CN108676880B

CN108676880B - 一种人血清afp阴性肝细胞癌检测试剂盒

Info

Publication number: CN108676880B
Application number: CN201810508597.9A
Authority: CN
Inventors: 涂建成; 陈珊珊; 景伟; 罗萍; 李南迪; 张献伟; 梁纯子; 邱石黎; 谭茜; 喻亚兰; 朱满; 王颖超; 刘雪芳; 周虎; 陈浩
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2018-05-24
Publication date: 2021-01-01
Anticipated expiration: 2038-05-24
Also published as: CN108676880A

Abstract

本发明公开了一种人血清AFP阴性肝细胞癌检测试剂盒。所述的联合诊断试剂盒是通过实时定量PCR技术检测MiR‑125b、MiR‑205、SPRY4‑IT1、GAS5‑AS1及circSMARCA5共5种RNA在血浆中表达量来联合诊断AFP阴性的肝细胞癌病人。本发明的试剂盒具有高灵敏度、高特异度及高准确度的特点，能够有效地诊断AFP阴性的肝细胞癌患者，实现早期肝细胞癌的辅助诊断，提高患者的生存率，具有显著地临床应用价值。

Description

一种人血清AFP阴性肝细胞癌检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以联合5种非编码RNA标志物miR-125b、miR-205、SPRY4-IT1、GAS5-AS1和circSMARCA5用于检测人血清AFP阴性肝细胞癌。

背景技术

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，死亡率在恶性肿瘤中位居第二位。原发性肝癌中85％-90％为肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。在中国，每年因HCC死亡的人数达695,900，可见HCC是威胁人类健康的主要疾病之一。肝硬化是HCC形成的最主要的危险因素，发生率为80％-90％，而导致肝硬化的主要因素是嗜肝的乙肝DNA病毒(HepatitisB virus，HBV)和丙型RNA病毒(Hepatitis C virus，HCV)的感染。HCC的死亡率在过去20年中明显增多，流行病学研究表明，在接下来的十年中HCC所带来的药物和经济方面的负担仍会显著加重。尽管现今治疗HCC的方法有极大发展，目前有手术切除，肝脏移植，辅助治疗，介入治疗等多种治疗手段，但是很多HCC在相关症状出现后才能被诊断，已经到达晚期，患者的5年生存率仅有7％。HCC术后复发和发生转移是导致生存率低的主要原因，而被早期诊断且受到合适治疗干预的HCC患者，5年生存率超过50％。

HCC的传统血清学诊断以甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)为主，但在早期HCC中单独测定AFP，漏诊率高达40％，即便在晚期患者中仍有15％-30％的血清AFP值处于正常。AFP是目前临床上最主要、应用最广泛的HCC早期筛查血清标志物，但因其在转录水平上受多种因素调控，使部分HCC患者血清AFP水平正常(<20μg/L)，即所谓的AFP阴性HCC，在小HCC(瘤体≤3cm)中尤为常见。AFP阴性HCC通常临床症状较轻且缺乏特异性，目前临床上对AFP阴性HCC的诊断主要依赖于影像学检查和其他肿瘤标志物的检测。然而AFP阴性HCC的肿瘤体积通常较小，影像学检查容易出现漏诊。并且，一些肝结节性病灶如肝硬化再生结节，肝局灶性结节增生和肝腺瘤也能出现类似HCC的影像学表现，AFP阴性HCC患者易被误诊为肝脏良性疾病，导致患者失去早期治疗的宝贵机会。有研究报道AFP阴性HCC患者CT、MRI和B超检查诊断率分别仅有50.9％、50％和10.4％。异常凝血酶原(PIVKA-Ⅱ)是HCC的新型敏感标志物，可作为AFP阴性HCC的诊断指标。目前，PIVKA-Ⅱ已在部分地区应用到HCC早期诊断检测项目中，然而只有约50％的AFP阴性HCC患者血清PIVKA-Ⅱ呈阳性结果。

鉴于目前对于AFP阴性HCC患者的诊断尚缺乏有效的检查方法，同时在慢性乙型肝炎和肝硬化患者中AFP也会出现升高的现象，无论是AFP单独或者联合PIVAK-Ⅱ检测都会出现一定比例的漏检，因此，有必要寻找建立更有效的诊断指标体系，以提高对AFP阴性HCC的检出率。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度、特异性高，可以实现血清AFP阴性HCC的诊断的非编码RNA检测试剂盒,以及提供miR-125b、miR-205、SPRY4-IT1、GAS5-AS1和circSMARCA5联合使用在制备检测血清AFP阴性HCC的试剂中的应用。

