JP2021501885A - 細胞解析におけるか細胞解析に関連する改善 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞解析に関する。特定の非限定的な態様では、本発明は、組織試料の診断方法および予後診断方法ならびに/または細胞解析に関する。例えば、本発明は、医学的状態または治療状態の診断、予後診断、またはモニタリングのための解析方法を提供する。
以下の背景技術の考察は、本発明の理解を容易にすることのみを意図する。この考察は、参照された任意の資料が本出願の優先日時点の一般知識の一部である、または一部であったことを了承または承認するものではない。
本発明者らは、医学的状態または治療状態を診断、予後診断、またはモニタリングするための細胞解析の改良された「免疫フローFISH」技術を開発することによって、先行技術の1つまたは複数の欠点に対処しようとした。
a.フローサイトメトリーの免疫表現型検査を使用して細胞集団の抗原プロフィールに基づいて解析すべき細胞集団を選択する工程、および
b.イメージングフローサイトメトリーの結果から、その正確な表現型によって同定されたこれらの特定の細胞中のFISHプローブのシグナルをカウントする工程
を含む。
a.解析すべき細胞集団を選択し、細胞集団の抗原プロフィールを、フローサイトメトリーを使用して前述の集団を免疫表現型検査することによって解析して、測定または評価されるべき前述の状態に関連する1つまたは複数の生物学的マーカーまたはパラメーターの有無を検出する、選択および解析する工程、および
b.前述の集団を前述の細胞を可視化してカウントすることが可能な少なくとも1つのFISHプローブに供して、特定の細胞をその正確な表現型によって同定し、表現型によって同定された細胞のゲノム異常を同定する、FISHプローブに供する工程
を含む、方法にある。
a.単一の高処理イメージングフローサイトメトリープラットフォームでインタクトな新生物細胞全体の形態、表現型、および遺伝子型の全体的な評価が可能であること;
b.現在のマニュアルFISH法(1〜3%細胞)より感度が高いこと(1:10,000細胞超);
c.現在のマニュアルFICTION法より迅速であること(特に、総じてインタクトな細胞を評価する場合に迅速かつ正確である)こと。FICTIONは、免疫表現型として間違った結果を生じる可能性があり、FISHは、3〜4umの組織切片で実施される。試験が全細胞を評価するのではなく、その「スライス」を評価するので、これにより誤った結果を生じる可能性がある;
d.従来のフローサイトメトリー法のための免疫表現型検査に類似する試料調製を使用すること;
e.現在のFISH法またはFICTION法を使用した数百個の細胞と比較して、何千もの細胞を解析する手段を提供すること;
f.目的の細胞集団(血液学的悪性疾患における新生物細胞など)における染色体異常の検出について、現在のFISHをよりも感度が高いこと;または
g.イメージングフローサイトメーターにおいて抗原ベースのゲーティングストラテジーを使用し、それにより、少数の目的の細胞を有する試料でも信頼性のある解析ができること。低レベルの目的の細胞を検出することができ、それ故、残存疾患の評価(モニタリング)に適用することができる。このことは、疾患の重荷が低い疾患の検出を補助し、大量療法(患者のアウトカムの改善が予想される移植が含まれる)の早期導入が可能であろう。
a.細胞表面膜上、細胞質内、または細胞核内に存在する細胞の抗原(細胞マーカーとしても公知)を発現する有核細胞を含む単細胞懸濁液を調製する工程;
b.細胞抗原を抗体染色する工程;
c.細胞を固定する工程;
d.前述の細胞の核内の染色体領域/遺伝子座/その特徴を検出するために、前述の細胞に対して細胞遺伝学的技術(本明細書中に記載)を実施する工程;
e.前述の細胞に対してイメージングフローサイトメトリーを実施する工程
を含む方法を提供する。
a.細胞試料から単細胞懸濁液を調製する工程;
b.懸濁液を抗体染色して1つまたは複数の細胞マーカーを検出する、抗体染色する工程;
c.前述の細胞を固定する工程;
d.懸濁液中の細胞のDNAを変性させる工程;
e.少なくとも1つのFISHプローブを工程(d)由来の細胞DNAにハイブリッド形成させる工程;
f.前述の細胞に対してイメージングフローサイトメトリーを実施して、明視野画像、蛍光画像、ならびに免疫表現型検査マーカーおよびFISHプローブの強度測定値に関するデータを取得する、イメージングフローサイトメトリーを実施する工程;および
