CN111876487B - 一种基于环状rna的肿瘤标志物、特异性检测引物及分子检测方法和在胃癌诊断中的应用 - Google Patents

一种基于环状rna的肿瘤标志物、特异性检测引物及分子检测方法和在胃癌诊断中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于环状RNA的肿瘤标志物、特异性检测引物及分子检测方法和在胃癌诊断中的应用，环状RNA的肿瘤标志物为circCEACAM5，其核酸全序列如SEQ ID NO:1所示；circCEACAM5正向引物的序列如SEQ ID NO:2所示，circCEACAM5反向引物的序列如SEQ ID NO:3所示；分子检测方法包括RNA提取、cDNA逆转录、qPCR检测。本发明circCEACAM5是闭合成环的单链RNA分子，其对核糖核酸酶耐受，故不易被核糖核酸酶降解，适用于不同条件下保存的临床标本的检测。由于其环状结构，检测方法特异性好，因此检测结果更加准确。

Description

一种基于环状RNA的肿瘤标志物、特异性检测引物及分子检测 方法和在胃癌诊断中的应用
技术领域
本发明涉及肿瘤分子检测技术领域。具体地说是一种基于环状RNA的肿瘤标志物、特异性检测引物及分子检测方法和在胃癌诊断中的应用。
背景技术
肿瘤标志物是肿瘤发生发展过程中特异性出现的DAN、RNA、蛋白质、代谢物等，其在血液、尿液、穿刺标本中的含量会发生改变。肿瘤标志物可以由肿瘤细胞产生，也可以由肿瘤微环境中的免疫细胞、纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等产生。因此，肿瘤标志物可以被广泛地应用于临床的肿瘤检测和诊断。
目前，临床上常用的肿瘤标志物的检测方法有放射免疫分析、化学发光免疫分析、酶联免疫吸附试验、免疫传感器、分子生物学方法、液体活检等。其中，Real time PCR(realtime polymerase chain reaction，实时荧光定量聚合酶链式反应)作为分子生物学的经典技术，它具有安全、简单、灵敏、特异、高效等优点。因此，该技术已被广泛应用于肿瘤标志物的检测，如RT-PCR
(逆转录PCR)被用于口咽癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌等肿瘤的检测。甲基化特异性PCR用于检测胃癌标志物。
circRNA(circular RNA，环状RNA)是一类闭合成环的单链RNA分子,对核糖核酸酶耐受、序列保守、表达稳定,其在各类生物和组织中的表达具有特异性，在肿瘤组织和癌旁组织中也呈差异性表达。因此circRNA是一类新型的肿瘤检测和诊断标记物。迄今，没有circRNA作为肿瘤标志物的专利报道。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种安全、简单、灵敏、特异、高效的基于环状RNA的肿瘤标志物、检测引物及其分子检测方法和在胃癌诊断中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种基于环状RNA的肿瘤标志物，环状RNA的肿瘤标志物为circCEACAM5，其核酸全序列如SEQ ID NO:1所示。
一种基于环状RNA的肿瘤标志物的特异性检测引物，包括circCEACAM5正向引物和circCEACAM5反向引物，circCEACAM5正向引物的序列如SEQ ID NO:2所示，circCEACAM5反向引物的序列如SEQ ID NO:3所示。
一种基于环状RNA的肿瘤标志物的分子检测方法，包括如下步骤：
(1)RNA的提取；
(2)cDNA逆转录：在cDNA逆转录过程中加入权利要求2所述的circCEACAM5反向引物；
(3)qPCR检测：在qPCR检测过程中加入权利要求2所述的circCEACAM5正向引物和circCEACAM5反向引物。
上述基于环状RNA的肿瘤标志物的分子检测方法，在步骤(1)中：
(1-1)取新鲜或冻存的胃癌组织块5mm3置于1.5mL的离心管中，加1mL TRIzon(Cat:15596026,Invitrogen,U.S.A.)，用组织研磨器研磨成混悬液；
(1-2)向离心管中加入200μL的氯仿，盖好盖子，用涡旋仪剧烈震荡15sec，室温放置10min；
(1-3)于4℃下，14000rpm,离心10min，样品会分成三层，转移最上层溶液约500μL至一个新的1.5mL离心管中，操作时避免触动中间层和下层溶液；
(1-4)在得到的上层液中加入等体积的异丙醇500μL，充分混匀，室温放置10min；
(1-5)于4℃下，14000rpm,离心15min，弃上清液；
(1-6)加入1mL质量分数为75％的乙醇水溶液，于4℃下，10000rpm,离心2min，弃上清液，不要吸走沉淀，质量分数为75％的乙醇由DEPC水配制；
(1-7)重复步骤(1-6)一次；
(1-8)室温放置晾干5min；
(1-9)加入适量DEPC水充分溶解RNA，测浓度后待用，或放置-80℃保存。
上述基于环状RNA的肿瘤标志物的分子检测方法，在步骤(2)中，
(2-1)取2μg步骤(1)制备的胃癌组织RNA，用GoScriptTMReverse TranscriptionKit(Cat:A2800,Promega,U.S.A.)按以下比例配制成20μL的反应体系：
