CN112195239B - 一种食管鳞癌转移组织及血清外泌体标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种食管鳞癌转移组织及血清外泌体标志物及其应用。检测hsa_circ_0081964的试剂在制备利用组织或血清外泌体诊断食管鳞癌淋巴结转移情况的试剂中的应用。一种食管鳞癌转移情况的血清外泌体辅助诊断试剂盒，包含SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的hsa_circ_0081964特异性引物。本发明提供的组织及血清外泌体circRNA检测方法和试剂盒，能够从样本中准确地检测食管鳞癌组织及外泌体has_circ_0081964，为食管鳞癌淋巴结转移情况提供方便可行的检测方法，为临床上合适的治疗方案的选择提供帮助。

Description

一种食管鳞癌转移组织及血清外泌体标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药检测领域，涉及一种食管鳞癌转移组织及血清外泌体标志物及其应用。
背景技术
我国是全世界食管癌高发国家，其发病率居我国恶性肿瘤第5位，病死率第4位，90％为食管鳞癌。目前食管癌的确诊依靠组织活检，但确诊时大多病人已是中晚期，预后较差。治疗上以手术切除和放化疗为主要手段。但手术对局部晚期食管癌患者疗效较差，放化疗对人体正常功能损伤较大。因此，建立一种微创、早期、灵敏和方便的的检测手段是必要的。
外泌体指细胞释放到细胞外环境的包含了复杂核酸、蛋白质、脂质的，直径为30-100nm脂质双膜微小膜泡，能作为信号分子在生理和病理过程中发挥着重要作用。外泌体是肿瘤微环境的重要组成部分，介导细胞间通信，参与组织浸润，转移，血管生成和耐药等肿瘤生物学过程。
circRNA是一种特殊的具有共价闭合环状结构的非编码RNA，具有疾病特异性以及组织发生、发展阶段特异性，参与肿瘤的增殖、凋亡、迁移和侵袭等多种生理和病理过程的生物调控。同时，circRNA具有高度的稳定性和保守型，且在各种组织细胞和人体体液中广泛分布。鉴于以上特点，circRNA有望成为具有前景的新型疾病分子标志物。有分析显示肿瘤组织及血清外泌体中circRNA稳定且丰富，是肿瘤诊断的理想标志物。
目前存在的问题是
(1)目前针对组织及外泌体内circRNA作为肿瘤诊断标志物的分析仅有少数报道，且大多利用高通量测序技术对组织circRNA进行表达谱分析，成本较高，可用于诊断食管鳞癌的组织及血清外泌体circRNA分子尚不清楚。
(2)传统trizol法无法保证在微量血清外泌体中提取circRNA的浓度以及纯度。
解决上述技术问题的难度:目前，急需开发一种简便的提取和检测组织及血清外泌体circRNA方法，既能保证提取的浓度和纯度较好，又能保证检测的准确性。解决上述技术问题的意义:能为食管鳞癌转移早期诊断提供新的潜在外泌体circRNA标志物和临床实验室检测方法，也能为发掘和分析更多组织及血清外泌体circRNA应用于肿瘤标志物提供帮助。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供hsa_circ_0081964作为检测靶标在制备利用组织或血清外泌体诊断食管鳞癌淋巴结转移情况的试剂中的应用。
本发明的另一目的是提供检测hsa_circ_0081964的试剂的应用。
本发明的又一目的是提供一种食管鳞癌转移情况的辅助诊断试剂盒。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
hsa_circ_0081964作为检测靶标在制备利用组织或血清外泌体诊断食管鳞癌淋巴结转移情况的试剂中的应用。
检测hsa_circ_0081964的试剂在制备利用组织或血清外泌体诊断食管鳞癌淋巴结转移情况的试剂中的应用。
所述的试剂优选hsa_circ_0081964特异性引物。
所述的hsa_circ_0081964特异性引物序列进一步优选如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。
一种食管鳞癌转移情况的血清外泌体辅助诊断试剂盒，包含SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示的hsa_circ_0081964特异性引物。