g.前述のデータを解析して、医学的状態の有無を診断、予後診断、またはモニタリングする、解析する工程
を含む、方法を提供する。
便宜上、以下のセクションでは、本明細書中で使用した用語の種々の意味を概説している。この考察の後、本発明の組成物、医薬の使用、および方法に関する一般的な態様が考察され、本発明の種々の実施形態の性質および実施形態をどのように使用することができるかを実証する具体例が続く。
定義
例示的な実施形態
a.解析すべき細胞集団を選択し、細胞集団の抗原プロフィールを、フローサイトメトリーを使用して前述の集団を免疫表現型検査することによって解析して、測定または評価されるべき状態に関連する1つまたは複数の生物学的マーカーまたはパラメーターの有無を検出する、選択および解析する工程、および
b.前述の集団を前述の細胞を可視化してカウントすることが可能な少なくとも1つのFISHプローブに供して、特定の細胞をその正確な表現型によって同定し、表現型によって同定された細胞のゲノム異常を同定する、FISHプローブに供する工程
を含む方法にある。
a.悪性疾患の診断、分類、および病期分類;
b.処置後残存疾患のモニタリングの評価。これは、疾患の重荷が低い疾患の検出を補助し、大量療法(患者のアウトカムの改善が予想される移植が含まれる)の早期導入が可能であろう;
c.予後の判断;および/または
d.処置の決定。
a.以下などの非悪性疾患への適用:
i.出生前の適用
1.染色体欠損または母体血との相違を有する疾患の出生前診断:母体循環系内の胎児細胞(有核赤血球または栄養芽層)の同定
a.胎児起源の有核細胞:
i.HbF(細胞内)、CD71(トランスフェリン受容体)に対する抗体を使用した有核赤血球、またはHLA−Gに対する(そして、CD45に陰性の)抗体を使用した栄養芽層を同定するための免疫表現型
ii.目的の疾患のためのプローブ、
1.数:例えば、CEP21ダウン症候群
2.構造:あまり一般的でない
b.母体血中の男性起源の胎児リンパ球:
i.免疫表現型:CD45による同定(母系と胎児とを区別できないであろう)
ii.プローブ:Y染色体を有する男性の性別
ii.キメラ現象:
1.移植後性別不適合移植
a.免疫表現型:CD45によるリンパ球の同定(レシピエントとドナーとを区別できないであろう)
b.プローブ:X染色体およびY染色体
b.悪性疾患:
i.血液学的悪性疾患:表現型によって同定された新生物細胞における染色体異常の検出。適切な抗体−蛍光色素の組み合わせおよびプローブのみに制限される
1.分類:表現型および染色体を利用したWHO分類に基づいた疾患の診断および分類。
a.数の異常(「異数性」):モノソミー、トリソミー、テトラソミー、高二倍性、低二倍性(hypodipoidy)
i.例:急性白血病、慢性白血病、形質細胞性骨髄腫、骨髄異形成症候群、リンパ腫
b.構造異常:欠失、融合
i.例:急性白血病、慢性白血病、形質細胞性骨髄腫、骨髄異形成症候群、慢性好酸球性白血病、リンパ腫
2.処置の決定:表現型によって同定された特定の疾患(例えば、del(17p)を有する慢性リンパ球性白血病;del(5q)を有する骨髄異形成症候群)における染色体欠損の存在に基づいた処置の選択
a.高感度
b.低クローン負荷が検出され得る
3.予後診断:染色体の異常によって層別化された疾患、例えば、
a.慢性リンパ球性白血病
b.形質細胞性骨髄腫
c.骨髄異形成症候群
d.急性骨髄球性白血病
e.急性リンパ芽球性白血病
f.リンパ腫
4.残存疾患:
a.染色体欠損に基づいた微小残存病変の負荷
b.染色体欠損に基づいた新規のクローンの獲得
c.自家移植のための採取前の疾患根絶
d.感度の問題:感度1:105
i.形態学より高感度
ii.FISHより高感度(1〜5細胞/100)
iii.フローMRDより高感度
iv.RT−PCRより低感度かもしれない(1:105)
ii.非造血細胞:診断および分類
1.原発性腫瘍:以下の鑑別診断
a.組織:組織から抽出した細胞。
i.数の異常:異数性(例えば、黒色腫対非定型母斑の鑑別診断)
ii.構造異常:欠失、融合(例えば、非ホジキンリンパ腫)
b.処置の決定:表現型によって同定された特定の疾患における染色体欠損の存在に基づいた処置の選択
2.転移性疾患:新生物細胞に特徴的な表面または細胞内の非造血抗原(non−haemopoietic antigen)によって同定する。
a.血液:循環腫瘍細胞(CTC)