本发明为了解决上述问题提出的技术方案如下：

第一方面，提供miR-125b、miR-205、SPRY4-IT1、GAS5-AS1和circSMARCA5联合使用在制备检测血清AFP阴性HCC的试剂中的应用。

第二方面，提供一种血清AFP阴性HCC非编码RNA检测试剂盒，其检测体系包括反转录反应体系、PCR反应体系和内参体系，所述PCR反应体系中包括分别针对miR-125b、miR-205、SPRY4-IT1、GAS5-AS1和circSMARCA5的正向引物和反向引物；所述内参体系中包括miR-125b和miR-205的内参U6的正向引物和反向引物，SPRY4-IT1的内参18S的正向引物和反向引物，GAS5-AS1和circSMARCA5的内参GAPDH的正向引物和反向引物；针对所述miR-125b的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；针对所述miR-205的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；针对所述SPRY4-IT1的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；针对所述GAS5-AS1的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；针对所述circSMARCA5的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID No.21所示；miR-125b和miR-205的内参U6的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；SPRY4-IT1的内参18S的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；GAS5-AS1和circSMARCA5的内参GAPDH的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示。

优选地，用于配制所述PCR反应体系的试剂包括SYBR Green混合液、正向引物液、反向引物液和纯水；用于配制所述反转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚合酶、反转录酶混合液、反转录缓冲液和无核酸酶纯水。

进一步地，上述PCR反应体系的总体积为20μL；其中，所述SYBR Green混合液的体积是10μL，所述正向引物液的体积是0.8μL，所述反向引物液的体积是0.8μL，所述cDNA模板1μL,其余是纯水；所述正向引物液的使用浓度为10μM，所述反向引物液的使用浓度为10μM；所述DNA模板是所述反转录反应体系反应后的产物稀释10倍获得的。

本发明提供的一组用于人血清AFP阴性的HCC诊断的标志物，包括miR-125b(SEQID NO.1)、miR-205(SEQ ID NO.2)、SPRY4-IT1(SEQ ID NO.3)、GAS5-AS1(SEQ ID NO.4)和circSMARCA5(SEQ ID NO.5)。

本发明具有积极的效果：

(1)miR-125b、miR-205、SPRY4-IT1、GAS5-AS1和circSMARCA5联合使用作为组合分子标记物，经过大数据临床验证实验，在HCC的辅助诊断指标方面具有突出优势。这五个分子标记物首次应用于HCC非编码RNA检测试剂盒的开发，该HCC非编码RNA检测试剂盒运用实时荧光定量PCR方法，可以实现早期HCC的辅助诊断，提高患者的生存率。

(2)本发明的血清AFP阴性HCC非编码RNA检测试剂盒选择了miR-125b、miR-205、SPRY4-IT1、GAS5-AS1和circSMARCA5这五个非编码RNA标记物进行组合，用于区分血清AFP阴性HCC和正常人，其诊断效能AUC可达到0.985，敏感度和特异度分别为92.8％和96.6％。相比较于目前基于大样本，多中心的研究发现的异常凝血酶原(PIVKA-Ⅱ)鉴别AFP阴性HCC与正常人的诊断效能AUC为0.856，灵敏度和特异度分别为76.3％和89.1％，5种非编码RNA更具有优势。

(3)通过诊断软件medcalc分析还发现，联合上述5种非编码RNA的诊断效能显著高于上述单一标志物(P<0.001)。

(4)本发明miR-125b、miR-205、SPRY4-IT1、GAS5-AS1和circSMARCA5联合使用作为组合分子标记物，还可用于区分血清AFP阴性HCC和健康对照血浆，其诊断效能AUC可达到0.985，敏感度和特异度分别为92.8％和96.6％。

附图说明

图1为ROC分析miR-125b对血清AFP阴性的HCC病人的诊断价值。

图2为ROC分析miR-205b对血清AFP阴性的HCC病人的诊断价值。

图3为ROC分析SPRY4-IT1对血清AFP阴性的HCC病人的诊断价值。

图4为ROC分析GAS5-AS1对血清AFP阴性的HCC病人的诊断价值。

图5为ROC分析circSMARCA5对血清AFP阴性的HCC病人的诊断价值。

图6为ROC分析本发明的五种RNA(miR-125b、miR-205、SPRY4-IT1、GAS5-AS1和circSMARCA5)联合诊断血清AFP阴性的HCC。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。【实施例1】血浆RNA的提取