所述的试剂盒优选包含两部分：
A.血清外泌体circRNA提取试剂，包括:
(1)提取血清外泌体所需试剂:GSTM Exosome Isolation Reagent；
(2)提取外泌体circRNA所需试剂:氯仿、无水乙醇、miRNeasy Serum/Plasma Kit；
B.hsa_circ_0081964定量检测试剂：
(1)RNA逆转录试剂，
(2)qPCR试剂：包括所述的hsa_circ_0081964特异性引物及B-actin特异性引物。
一种食管鳞癌转移情况的组织辅助诊断试剂盒，包含SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的hsa_circ_0081964特异性引物。
所述的试剂盒，优选包含两部分：
A.提取组织circRNA所需试剂，包括:TrIzol Reagent、氯仿、异丙醇；
B.hsa_circ_0081964定量检测试剂：
(1)RNA逆转录试剂，
(2)qPCR试剂：包括所述的hsa_circ_0081964特异性引物及B-actin特异性引物。
有益效果：
本发明发现食管鳞癌组织及血清外泌体中has_circ_0081964对于食管鳞癌转移诊断的价值。提供的组织及血清外泌体circRNA检测方法和试剂盒，能够从样本中准确地检测食管鳞癌组织及外泌体has_circ_0081964，为食管鳞癌淋巴结转移情况提供方便可行的检测方法，为临床上合适的治疗方案的选择提供帮助。
附图说明
图1是本发明实施例提供的Nanodrop仪检测所分离的组织及血清外泌体RNA的浓度和纯度示意图。
图2是本发明实施例提供的实时荧光定量PCR检测hsa_circ_0081964和β-actin的扩增曲线及熔解曲线图。
图3是本发明实施例提供的PCR产物琼脂糖凝胶电泳示意图。
A：B-actin B：血清circRNA C：组织circRNA
图4是本发明实施例提供的实时荧光定量PCR比较食管鳞癌转移患者与非转移患者组织及血清血清外泌体hsa_circ_0081964表达差异示意图。
图5是本发明实施例提供的ROC曲线分析食管鳞癌组织(A图)及血清外泌体(B图)hsa_circ_0081964对食管鳞癌转移情况诊断的特异性和灵敏度示意图。
具体实施方式
实施例1
一种食管鳞癌转移情况的血清外泌体辅助诊断试剂盒，包含两部分：
A.血清外泌体circRNA提取试剂，包括:
(1)提取血清外泌体所需试剂:GSTM Exosome Isolation Reagent，购自吉赛公司，货号E3002；
(2)提取外泌体circRNA所需试剂:氯仿、无水乙醇、miRNeasy Serum/Plasma Kit购自QIAGNE且货号217184；
B.hsa_circ_0081964定量检测试剂：
(1)RNA逆转录试剂：Primescript RT reagent Kit，购自Takara公司，货号RR036A
(2)qPCR试剂：包括所述的hsa_circ_0081964特异性引物及β-actin特异性引物。
hsa_circ_0081964特异性引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
β-actin特异性引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
实施例2
一种食管鳞癌转移情况的组织辅助诊断试剂盒，包含两部分：
A.提取组织circRNA所需试剂，包括:TrIzol Reagent,购自赛默飞世尔公司，货号15596018、氯仿、异丙醇；
B.hsa_circ_0081964定量检测试剂：
(1)RNA逆转录试剂：Primescript RT reagent Kit，购自Takara公司，货号RR036A
(2)qPCR试剂：包括所述的hsa_circ_0081964特异性引物及β-actin特异性引物。
hsa_circ_0081964特异性引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
β-actin特异性引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
实施例3