b.例:乳房;黒色腫
c.骨髄:転移細胞
c.他の適用には、以下が含まれる:
i.DNA:特定の遺伝子領域のためのBAKプローブ
ii.RNAプローブ:転写物の検出
iii.科学的適用:
1.細胞倍数性(例えば、巨核球)
d.非ヒト遺伝子型の評価:
i.細胞内ウイルス検出:表現型によって同定されたヒト細胞に取り込まれたウイルスゲノムDNA配列の検出。
1.エプスタイン・バーウイルス(EBV):B細胞に感染し、細胞複製およびアポトーシスを調節解除する(例えば、MYC遺伝子およびBCL2L11遺伝子のハイジャック)公知のオンコウイルスである。
a.WHOによって分類されるように、血液学的悪性疾患(非ホジキンリンパ腫(すなわち、バーキットリンパ腫)およびホジキンリンパ腫など)は、潜伏EBV感染と強く関連する。
2.EBV DNAまたは関連転写物(例えば、ペプチド核酸プローブ)の検出用の市販のプローブを利用可能であり、EBVゲノムの特異的検出のための種々のタイプのフルオロフォアに抱合した特異的オリゴヌクレオチドプローブを合成することも可能である。
a.細胞表面マーカー、細胞質マーカー、または核マーカー(抗原)を有する有核細胞を含む単細胞懸濁液を調製する工程;
b.前述の細胞マーカーを抗体染色して前述の細胞を表現型検査する、抗体染色する工程;
c.同一工程において細胞を固定および透過処理する工程;
d.細胞染色体(正常または異常)の検出のために前述の細胞に対して(本明細書中に記載の)細胞遺伝学的技術を実施する工程;
e.前述の細胞のDNAを染色する工程;および
f.前述の細胞に対してイメージングフローサイトメトリーを実施する工程
を含む、方法を提供する。
a.イメージングフローサイトメトリーから得たデータを解析して、前述のデータ解析に基づいて医学的状態または治療状態の有無を検出する、解析する工程をさらに含む。
a.有核単細胞懸濁液を調製する工程;
b.(a)で生成された懸濁液由来の細胞表面マーカー、細胞質マーカー、または核マーカーを抗体染色し、染色された抗体を検出する工程;
c.同一工程において懸濁液中の細胞を固定および透過処理する工程;
d.DNAを変性させ、非特異的プローブDNA結合をブロッキングし、FISHプローブを試験中の細胞内の核物質とハイブリッド形成させる工程;
e.細胞に対してイメージングフローサイトメトリーを実施する工程;および
f.工程(e)由来のデータを解析して、工程(b)および(e)由来の結果に基づいて医学的状態の有無を診断する、解析する工程
を含む、方法を提供する。
a.有核細胞を単離し、細胞懸濁液を調製する工程;
b.特に試験される条件について細胞マーカーを認識する免疫表現型検査抗体を使用して抗原−抗体複合体を形成することによって細胞表面抗原、細胞質抗原、または核抗原を染色する工程、
c.安定化を含む完全な抗原抗体反応を行い、80分以内にクエンチする工程、
d.次いで、同一工程において細胞を固定および透過処理する工程、
e.次いで、細胞由来のDNAを変性させ、低濃度の塩酸を用いてクエンチする工程;
f.次いで、好ましくはBSAを用いて非特異的プローブDNA結合をブロックする工程;
g.次いで、少なくとも1つのFISHプローブを添加し、DNAにアニーリングし、ハイブリッド形成させる工程;
h.次いで、試料を、ストリンジェントな条件下で洗浄して過剰なFISHプローブを除去する、洗浄する工程;
i.次いで、DNAを染色して核を可視化し、フローサイトメトリーを使用して試料を試験する工程;
j.次いで、工程(b)および(i)由来のデータを、ImageStreamXを使用して解析して、医学的状態(CLLにおけるトリソミー12(染色体数の増加)または欠失17p(染色体の一部の喪失)など)の有無を判定する、解析する工程。
本発明を、ここに、以下の本発明の特定の非限定的な例を考慮して記載するであろう。
a.細胞試料を採取し、単細胞懸濁液を調製する(例えば、血液/骨髄中の赤血球(RBC)を溶解し、酵素とインキュベートして組織生検中の組織基質を除去するか、凍結保存された試料を解凍する);
b.製造者の説明書に従って細胞を蛍光抱合された抗体と4℃で30分間インキュベートして細胞の抗原を検出する;
c.細胞をPBS/2%FCSで洗浄する;
d.1mM BS3中にて4℃で30分間インキュベートする(細胞を洗浄しない);
e.100mM Tris−HCL pH7.4/150mM NaClとインキュベートし、4℃で20分間クエンチする(好ましくは、吸引しない);