RNA为2μg，Enzyme Mix为2μL，随机引物Random Primer为3μL，circCEACAM5反向引物为1μL，用无核酸酶水补足至20μL；
(2-2)将配制好的混合物充分混匀后放入PCR仪中，按以下程序进行cDNA逆转录：
25℃，5min；42℃，60min；70℃，15min；4℃，+∞。
随机引物PCR是Wllams和Welsh等于1990年建立了一种基于PCR的基因分型方法。其长度是6-10个任意指定的核苷酸，商业化的随机引物一般是6个随机的核苷酸。
随机引物的优点是：在整个转录本的多个位点退火，能产生短的、部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。适用于具有发夹构造的所有RNA(rRNA、mRNA及tRNA)的反转录反应。本申请要扩增的是circRNA和内参18S rRNA(qPCR检测中)，故选用随机引物最合适。
上述基于环状RNA的肿瘤标志物的分子检测方法，在步骤(3)中：
(3-1)使用
Figure BDA0002635266080000041
qPCR Master Mix(Cat:A6001,Promega,U.S.A.)按以下比例配制成20μL的qPCR反应体系；
2×qPCR Mix为10μL，circCEACAM5正向引物为0.4μL，circCEACAM5反向引物为0.4μL，步骤(2)中转录得到的cDNA为2μL，无核酸酶水为7.2μL；
(3-2)将配制好的混合物充分混匀后放入实时荧光定量PCR仪中，按以下程序进行qPCR检测circRNA的表达量：
阶段1：95℃，2min；
阶段2：95℃，15sec，40次循环；95℃，60sec，40次循环；
阶段3：95℃，15sec；60℃，60sec；95℃，15sec。
上述基于环状RNA的肿瘤标志物的分子检测方法，在阶段3采用溶解曲线分析环状RNA的肿瘤标志物。
一种基于环状RNA的肿瘤标志物在胃癌诊断中应用，可用于胃癌诊断、治疗效果评估或预后情况评估。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
1、本发明中的circCEACAM5是闭合成环的单链RNA分子,其对核糖核酸酶耐受，故不易被核糖核酸酶降解，适用于不同条件下保存的临床标本的检测。由于其环状结构，检测方法特异性好，因此检测结果更加准确。现有胃癌的基因检测方法，大多是针对DNA和mRNA进行qPCR检测。
2、本发明中的circCEACAM5，克服了现有肿瘤检测技术中DNA和mRNA容易被降解的缺点，具有成为疾病诊断标记物和治疗靶点的潜力。
3、在cDNA逆转录的反应体系中，加入了circCEACAM5 Reverse Primer，；在qPCR检测的反应体系中的circCEACAM5 Forward Primer和circCEACAM5 Reverse Primer的设计思路，这两点是对临床标本中circCEACAM5进行qPCR检测成败的关键步骤。
4、逆转录体系中加入反向引物，可增加cDNA中特定基因circCEACAM5的丰度，确保后续qPCR能检测到，以及检测结果的准确性；跨环化位点的引物设计思路，保证了扩增的特异性，只检测circCEACAM5的表达量，而不检测CEACAM5 mRNA的变化情况。
5、本申请的检测方法只需要逆转录2μg的总RNA，灵敏度高。简单高效，从拿到临床样本开始，经RNA提取、cDNA逆转录、qPCR检测、数据分析，整个过程不超过4小时。特异性好，只检测circCEACAM5的表达量，而不检测CEACAM5 mRNA的变化情况。
附图说明
图1CEACAM5 mRNA(3501bp)和circCEACAM5(374bp)结构示意图；图2正常胃组织和胃癌组织中检测circCEACAM5的表达情况比较图；
图3在逆转录过程中不加与加入反向引物，qPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳的比较图。
具体实施方式
1、基于环状RNA的肿瘤标志物，环状RNA的肿瘤标志物为circCEACAM5，包含374bp，其核酸全序列如SEQ ID NO:1所示。由于circRNAs比mRNA稳定，不容易被核糖核酸酶降解，适用于不同条件下保存的临床标本的检测。由于其环状结构，检测方法特异性好，因此检测结果更加准确。
2、基于环状RNA的肿瘤标志物的特异性检测引物，
Forward Primer:5’-ATTTCAGGAAGACTGATGGGC-3’，如SEQ ID NO:2所示；
Reverse Primer:5’-TGATACGCCAAGAATACTGC-3’，如SEQ ID NO:3所示。
3、一种基于环状RNA的肿瘤标志物的分子检测方法，技术方案分为RNA提取、cDNA逆转录、qPCR检测三部分。
3.1、RNA提取
(1-1)取新鲜或冻存的胃癌组织块5mm3置于1.5mL的离心管中，加1mL TRIzon(Cat:15596026,Invitrogen,U.S.A.)，用组织研磨器研磨成混悬液；本实施例中选取了31对配对的正常胃组织和胃癌组织。
(1-2)向离心管中加入200μL的氯仿，盖好盖子，用涡旋仪剧烈震荡15sec，室温放置10min；
(1-3)于4℃下，14000rpm,离心10min，样品会分成三层，转移最上层溶液约500μL至一个新的1.5mL离心管中，操作时避免触动中间层和下层溶液；
