CN111826443A - 血清外泌体微小RNAs的应用和肝癌检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,涉及血清外泌体微小RNAs的应用和肝癌检测试剂盒。所述试剂盒包括检测物,所述检测物包括:与血清外泌体微小RNA hsa‑miR‑203b‑5p特异性结合的检测物;与血清外泌体微小RNA hsa‑miR‑219a‑2‑3p特异性结合的检测物;与血清外泌体微小RNA hsa‑miR‑4661‑5p特异性结合的检测物。本发明通过抽取人的血液并对其中的血清外泌体hsa‑miR‑203b‑5p、hsa‑miR‑219a‑2‑3p和hsa‑miR‑4661‑5p进行测量就可以实现肝癌的无创、非侵袭性筛查或者诊断,操作简单方便,具有较高特异性和敏感性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,更具体地,涉及血清外泌体微小RNAs作为肝癌生物标志物在制备肝癌检测试剂、肝癌检测试剂盒或者肝癌检测装置中的应用,以及一种基于血清外泌体微小RNAs的肝癌检测试剂盒。
背景技术
原发性肝癌是世界范围内常见的高发病率、高致死率的恶性肿瘤之一,其中肝细胞性肝癌(简称肝癌,Hepatocellular Carcinoma,HCC)占原发性肝癌的85%~90%以上。根据美国癌症协会(ACS)2018年针对185个国家的36种癌症统计,肝癌的新增病例数为84.1万,位居全球第7位,死亡人数为78.2万,位居全球第3位,其中,中国肝癌的新发病例及死亡病例均约占全球病例的一半,并且在全国新增癌症病例中排名第4位,死亡病例中排名第2位。由于缺乏高效、灵敏和特异性强的肝癌早期检测方法或技术,导致60%~70%的肝癌患者诊断时已处于中晚期,从而错失根治性切除机会。因此,肝癌的早期检测、早期诊断和早期治疗是提高肝癌患者生存率、降低肝癌死亡率最有效的途径之一。
目前,临床上应用比较成熟的肝癌早期检测手段主要有依赖于影像学的检测手段和肿瘤生物标志物的检测手段等。在影像学检测方面,虽然许多医院和体检机构等已经拥有较为精密的仪器设备,例如电脑断层扫描,磁共振成像或者血管摄影等,但是影像学检测一般价格比较昂贵并且具有放射性或者侵袭性等,从而难以实现全覆盖式普及。在肿瘤生物标志物方面,主要有甲胎蛋白(AFP)、C反应性蛋白(CRP)和去羧凝血酶原(DCP)等,该类检测手段虽然比较有效,具有无创、非侵袭性,但是,它们的检测灵敏度和特异性比较差,其中,约有35%~50%肝癌患者的AFP水平低于警戒值(20ng/mL),而且,AFP在早期肝癌筛查中的检出率仅为22%。因此,探究新型、高灵敏度、高特异性,并且价格低廉又易于检测的肝癌早期诊断标志物具有重要的临床意义。
微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一类内源性、非编码、具有调控功能的单链小RNAs,长度约为18~25个核苷酸,miRNAs在肿瘤的发生与调控方面发挥着重要的作用。近年来,大量的研究发现,在人体血液、唾液和尿液等多种体液中能够检测到大量外泌体包裹的miRNAs,该类miRNAs具有组织、细胞特异性,并且与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移等密切相关。因此,外泌体miRNAs可以作为潜在的肿瘤生物标志物用于肿瘤的早期检测或诊断。
发明内容
本发明的目的是提供新的可以作为潜在肿瘤生物标志物的外泌体miRNAs。本发明通过实验研究发现,与健康人相比,肝癌患者血清外泌体hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p均存在显著性高表达(P<0.05)。因此,基于这三种肿瘤生物标记物的肝癌诊断或筛查具有重要的临床意义。
具体地,本发明的第一方面提供血清外泌体微小RNAs作为肝癌生物标志物在制备肝癌检测试剂、肝癌检测试剂盒或者肝癌检测装置中的应用,其中,所述血清外泌体微小RNAs为以下三种微小RNA的组合:hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p。
hsa-miR-203b-5p的序列:5’-UAGUGGUCCUAAACAUUUCACA-3’(SEQ ID NO:5),hsa-miR-219a-2-3p的序列:5’-AGAAUUGUGGCUGGACAUCUGU-3’(SEQ ID NO:6),hsa-miR-4661-5p的序列:5’-AACUAGCUCUGUGGAUCCUGAC-3’(SEQ ID NO:7)。
外参cel-miR-39-3p的序列:5’-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’(SEQ ID NO:8)。
本发明的第二方面提供一种基于血清外泌体微小RNAs的肝癌检测试剂盒,所述试剂盒包括检测物,所述检测物包括:
与血清外泌体微小RNA hsa-miR-203b-5p特异性结合的检测物;
与血清外泌体微小RNA hsa-miR-219a-2-3p特异性结合的检测物;
与血清外泌体微小RNA hsa-miR-4661-5p特异性结合的检测物。
根据本发明,所述检测物可以为任何能够与外泌体微小RNA特异性结合的物质,例如,可以为核酸。作为PCR扩增的引物实现检测。
根据本发明一种优选实施方式,所述检测物包括:
第一正向引物,针对所述hsa-miR-203b-5p逆转录后得到的cDNA设计:5’-TAGTGGTCCTAAACATTTCACA-3’(SEQ ID NO:1)
第二正向引物,针对所述hsa-miR-219a-2-3p逆转录后得到的cDNA设计:5’-AGAATTGTGGCTGGACATCTGT-3’(SEQ ID NO:2)
第三正向引物,针对hsa-miR-4661-5p逆转录后得到的cDNA设计:5’-AACTAGCTCTGTGGATCCTGAC-3’(SEQ ID NO:3)
外参cel-miR-39-3p正向引物,针对外参cel-miR-39-3p逆转录后得到的cDNA设计:5’-TCACCGGGTGTAAATCAGCTTG-3’(SEQ ID NO:4)
通用反向扩增引物。