f.0.1%Tween20を含む4%ホルムアルデヒドを添加し、穏やかに吸引して混合し、室温で10分間インキュベートする;
g.細胞をPBS/2%FCSで洗浄する;
h.0.5M HCL(酸)にて室温で20分間インキュベートする;
i.氷冷PBSを添加し、600×gで10分間遠心分離し、上清を除去する;
j.PBS/1%BSAで試料をブロックする;
k.洗浄し、上清を除去する;
l.0.1%NP−40を含む2×SSCに再懸濁する−細胞を0.2ml微量遠心管に移す;
m.950×gで3分間遠心分離し、全ての過剰な緩衝液を除去する;
n.FISHプローブを含むCEPハイブリッド形成緩衝液に再懸濁する;
o.73〜74℃で5分間変性させる;
p.37℃で16〜20時間ハイブリッド形成させる;
q.0.1%NP−40を含む2×SSCで洗浄し、上清を除去する;
r.0.3%NP−40を含む0.4×SSC(42℃に予熱する)に再懸濁し、42℃で5分間インキュベートする;
s.細胞をPBS/2%FCSで洗浄する;
t.DNA染色剤(例えば、SYTOX AADvancedのPBSでの5倍希釈液)に再懸濁し、室温で20分間インキュベートする;
u.AMNIS ImageStreamXにて倍率60倍およびEDFを用いて解析する。
a.BSA−ウシ血清アルブミン
b.CEP−染色体計数プローブ
c.DAPI−DAPI(4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)
d.EDF−被写界深度
e.FBS/FCS−胎児ウシ血清(別名FCSまたは仔ウシ血清)
f.PBS−リン酸緩衝生理食塩水
g.SSC−生理食塩水−クエン酸ナトリウム
生存染色
有核単細胞懸濁液の調製
a.前腕前部静脈穿刺によって健康なボランティアおよびCLL患者からVACUETTE EDTA真空採血管(Greiner Bio−One Preanalytics,Frickenhausen,Germany)に採血すること;
b.全血を1:40体積のBD PharmLyse(BD Bioscience,Sydney,Australia)(緩衝化塩化アンモニウムベースの溶解試薬、pH7.1〜7.4)と(例えば、250μLの血液を10mL PharmLyseと)10分間インキュベートして赤血球を溶解することによって末梢血有核細胞を調製すること(凍結保存された試料を、5mM塩化マグネシウムおよび10U/mL DNアーゼI酵素を含むRPMI培地で急速解凍し、洗浄することができる);および
c.細胞を200gで5分間遠心分離し、上清を除去すること。
表面マーカーの抗体染色(免疫表現型検査)
a.以下を含む免疫表現型検査抗体カクテルで有核細胞を染色する工程:
i.CLL評価のためのAF647抱合マウス抗ヒトCD3(クローンSK7,Australian Biosearch)、BD Horizon BB515抱合CD5(クローンUCHTC2,BD Biosciences)、およびBD Horizon BV480抱合マウス抗ヒトCD19(クローンSJ25C1,BD Biosciences)(図2、表3a);または
ii.CLL評価のためのBD Horizon V500c抱合マウス抗ヒトCD3(クローンSK7,BD Biosciences)、AF647抱合CD5(クローンUCHTC2,Australian Biosearch)、およびBD Horizon BV480抱合マウス抗ヒトCD19(クローンSJ25C1,BD Biosciences)(表3a);または
iii.急性リンパ芽球性白血病評価のためのBD Horizon BB700抱合マウス抗ヒトCD22(クローンHIB22,BD Biosciences)、BV421抱合マウス抗ヒトCD34(クローン581,BD Biosciences)、V500c抱合マウス抗ヒトCD45(クローン2D1,BD Biosciences)、BV605抱合マウス抗ヒトCD10(クローンHI10A,BD Biosciences)、AF647抱合CD19(クローンHIB19,Australian Biosearch)、およびFixable Viability Dye eFluor780(ThermoFisher Scientific)(図3、表3b);または