收集HCC(HCC)病人及健康对照组血浆，其中HCC 59例(年龄：55±9；性别：55男，4女)，其血清AFP均低于20ng/ml，健康对照72例(年龄：52±10；性别：65男，7女)。提取血浆中的总RNA。采用北京百泰克生物技术有限公司的RNA提取试剂盒(RP4002)，按照试剂盒说明书进行操作。简述如下：①将EDTA的抗凝全血置于低温离心机中，4℃，2000×g离心5min。分离血浆和血细胞。②小心吸取上层血浆，转移到1.5ml的Rnase-free EP管中。注意此步骤要避免吸到中间白膜层，其中含有白细胞和血小板，会造成血浆外来源的RNA的污染。③将Rnase-free离心管中的血浆重新置入低温离心机中，4℃，12000×g离心5min。此操作为了尽可能去除细胞碎片。④离心结束后，再次小心吸取上层血浆上清转移到新的1.5ml的Rnase-free EP管中。通常2ml的全血可以通过离心收集到0.9ml左右的血浆。分离得到的血浆可立即用于总RNA的提取，也可以保存于-80冰箱中备用。⑤在第一次使用此RNA提取试剂盒时，首先在70％乙醇和漂洗液RW瓶中加入指定量的无水乙醇。接着，每0.25ml液体样本中加入0.75ml的裂解液RLS，加样枪反复吹打混匀。⑥将上述混合物涡旋混匀，在室温条件放置5min。然后放入低温离心机中，4℃条件下，12000rpm离心10min。小心吸取上层上清，转移到一个新的Rnase-free的EP管中。⑦按照裂解液和氯仿5:1的比例加入氯仿。涡旋剧烈震荡15s，由于氯仿易挥发，并具有毒性，因此实验中要注意将EP管盖盖紧。然后将混合物置于室温中孵育3min。接着，将混合物置于低温离心机中，4℃条件下，12000rpm离心10min。此时可以观察到样品可以分为上中下三层。小心将上层水相转移到一个新的EP管中(约500μl)。然后将一倍体积的乙醇加入上层水相中，反复颠倒混匀。此时混合物一般可以观察到变浑浊出现沉淀。然后将该混合物加入吸附柱中。室温12000rpm离心1min。弃去废液后，将吸附柱重新置于收集管中。将500μl的去蛋白液RE加入吸附柱中，室温12000rpm离心1min。弃掉废液。⑧将500μl的漂洗液RW加入吸附柱中，室温12000rpm离心1min。弃去废液。注意此操作中要确认漂洗液RW已加入无水乙醇。将漂洗液RW重新加入吸附柱中。室温12000rpm离心1min。弃去废液。⑨将吸附柱RA转移到一个新的收集管中，根据血浆总RNA的在吸附膜中央部位加入30-50μl RNase free水，此步骤注意小心操作，避免枪头将吸附膜刺破。此外，尽量将无RNA酶水提前放入65℃水浴锅中预热。然后室温放置2min，室温12000rpm离心1min。如果收集到的血浆总RNA较多，可将洗脱液重新加入吸附膜上，再洗脱一次。可以提高RNA的回收率。

【实施例2】逆转录

取1μg总RNA进行逆转录，采用Takara(大连宝生物技术有限公司)PrimeScript^TMRTreagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行，按试剂商推荐的步骤进行，简述如下：①在冰盒中配制反应试剂，反应体系如表1：

表1逆转录第一步体系

混匀后将反应组分离心至管底。②42℃孵育2min后，重新将EP管置于冰上，加入以下反应组分：

表2逆转录第二步体系

混匀后，将反应组分点离至管底。③将反应液置于PCR仪中，首先37℃反应15min，然后85℃反应5s。逆转录实验完成。④本实验逆转录的第一链cDNA可立即用于荧光定量PCR扩增实验，也可置于-20℃冰箱中保存。如需长期保存，需将样本置于-80℃冰箱中。

【实施例3】实时荧光定量PCR

1、用实施例3获取的cDNA样品稀释10倍分别配置实时荧光定量PCR体系。体系配置如表3：

表3荧光定量PCR反应体系

2、上表中的检测目的非编码RNA及对应的内参引物序列分别如表4：

表4正向引物和反向引物特征表

3、将配置好的qRT-PCR溶液加入实时荧光定量PCR仪(Bio-Red)中进行反应，上表中的检测目标RNA的反应条件分别为表5所示：

表5荧光定量PCR条件

4、数据统计：本发明通过IBMSPSS Statistics21进行数据统计分析，通过ROC曲线评价标志物的诊断价值，通过logistic回归分析本发明试剂盒涉及的5种血浆RNA对血清AFP阴性的HCC病人的联合诊断的价值。

