)构建并优化目标蛋白整个结构模型，并对模型进行质量检测与评估；利用Autodock将各种底物与木糖基转移酶对接，通过ZINC数据库获取底物配体结构文件，选择对接靶点和合适的对接参数，分析对接结果。
实验结论：
1.通过组合生物信息学预测和转录组测序分析，对木糖苷转移酶基因进行定位。
2.分离到该木糖苷转移酶基因表达产物，并测定该酶对木糖的转移能力。
3.建立木糖基转移酶的同源建模和分子对接。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (5)
1.一种云芝木糖苷转移酶的分离及应用，其特征在于：
步骤1，对云芝基因组利用antismash软件进行产物分析以及糖苷转移酶同源分析，筛选潜在的目的基因；
步骤2，利用转录组测序分析，进一步对目的木糖苷转移酶基因进行定位；
步骤3，木糖苷转移酶基因的克隆、表达、分离和纯化；
步骤4，木糖苷转移酶功能活性鉴定。
2.按照权利要求1所述一种云芝木糖苷转移酶的分离及应用，其特征在于：所述步骤1：对已测序的云芝基因组，利用生物信息学软件进行基因组扫描与预测分析，用antismash软件进行次级代谢产物基因簇的预测分析，找到与目标产物合成相关的基因簇，接着利用糖苷转移酶的同源序列比对相似度分析，对基因组内存在的与糖基转移相关的候选基因。
3.按照权利要求1所述一种云芝木糖苷转移酶的分离及应用，其特征在于：所述步骤2：选取单独液体培养的云芝菌丝球和共培养后分离的云芝菌丝球作为实验样本，分别进行转录组测序分析，分析转录组峰差异表达的基因，并进一步针对这些基因进行富集GO分析和KEGG代谢通路分析，进一步定位合成糖基转移酶相关的基因，结合步骤1的预测分析，最终确定目的合成基因。
4.按照权利要求1所述一种云芝木糖苷转移酶的分离及应用，其特征在于：所述步骤3：提取云芝基因组，利用cDNA进行目的基因的PCR克隆，利用pET表达性质粒在E.coli宿主中构建表达木糖基转移酶的重组菌株，IPTG诱导、纯化木糖基转移酶，构建体外木糖基转移酶检测系统，利用LC-MS检测产物的生成和底物消耗，测定转移酶对不同底物的Km和Kcat值。
5.按照权利要求1所述一种云芝木糖苷转移酶的分离及应用，其特征在于：所述步骤4：建立木糖基转移酶的同源建模和分子对接：通过PDB数据库，搜索结构相近的蛋白质作为建模模板，利用同源建模软件构建并优化目标蛋白整个结构模型，并对模型进行质量检测与评估；利用Autodock将各种底物与木糖基转移酶对接，通过ZINC数据库获取底物配体结构文件，选择对接靶点和合适的对接参数，分析对接结果。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130260436A1 (en) * | 2010-09-14 | 2013-10-03 | Victoria Link Limited | Methods of Identifying and Characterizing Natural Product Gene Clusters |
| CN104450637A (zh) * | 2015-01-04 | 2015-03-25 | 江南大学 | 一种融合蛋白CR2-Linker-GDH及其应用 |
| CN104480080A (zh) * | 2014-11-21 | 2015-04-01 | 西北农林科技大学 | 一种重组苹果根皮苷糖基转移酶及分离纯化方法 |
| US20150152493A1 (en) * | 2012-05-24 | 2015-06-04 | Universiteit Leiden | Screening method for micro-organisms and methods for the production of a product |
| CN108060220A (zh) * | 2017-12-25 | 2018-05-22 | 华南农业大学 | 弓形虫慢性感染雄性小鼠生殖系统靶标基因的鉴定及其在临床上的应用 |
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130260436A1 (en) * | 2010-09-14 | 2013-10-03 | Victoria Link Limited | Methods of Identifying and Characterizing Natural Product Gene Clusters |
| US20150152493A1 (en) * | 2012-05-24 | 2015-06-04 | Universiteit Leiden | Screening method for micro-organisms and methods for the production of a product |
| CN104480080A (zh) * | 2014-11-21 | 2015-04-01 | 西北农林科技大学 | 一种重组苹果根皮苷糖基转移酶及分离纯化方法 |
| CN104450637A (zh) * | 2015-01-04 | 2015-03-25 | 江南大学 | 一种融合蛋白CR2-Linker-GDH及其应用 |
| CN108060220A (zh) * | 2017-12-25 | 2018-05-22 | 华南农业大学 | 弓形虫慢性感染雄性小鼠生殖系统靶标基因的鉴定及其在临床上的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 姚陆: ""云芝和树舌灵芝共培养挖掘新颖次生代谢产物"", 《万方数据》 * |
| 徐国杰: ""甘草酸生物合成相关糖基转移酶的研究"", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 农业科技辑》 * |
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