iv.多発性骨髄腫評価のためのBD Horizon BV480抱合マウス抗ヒトCD38(クローンHIT2,BD Biosciences)、V500c抱合マウス抗ヒトCD138(クローンMI15,BD Biosciences)、BV605抱合マウス抗ヒトCD45(クローンHI30,BD Biosciences)、AF647抱合CD19(クローンHIB19,Australian Biosearch)、およびFixable Viability Dye eFluor780(ThermoFisher Scientific)(図4、表3b);or
v.製造者の推奨に従った適切なアイソタイプコントロール(表3);
b.5×106細胞を4℃で30分間インキュベートする工程;
c.細胞をPBS/2%FBSで洗浄する工程;および
d.細胞を950gで3分間遠心分離する工程
を含む。
*試験したフルオロフォアに関連するチャネルのみを列挙している。**CD3クローンSK7、CD5クローンUCTHC2、CD19クローンSJ25C1。略語:AF647−アレクサフルオル647フルオロフォア、BF−明視野、BB515−Brilliant Blue 515フルオロフォア、BV480−Brilliant Violet 480フルオロフォア、CEP−染色体計数プローブ、Ch−チャネル、Del−欠失、SG−SpectrumGreen、SO−SpectrumOrange、OR−OrangeRed
固定および透過処理
a.0.1%Tween20を含む新たに調製した4%ホルムアルデヒドを細胞溶液に添加し、穏やかに吸引することによって混合すること;および
b.細胞溶液を室温で10分間インキュベートして、細胞タンパク質を固定し、細胞膜を透過処理すること
を含む。
DNA変性条件およびFISHプローブハイブリッド形成条件
a.0.5M〜1M(好ましくは、0.5M HCl)塩酸(37%AnalaR,SG1.18,Normapur,VWR Sydney,Australia)にて室温で20分間DNAを変性すること;
b.氷冷PBS中でクエンチすること;
c.遠心分離し、細胞をPBS/1%BSAに再懸濁して非特異的プローブ結合をブロックすること;
d.細胞を再度遠心分離すること;
e.細胞を、0.1%Igepal CA−630(Sigma−Aldrich,Sydney,Australia)を含む2×標準クエン酸ナトリウム(SSC)緩衝液(3M塩化ナトリウムおよび0.3Mクエン酸ナトリウムのMilliQ水溶液(pH7)の20×SSCストックからMilliQ水で20倍に希釈する)に再懸濁すること;
f.細胞を最大容積0.2mlの回収用PCRチューブ(Axygen,California,USA)に移すこと;
g.950gで遠心分離すること;
h.ピペットによって全ての上清を慎重に除去すること;および
i.単一FISHプローブ解析については、MilliQ水(2μL)および1μL FISHプローブを含むハイブリッド形成緩衝液(7μL)に細胞を再懸濁し、または、二重FISHプローブ解析については、MilliQ水(1uL)および1μLの各FISHプローブ(全部で2μLのプローブ)を含むハイブリッド形成緩衝液(7μL)に細胞を再懸濁すること。
a.細胞を73℃〜76℃(好ましくは、73℃〜74℃)に5分間加熱して、DNAを変性させ、特異的プローブのアニーリングを確実にする、加熱する工程;
b.自動サーモサイクラーにおいて37℃で16〜30時間(好ましくは、16〜20時間)ハイブリッド形成する工程;
c.0.1%Igepalを含む2×SSCから構成されるストリンジェンシー溶液で細胞を洗浄する工程;
d.細胞をClearview lo−bind微量遠心管(Sigma,Sydney,Australia)に移す工程、
e.細胞を0.3%Igepal 2−0.4×SSC(好ましくは、0.3%Igepal 0.4×SSC)から構成されるストリンジェンシー溶液にて42℃で5分間洗浄する工程;
f.細胞をPBS/2%FBSで洗浄する工程;および
g.細胞を再懸濁し、SYTOX(登録商標)AADvanced核DNA染色剤(0.2μMのPBS溶液,Thermo Fisher Scientific)にて室温で30分間染色する工程
を含む。
イメージングフローサイトメトリー
a.INSPIRE v4.1取得ソフトウェア(Amnis,Seattle,USA)を備えたAmnis ImageStreamX markII ISXmkIIを使用して細胞懸濁液に対してイメージングフローサイトメトリーを実施する工程
を含む。
a.1.5mW 785nmレーザーを使用して散乱シグナルを得、内部較正用のSpeedBeadsを測定すること;