5、结果分析：按照本发明的上述方法统计分析发现：

①miR-125b对血清AFP阴性的肝细胞癌病人的具有一定的诊断价值(图1)，即当△Ct值≤-1.17时判为阳性(即为肝细胞癌患者)，反之为阴性。具体灵敏度和特异度如表6。

②miR-205对血清AFP阴性的HCC病人的诊断价值如图2，即当△Ct值≤-1.19时判为阳性(即为肝细胞癌患者)，反之为阴性。具体灵敏度和特异度如下表6。

③SPRY4-IT1对血清AFP阴性的HCC病人的诊断价即当△Ct值≥4.125时判为阳性(即为肝细胞癌患者)，反之为阴性。值如图3，具体灵敏度和特异度如下表6。

④GAS5-AS1对血清AFP阴性的HCC病人的诊断价值如图4，即当△Ct值≤-0.295时判为阳性(即为肝细胞癌患者)，反之为阴性。具体灵敏度和特异度如下表6。

⑤circSMARCA5对血清AFP阴性的HCC病人的诊断价值如图5，即当△Ct值≤0.095时判为阳性(即为肝细胞癌患者)，反之为阴性。具体灵敏度和特异度如下表6。

⑥当联合本发明研究的5种非编码RNA作为HCC的诊断指标时,其Logistics回归模型为预测概率值Y＝156.03-137.21×A_miR-125b+245.49×B_miR-205+46.358×C_SPRY4-IT1+650.02×D_GAS5-AS1-41.35×E_circSMARCA5，其中A_miR-125b是miR-125b的表达量(2^-△△CT值)，B_miR-205是miR-205的表达量(2^-△△CT值)，C_SPRY4-IT1是SPRY4-IT1的表达量(2^-△△CT值)，D_GAS5-AS1是GAS5-AS1的表达量(2^-△△CT值)，E_circSMARCA5是circSMARCA5的表达量(2^-△△CT值)，提示当Y值≥0.481时，即预测概率值大于或者等于0.481时判为阳性(即为肝细胞癌患者)，反之为阴性。相对于使用单个的检测指标，其诊断价值显著提高(图6)，具体灵敏度和特异度如下表6。