(1)血清的采集与制备1)以血浆分离胶抗凝管采集肘静脉血5ml，采血后立即轻柔颠倒5次以充分混匀；2)室温静置30min后，以水平离心机室温3000r/min离心15min使血清与血凝块被分离胶完全分隔；3)以微量移液器将上层血清转移并分装至1.5ml进口EP管中(300μl/管)；
(2)血清外泌体沉淀与提取
加入1ml GSTM Exosome Isolation Reagent，轻柔吹打混匀；置4℃静置过夜以充分沉淀外泌体；
3)以4℃，1500g离心混合物30min，将沉淀物离心至管底；去除上清，再以4℃，1500g离心5min去除残余液体，避免触碰管底沉淀；
4)以50-250ul灭菌1xPBS重悬管底外泌体沉淀，4℃放置10min以溶解外泌体，并待进一步使用。
(3)外泌体circRNA提取
1)将上述外泌体加入600μl QIAzol裂解液，充分颠倒混匀，并在室温静置5min；加入与外泌体体积相等的氯仿，剧烈涡旋震荡15s，并放置室温静置平衡2-3min；
2)置离心机4℃，12000g离心15min；以微量移液器吸取上清至新进口EP管中，加入1.5倍体积无水乙醇,颠倒混匀；
3)先移取700μl混合液于外套有收集管的分离柱中，4℃，12000g，15s离心，弃收集管中废液，再将剩余混合液加入分离柱，重复上述操作；
4)向分离柱中加入700μl RWT溶液，4℃，12000g，15s离心，弃收集管中废液；5)再向分离柱中加入700μl RPE溶液，4℃，12000g，15s离心，弃收集管中废液；6)向分离柱中加入500μl以无RNase酶水配制的80％乙醇，4℃，12000g，2min离心，弃收集管；
5)将上述分离柱放入配套新收集管中，4℃，12000g，5min，弃收集管；将分离柱放入配套新进口EP管中，以微量移液器对准分离柱中间加入14μl无RNase酶水，静置3-5min，以充分湿润和溶解RNA；
6)以离心机4℃，12000g，5min离心收集提取和分离出的circRNA；-80℃保存或置4℃待立即使用。
(4)组织circRNA提取
1)将0.1g液氮中取出的新鲜食管鳞癌组织，放入预装1mlTrizol裂解液的EP管中，然后将EP管置于组织匀浆机，调整为30转/min，震动2min；2)加入上清体积1/5的氯仿,震荡1min使其震荡混匀,将EP管放置于离心机中，120X100g离心15min。离心后，根据离心分层(水相-白色沉淀-红色有机物)小心取出上清液加入到另一新离心管中；3)加入等体积的异丙醇，上下轻颠倒摇匀，静置10min；4)将EP管置于离心机中离心，4℃，12,000rpm，15min；5)观察是否有沉淀，加入1ml75％的乙醇后置于离心机中，7500g，4℃，离心5min。然后弃上清，将带有沉淀的EP管放置于通风橱中晾干；6)向EP管内加入DEPC水溶解，于-80℃保存。使用Nano-drop仪器检测提取的RNA浓度，测定OD260和OD280值。正常的RNA浓度范围500-1500ng/μL，OD260/OD280比值均在1.8-2.0左右。RNA的浓度如图1所示。
实施例4组织及血清外泌体hsa_circ_0081964的检测和鉴定
(1)cDNA的制备
注：在此体系中RNA模版量不应超过2.5ug，否则会影响反应的结果。
逆转录反应,条件如下：
37℃ 15min；
85℃ 5sec
4℃
(2)实时荧光定量qPCR
应用QuantStudioTM6Flex系统经行qRT-PCR实验。反应体系如下：
qRT-PCR反应体系的配制
qRT-PCR反应条件
PCR结果分析：qPCR结果显示的扩增曲线和溶解曲线如图2所示
Tris－硼酸电泳缓冲液(TBE)的贮存浓度为5xTBE缓冲液，其工作浓度为0.5xTBE缓冲液。5xTBE缓冲液的配方为，将54g Tris，27.5g硼酸，20ml pH为0.8的EDTA加入1000ml的蒸馏水中，搅拌至澄清即可。将5xTBE缓冲液稀释10倍即得到0.5xTBE缓冲液，取50ml贮存液加入450ml蒸馏水后即得到500ml工作液。
1％琼脂糖凝胶：使用电子天平称取0.5g的琼脂糖置于烧杯中，加入50ml 0.5xTBE缓冲液中搅拌，并使用微波炉加热煮沸至琼脂糖充分溶解，在溶液冷却至55度后加入EB终结者，充分溶解后铺入胶板，冷却30min。
加样后在0.5xTBE缓冲液中电泳，条件为：110V，40min.