b.BD Horizon BV480を405nmレーザーによって励起し、430〜505nmの波長範囲(Ch07)で発光を取り込むこと;
c.BD Horizon BB515およびSpectrumGreenを488nmレーザーによって励起し、480〜560nmの範囲(Ch02)の発光を取り込むこと;
d.SYTOX AADvanced DNA染色剤を488nmレーザーによって励起し、660〜740nmの範囲(Ch05)の発光を取り込むこと;
e.Biolegend AF647を642nmレーザーによって励起し、640〜745nmの波長範囲(Ch11)の発光を取り込むこと;および
f.Vysis SpectrumOrange抱合12番染色体計数プローブおよびSureFISH del17p PMP−OrangeRedプローブを561nmまたは592nmレーザーによって励起し、560〜595nmの範囲(Ch03)の発光を取り込むこと
を含む。
a.アスペクト比対明視野領域の散布図(Ch01)中の細胞を同定し、試料あたりおよそ10,000〜20,000個の細胞を記録する工程;および
b.明視野および785nmレーザー照射が存在しない同一のレーザー設定を使用して単一染色された補正標準コントロール(例えば、Simply Cellular抗マウス補正標準コントロール,Bangs Laboratories Inc.,Indiana,USA)およびSYTOX AADvanced染色細胞を解析し、INSPIRE v4.1ソフトウェア(Amnis)を使用して補正行列を計算する工程
をさらに含むイメージングフローサイトメトリーを使用して取得する。
IDEAS解析
a.画像中のピクセル値の大きな変化を検出することによって画像の鮮明さの品質を測定するGradient RMS機能を使用して焦点画像を選択する工程であって、前述のGradient RMS機能は、より焦点のあった細胞ほどGradient RMS値が高くなる強度レベルのばらつきについて正規化されたピクセルの平均勾配を使用して計算される、選択する工程;
b.アスペクト比対明視野領域の散布図中の単細胞を同定する工程であって、ここで、アスペクト比は、対象または細胞の短軸を長軸で割ったものであり、対象の円形または矩形の程度を示し、単一有核細胞はアスペクト比が高く、かつ領域値が低い、同定する工程;
c.SYTOX AADvanced蛍光強度ヒストグラムにおいて蛍光強度が高い細胞(分裂細胞)を排除することによって有核非分裂細胞を同定する工程;
d.CD19−BV480(正常Bリンパ球および新生物性Bリンパ球)、CD5−BB515(新生物性Bリンパ球および正常Tリンパ球)、およびCD3−AF647(正常Tリンパ球)の蛍光強度に基づいて目的の集団をゲーティングする工程;
e.Similarity Featureを使用してCEP12 FISHプローブシグナル(SpectrumOrange蛍光)の核染色剤(SYTOX AADvanced蛍光)との共存を判定する工程であって、この機能は、2つの画像がマスクした領域内で線形に相関する程度の尺度であり、それにより、核内のFISHプローブシグナルの類似性スコアは高い一方で、細胞膜に接着した破壊細胞由来のDNAにハイブリッド形成した非特異的プローブの類似性スコアは低い、判定する工程;
f.Spot Count Featureを使用して、ピーク、スポット、または強度マスク(表4)を用いて細胞あたりのCEP12 FISHプローブ(Ch03)のスポット数をカウントする工程であって、ここで、Spot Count Featureアルゴリズムは、ピクセルが特定のスポットまたはバックグラウンドに連結しているかどうかに基づいて各ピクセルの連結性を試験し、ブライトピークマスクオプションにより、スポット間の強度の相違と無関係に画像から明るい領域が得られ、スポット対細胞バックグラウンド比は、スポットピクセル値を明るい詳細画像における平均バックグラウンド値で割ったものである、Spot Count Featureを使用する工程;および