本发明中所述通用反向扩增引物的含义能够为本领域技术人员理解,是指能够与模板基因序列识别,并与前述任意正向引物一起都可以扩增得到一段预定长度产物的引物。所述通用反向扩增引物可根据常规的引物设计方法得到,也可以直接采用商品化的引物,例如,商品化反转录试剂盒中的通用反向扩增引物。根据本发明一种具体实施方式,所述反转录试剂盒中的通用反向扩增引物为Clontech公司Mir-X miRNA First-StrandSynthesis Kit(Code No.638315)中mRQ 3’Primer。
根据本发明,所述试剂盒还可以包括外泌体分离试剂、外泌体纯化试剂、阴性对照品、阳性对照品和RNA提取试剂中的至少一种。
本发明通过抽取人的血液并对其中的血清外泌体hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p进行测量就可以实现肝癌的无创、非侵袭性筛查或者诊断,操作简单方便,具有较高特异性和敏感性。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述,本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为通过对5例健康人和5例肝癌患者血清外泌体微小RNAs进行高通量测序得到的hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p表达差异倍数(Fold Change)图。(*表示P<0.05,**表示P<0.01)
图2a-2c示出了通过qRT-PCR方法对8例健康人和8例肝癌患者血清外泌体中hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p的差异性表达进行验证的结果,其中ΔCt=Ct肝癌患者-Ctcel-miR-39-3p或ΔCt=Ct健康人-Ctcel-miR-39-3p(cel-miR-39-3p为外参,使用F检验和T检验)。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式,然而应该理解,可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例1
抽取受试者血液样本,离心后获得血清,并向血清中加入3.5fmole的cel-miR-39-3p,再利用超高速离心技术提取血清中的外泌体,然后用试剂盒法提取外泌体中总miRNAs,并用qRT-PCR方法对其中的三种靶标miRNAs(hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p)和外参miRNA(cel-miR-39-3p)进行检测。获取外泌体后利用miRNeasySerum/Plasma Kit试剂盒(购自Qiagen,Hilden,Germany)提取总miRNAs。使用Nano Drop超微量核酸定量光谱仪检测miRNAs质量和浓度后,利用Mir-XTMmiRNA First-StrandSynthesis and TB GreenTM试剂盒(购自Clontech Laboratories,美国)合成cDNAs,并使用PCR试剂盒(2×SYBR Green qPCR Master Mix,购自bimake,美国)对hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-4661-5p和cel-miR-39-3p的表达量来进行检测。
(1)血清样本制备(不含抗凝剂)
①抽取健康人和肝癌患者的全血。
②4℃条件下静置3~4小时,可见血块析出(也可放置4℃过夜)。
③2000rpm、4℃离心5分钟,可见淡黄色血清。
④将血清分装,冻存于-80℃待用。
(2)使用超高速离心技术提取血清中外泌体
①用等体积磷酸盐缓冲液(PBS,1~2mL)稀释血清,并转移至离心管,4℃、2,000g,离心30分钟。
②将上清液转移到超速离心管中。4℃、12,000g,离心45分钟。
③将上清液转移到超速离心管中。4℃、110,000g,离心2小时。
④将沉淀重悬于1mL PBS中,通过0.22μm过滤器过滤悬浮液,并收集至新的超速离心管中。4℃、110,000g,离心70分钟,弃上清液。
⑤将沉淀重悬于PBS中。4℃、110,000g,离心70分钟,弃上清液。
⑥将沉淀重悬于200μL PBS中,冻存于-80℃待用。
(3)外泌体miRNAs提取以及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)反应
①使用miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒提取肝癌患者和健康人血清外泌体中的总miRNAs。
②使用Nano Drop超微量核酸定量光谱仪对miRNAs进行质量检测。
③使用Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis试剂盒对分离出的miRNAs进行逆转录得到cDNAs,逆转录反应体系如下表2所示。
表2
试剂 | 用量(μL) |
mRQ缓冲液(2×) | 5 |
miRNAs样品 | 3.75 |
mRQ酶 | 1.25 |
总体积 | 10 |
miRNAs逆转录反应体系,反应条件为:37℃,1小时,85℃,5分钟,保存于4℃待用。
④使用2×SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒对miRNAs进行定量分析。定量的反应体系如下表3所示,引物序列信息如表4所示。
表3
试剂 | 用量(μL) |
2×SYBR Green qPCR Master Mix | 10 |
ROX Reference Dye(50×) | 0.4 |
miRNAs正向引物(10μM) | 1 |
mRQ 3’primer(引物)/反向引物(10μM) | 1 |
cDNAs | 2 |
ddH<sub>2</sub>O | 5.6 |
总体积 | 20 |
表4
qRT-PCR反应体系,反应条件为:95℃,30秒,1个循环;95℃,15秒,60℃,30秒,72℃,30秒,40个循环;95℃,15秒,60℃,60秒,95℃,15秒,1个循环。