PCR产物琼脂糖电泳示意图如图3所示。
实施例3，食管鳞癌组织及血清外泌体has_circ_0081964的临床诊断价值
本发明纳23名食管鳞癌非转移病人和31名转移病人，收集其年龄、性别、肿瘤大小、位置、分化程度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、组织学类型等基本资料，检测其组织中has_circ_0081964表达水平。同时检测13名非转移患者和14名转移患者的血清中的has_circ_0081964表达水平。
数据分析:本实验数据采用相对定量的分析方法，以β-actin为内参基因(引物序列如SEQ ID NO:4和5所示)，以△CT＝CThsa_circ_001477-CTβ-actin表示各样本检测数值，比较不同组别的差异，并以GraphPad Prism和SPSS16.0进行分析。
结果：
食管鳞癌转移患者与非转移患者组织与血清血清外泌体hsa_circ_0081964表达差异示意图如图4所示。
组织及血清外泌体hsa_circ_0081964对食管鳞癌转移情况诊断的特异性和灵敏度示意图如图5所示。
本发明提供的食管鳞癌组织及血清外泌体has_circ_0081964作为食管鳞癌诊断标志物及其应用。本发明提供了一种食管鳞癌诊断试剂盒，采用特异性circRNA引物，可以用于检测has_circ_0081964。本发明为食管鳞癌的诊断及淋巴结转移情况提供了一种方便可行的检查方法，为临床分期和治疗方案的选择提供了帮助。
序列表
<110> 江苏省肿瘤防治研究所(江苏省肿瘤医院)
<120> 一种食管鳞癌转移组织及血清外泌体标志物及其应用
<140> 2020101490183
<141> 2020-03-05
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 314
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ggttttggcc aaattgggcg agggcacaaa ataaccactt accccttctc accgaggaag 60
agcgggagaa agggtatggc acagtcacaa gggtgggtga aaagatacat caaggccttt 120
tgtaaaggct tctttgtggc ggtgcctgtg gcagtgactt tcttggatcg ggtcgcctgt 180
gtggcaagag tagaaggagc atcgatgcag ccttctttga atcctggggg gagccagtca 240
tctgatgtgg tgcttttgaa ccactggaaa gtgaggaatt ttgaagtaca ccgtggtgac 300
attgtatcat tggt 314
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgcttttga accactggaa ag 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catacccttt ctcccgctct 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaatcgtgc gtgacattaa 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaggaaggct ggaagagtg 19

Claims (7)

1.检测hsa_circ_0081964的试剂在制备利用组织或血清外泌体诊断食管鳞癌淋巴结转移情况的试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的试剂为hsa_circ_0081964特异性引物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的hsa_circ_0081964特异性引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
4.一种食管鳞癌转移情况的血清外泌体辅助诊断试剂盒，其特征在于包含SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示的hsa_circ_0081964特异性引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含两部分：
A.血清外泌体circRNA提取试剂，包括:
(1)提取血清外泌体所需试剂:GSTM Exosome Isolation
Reagent；
(2)提取外泌体circRNA所需试剂:氯仿、无水乙醇、miRNeasy Serum/Plasma Kit；
B.hsa_circ_0081964定量检测试剂：
(1)RNA逆转录试剂，
(2)qPCR试剂：包括所述的hsa_circ_0081964特异性引物及β-Actin特异性引物。
6.一种食管鳞癌转移情况的组织辅助诊断试剂盒，其特征在于包含SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示的hsa_circ_0081964特异性引物。
7.一种食管鳞癌转移情况的组织辅助诊断试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含两部分：
A.提取组织circRNA所需试剂，包括:TrIzol Reagent、氯仿、异丙醇；
B.hsa_circ_0081964定量检测试剂：
(1)RNA逆转录试剂，
(2)qPCR试剂：包括所述的hsa_circ_0081964特异性引物及B-actin特异性引物。
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