表6ROC曲线下的面积及灵敏度和特异度

序列表

<110> 武汉大学

<120> 一种人血清AFP阴性肝细胞癌检测试剂盒

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 88

<212> RNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

ugcgcuccuc ucagucccug agacccuaac uugugauguu uaccguuuaa auccacgggu 60

uaggcucuug ggagcugcga gucgugcu 88

<210> 2

<211> 110

<212> RNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

aaagauccuc agacaaucca ugugcuucuc uuguccuuca uuccaccgga gucugucuca 60

uacccaacca gauuucagug gagugaaguu caggaggcau ggagcugaca 110

<210> 3

<211> 703

<212> RNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

guagagaugg ggguuucauc cuguugguca ggcuggucuu gaacuccuga ccucaaguga 60

ucugccuacc uuggccuccc aaaaggcuga gauuacaggc augagccacu gcgccaggcc 120

uucuuucuuu ucuuuuuuuc uuucuuuuuu uuuuugagac aucauuuagc ugugcugagg 180

gguucuuaaa uaggcagcuc agaaaauugu uuuccuuugu cagccacaua aauucagcag 240

aggcucuugg agggucccug cuggugaggg gugaggccag caguggaacu cugauuuggu 300

uuuugcugag cuggugguug aaaggaaucc uacuacaucg ggguuauaau agggaagaua 360

cauuuuagaa uaugcccagu ggagccaucg gaugcugcau cguccccaga gagccaaguc 420

aucgugggcc aagcucccau ccccaugucu ggccucaacu gcaggcccag auguugacag 480

cugccucugg aggguuaugg gagccuguga augccaacau ccccauugcc ugcagcggcu 540

gcucccaucc uggcuuccug gugggacuuu uccaugaauu ggggaaucug cuuucugauu 600

ccaaggccua uuaaaauuuc ugagcauugc ccauuucuuu ugcuuuaucu guaggacaug 660

ggcuguuuuu aaagaaccuc acaaaugaaa aaaaaaaaaa aaa 703

<210> 4

<211> 702

<212> RNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

caaaaaaagg aaaauucaga gaguaacuga aguuuuauca uuaaugggac uaaagugcuu 60

uagcccagaa acagauuugu aaaaccauua cugcuaacaa agacaucauu auaagcacag 120

cuguacugac acugaaauua aaauuugacc caucuuggaa uuuuggcccc uugguccugu 180

uucccuggga cagauugccu uaaaccaguu gugcccuuua uacccacuuu uggcaucccu 240

aaacacuuag ugcuugccaa aaaccuauca ccauggcuau ggauuguaga uuuucccaau 300

uccauuaaug ccuaucacua guugggcauu ucuauaguau uuucuauaac uuauuuuccc 360

agccucagac ucaacaugac uuucuccaag uagcuccauc aauacuuuaa gcucaaaacc 420

aauuagcaca ggggccuaug aaaccugaca auuugcucau auggagaauu aggaaauauu 480

gcacuuuaau gcauaagaca ccuuguaaaa uacccauaaa auuuuaacug gcugcagugu 540

uaaugaagca aauaccaugg aguuauaaua gcuuuugaau gugauuuaug cuuacagcua 600

augaacagau gaaaagcacu guccuuuuuu aaguaaacac uacacacucc agauggauug 660

caaaaauuua uuaaaauugg agacacuguu uuaaaaaaaa aa 702

<210> 5

<211> 258

<212> RNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

ggaggcuugu ggaucagaau cugaacaaaa uugggaaaga ugaaaugcuu caaaugauua 60

gacauggagc aacacaugug uuugcuucaa aggaaaguga gaucacugau gaagauaucg 120

augguauuuu ggaaagaggu gcaaagaaug aaugaaaagc ucuccaagau gggcgaaagu 180

ucacuuagaa acuuuacaau ggauacagag ucaaguguuu auaacuucga aggagaagac 240

uauagagaaa aacaaaag 258

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcagtatccc tgagacccta ac 22

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgcagggtc cgaggtat 18

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcttcggcag ctaaaat 17

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgcttcacga atttgcgtgt cat 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcagtcatcc ttcattccac c 21

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtgcagggtc cgaggtat 18

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtttttgctg agctggtggt t 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggctccac tgggcatatt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cagccacccg agattgagca 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tagtagcgac gggcggtgtg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tcccagcctc agactcaaca 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtttcatagg cccctgtgct 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agaaggctgg ggctcatttg 20

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcaggaggca ttgctgatga t 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

caagatgggc gaaagttcac t 21

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgtgttgctc catgtctaat catt 24

Claims

1.特异性检测miR-125b、miR-205、SPRY4-IT1、GAS5-AS1和circSMARCA5表达水平的物质在制备联合检测血清AFP阴性肝细胞癌的试剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测miR-125b、miR-205、SPRY4-IT1、GAS5-AS1和circSMARCA5表达水平的物质为实时荧光定量PCR检测试剂；所述实时荧光定量PCR检测试剂包括反转录反应体系、PCR反应体系和内参体系，所述PCR反应体系中包括分别针对miR-125b、miR-205、SPRY4-IT1、GAS5-AS1和circSMARCA5的正向引物和反向引物；所述内参体系中包括miR-125b和miR-205的内参U6的正向引物和反向引物，SPRY4-IT1的内参18S的正向引物和反向引物，GAS5-AS1和circSMARCA5的内参GAPDH的正向引物和反向引物；针对所述miR-125b的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6 所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7 所示；针对所述miR-205的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10 所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11 所示；针对所述SPRY4-IT1的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13 所示；针对所述GAS5-AS1的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16 所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；针对所述circSMARCA5的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.20 所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.21 所示；miR-125b和miR-205的内参U6的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8 所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9 所示；SPRY4-IT1的内参18S的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；GAS5-AS1和circSMARCA5的内参GAPDH的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.19 所示；实时荧光定量PCR检测结果的判断公式为：

Y = 156.03 - 137.21 × A_miR125b+ 245.49 × B_miR205 + 46.358 × C_SPRY4-IT1+650.02 × D_GAS5-AS1- 41.35 × E_circSMARCA5，

其中，A_miR125b是miRNA125b的表达量 2^-△△CT值，B_miR205是miR-205的表达量 2^-△△CT值，C_SPRY4-IT1是SPRY4-IT1的表达量 2^-△△CT值，D_GAS5-AS1是GAS5-AS1的表达量2^-△△CT值，E_circSMARCA5是circSMARCA5的表达量 2^-△△CT值，提示当Y值≥ 0.481时，判为阳性；反之为阴性。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述反转录反应体系包括多聚腺苷酸聚合酶、反转录酶混合液、反转录缓冲液和无核酸酶纯水。