(1-4)在得到的上层液中加入等体积的异丙醇500μL，充分混匀，室温放置10min；
(1-5)于4℃下，14000rpm,离心15min，弃上清液；
(1-6)加入1mL质量分数为75％的乙醇水溶液，于4℃下，10000rpm,离心2min，弃上清液，不要吸走沉淀，质量分数为75％的乙醇由DEPC水配制；
(1-7)重复步骤(1-6)一次；
(1-8)室温放置晾干5min；
(1-9)加入适量DEPC水充分溶解RNA，测浓度后待用，或放置-80℃保存。
3.2、cDNA逆转录
(2-1)取2μg步骤(1)制备的胃癌组织RNA，用GoScriptTM Reverse TranscriptionKit(Cat:A2800,Promega,U.S.A.)按以下比例配制成20μL的反应体系：
Figure BDA0002635266080000061
(2-1)将配制好的混合物充分混匀后放入PCR仪中，按以下程序进行cDNA逆转录：
Figure BDA0002635266080000071
3.3、qPCR检测
(3-1)使用
Figure BDA0002635266080000072
qPCR Master Mix(Cat:A6001,Promega,U.S.A.)按以下比例配制成20μL的qPCR反应体系；
Figure BDA0002635266080000073
(3-2)将配制好的混合物充分混匀后放入实时荧光定量PCR仪中，按以下程序进行qPCR检测circRNA的表达量：
Figure BDA0002635266080000074
4、结果与讨论
针对所选取的31对配对的正常胃组织和胃癌组织，检测基于环状RNA的肿瘤标志物circCEACAM5的表达情况，结果发现，与正常胃组织相比，circCEACAM5在24例胃癌组织中明显高表达，7例低表达或不变，如图2所示。
同时，对比了在cDNA逆转录过程中加入circCEACAM5反向引物和不加入circCEACAM5反向引物对检测结果的影响。
如图3所示，按照上述步骤，在胃癌细胞系AGS中进行了对比实验，即逆转录时，不加circCEACAM5反向引物和加入circCEACAM5反向引物，qPCR后进行琼脂糖凝胶电泳，结果发现不加circCEACAM5反向引物，几乎检测不到条带；而加入circCEACAM5反向引物，则明显检测到相应大小的条带。
这是因为由于circCEACAM5丰度很低，如果逆转录时，不加反向引物circCEACAM5Reverse Primer，则检测不到circCEACAM5(图3)。虽然circCEACAM5丰度很低，但在大多数胃癌组织中的表达量比癌旁组织明显增多，正因为这种表达差异，才将circCEACAM5作为胃癌诊断的标志物(图2)。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 一种基于环状RNA的肿瘤标志物、特异性检测引物及分子检测方法和在胃癌诊断中的应用
<141> 2020-08-17
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 374
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggccgga cacccccatc atttcccccc cagactcgtc ttacctttcg ggagcgaacc 60
tcaacctctc ctgccactcg gcctctaacc catccccgca gtattcttgg cgtatcaatg 120
ggataccgca gcaacacaca caagttctct ttatcgccaa aatcacgcca aataataacg 180
ggacctatgc ctgttttgtc tctaacttgg ctactggccg caataattcc atagtcaaga 240
gcatcacagt ctctgcatct ggaacttctc ctggtctctc agctggggcc actgtcggca 300
tcatgattgg agtgctggtt ggggttgctc tgatatagca gccctggtgt agtttcttca 360
tttcaggaag actg 374
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atttcaggaa gactgatggg c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgatacgcca agaatactgc 20

Claims (1)

1.一种检测组织样本中环状RNA肿瘤标志物表达水平的试剂在制备胃癌诊断产品中的应用，其特征在于，所述环状RNA肿瘤标志物为circCEACAM5，其核酸全序列如SEQ ID NO:1所示；
所述试剂为特异性检测引物，所述特异性检测引物包括circCEACAM5正向引物和circCEACAM5反向引物，circCEACAM5正向引物的序列如SEQ ID NO:2所示，circCEACAM5反向引物的序列如SEQ ID NO:3所示。
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