图1为通过对5例健康人和5例肝癌患者血清外泌体微小RNAs进行高通量测序得到的hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p表达差异倍数(Fold Change)图,(*表示P<0.05,**表示P<0.01)。测序结果显示hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p在肝癌患者和健康人血清外泌体中的表达差异性较大,因此,hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p的表达量与肝癌的发生和发展具有较高相关性。
使用qRT-PCR技术针对8例健康人和8例肝癌患者血清外泌体中这三种miRNAs的差异性表达进行再次验证,结果与小RNAs高通量测序一致。图2a-2c示出了通过qRT-PCR方法对8例健康人和8例肝癌患者血清外泌体中hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p的差异性表达进行验证的结果,其中ΔCt=Ct肝癌患者-Ctcel-miR-39-3p或ΔCt=Ct健康人-Ctcel-miR-39-3p(cel-miR-39-3p为外参,使用F检验和T检验)。可见,通过对血清外泌体hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p进行检测能够应用于肝癌的筛查和诊断。
基于上述三种肿瘤生物标志物研发的肝癌检测试剂盒具有较高的敏感度和特异性,并且仅需要对hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p三种miRNAs进行测量就可以实现对肝癌的检测或诊断,因此,基于这三种外泌体miRNAs的肝癌诊断试剂盒操作简便且高效。
以上已经描述了本发明的各实施例,上述说明是示例性的,并非穷尽性的,并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下,对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 清华大学深圳国际研究生院
深圳市坤健创新药物研究院
<120> 血清外泌体微小RNAs的应用和肝癌检测试剂盒
<130> BJI2000625SZKJ
<141> 2020-07-03
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tagtggtcct aaacatttca ca 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
agaattgtgg ctggacatct gt 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aactagctct gtggatcctg ac 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tcaccgggtg taaatcagct tg 22
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
uagugguccu aaacauuuca ca 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
agaauugugg cuggacaucu gu 22
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
aacuagcucu guggauccug ac 22
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
ucaccgggug uaaaucagcu ug 22
Claims (7)
1.血清外泌体微小RNAs作为肝癌生物标志物在制备肝癌检测试剂、肝癌检测试剂盒或者肝癌检测装置中的应用,其中,所述血清外泌体微小RNAs为以下三种微小RNA的组合:hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p。
2.一种基于血清外泌体微小RNAs的肝癌检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括检测物,所述检测物包括:
与血清外泌体微小RNA hsa-miR-203b-5p特异性结合的检测物;
与血清外泌体微小RNA hsa-miR-219a-2-3p特异性结合的检测物;
与血清外泌体微小RNA hsa-miR-4661-5p特异性结合的检测物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其中,所述检测物为核酸。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其中,所述检测物包括:
第一正向引物:5’-TAGTGGTCCTAAACATTTCACA-3’(SEQ ID NO:1)
第二正向引物:5’-AGAATTGTGGCTGGACATCTGT-3’(SEQ ID NO:2)
第三正向引物:5’-AACTAGCTCTGTGGATCCTGAC-3’(SEQ ID NO:3)
外参cel-miR-39-3p的正向引物:5’-TCACCGGGTGTAAATCAGCTTG-3’(SEQ ID NO:4)
通用反向扩增引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其中,所述通用反向扩增引物为反转录试剂盒中的通用反向扩增引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其中,所述反转录试剂盒中的通用反向扩增引物为Clontech公司Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit中mRQ 3’Primer。
7.根据权利要求2所述的试剂盒,其中,所述试剂盒还包括外泌体分离试剂、外泌体纯化试剂、阴性对照品、阳性对照品和微小RNAs提取试剂中的至少一种。
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