g.各スポットカウント集団についてのFISHシグナルの蛍光強度の測定値を比較する単一パラメーターのヒストグラム(すなわち、1−スポット対2−スポット対3−スポット)によってソフトウェアによって生成されたスポットカウントをさらに定量的に検証する工程であって、ここで、蛍光強度の測定値の変化が、ハイブリッド形成プローブ数に対応し、それにより、二次元画像の投影に固有の重複シグナル(すなわち、1−スポットとして現れる2−スポット)を補正して、真の特異的FISHスポット数を判定し、モノソミー亜集団およびダイソミー亜集団の信頼性ある区別が可能である、検証する工程(Minderman H,Humphrey K,Arcadi JK,et al.Image Cytometry−Based Detection of Aneuploidy by Fluorescence In Situ Hybridization in Suspension.Cytometry Part A 2012;81A:776−784)、
h.細胞あたりの平均スポットカウントからスポットカウント比をさらに計算する工程であって、総スポット数を、表現型亜集団サイズに対して正規化する、計算する工程(スポットカウント比=平均スポットカウント新生物細胞/平均スポットカウント正常細胞(例えば、CD19+CD5+CLL/CD3+C5+T−細胞:del(17p)<2、トリソミー12>2比)
を含む。
a.メタノール固定緩衝液(70%メタノール/4%ホルムアルデヒド/5%酢酸)を、上記プロトコール中の0.1%Tween20を含む4%ホルムアルデヒド固定液の代わりに使用することができる。
b.ハイブリッド形成のバリエーションは、0.1ug/mlプロテイナーゼKおよび以下の代替のDMSO、ホルムアミド、または炭酸エチレンベースのハイブリッド形成緩衝液での前処理を含み得る:15%DMSO、35%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、0.1%Tween20、2×SSC;5%DMSO、45%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、0.1%Tween20、2×SSC;5%DMSO、10%硫酸デキストラン、0.1%Tween20、2×SSC;10%DMSO、10%硫酸デキストラン、0.1%Tween20、2×SSC;15%DMSO、10%硫酸デキストラン、0.1%Tween20、2×SSC;15%ホルムアミド、10%デキストラン、0.1%Tween20、2×SSC;15%ホルムアミド、20%デキストラン、0.1%Tween20、4×SSC;50%ホルムアミド、10%デキストラン、0.1%Tween20、2×SSC;または15%炭酸エチレン、20%デキストラン、0.1%Tw20、2×SSC。
c.代替のハイブリッド形成後の第2のストリンジェンシー洗浄緩衝液(0.3%Igepalを含む0.1×SSC)を使用することができる。
d.陽性の変動がエピトープまたはフルオロフォアの安定性に起因するかどうかを判定するために、BD Horizon BB515(BD Biosciences)またはAF647(Australian Biosearch)のいずれかと抱合した抗CD3抗体クローンSK7、BD Horizon BB515(BD Biosciences)またはAF647(Australian Biosearch)のいずれかと抱合した抗CD5抗体クローンUCTHC2、およびBD Horizon BV480(BD Biosciences)、BD Horizon BB515(BD Biosciences)、またはAF647(BD Biosciences)のいずれかと抱合した抗CD19抗体クローンHIB19を解析することができる。
e.代替のDNAマーカーには、Hoechst 33342(BD Biosciences)およびDRAQ7(BioLegend)が含まれ得る。
例示的な結果
*4℃で10分間 **室温で20分間 ***37℃で10分間 ****5分間の熱変性および37℃で16〜24時間のハイブリッド形成
^MFI計算によって未確認の1または2スポットカウント
AA−酢酸、CEP−染色体計数プローブ、DMSO−ジメチルスルホキシド、FA−ホルムアルデヒド、HCl−塩酸、M−モル、MeOH−メタノール、SO−SpectrumOrange、SSC−標準クエン酸ナトリウム緩衝液、Tw20−Tween20、VCEP−CEPプローブを含むAbbott Molecularによって提供されたVysis CEPハイブリッド形成緩衝液
*MFIによって1または2スポットに調整されない1−スポットカウント
CEP−染色体計数プローブ、FA−ホルムアルデヒド、HCl−塩酸、M−モル、SG−SpectrumGreen、SO−SpectrumOrange、Tw20−Tween20、VCEP−CEPプローブを含むAbbott Molecularによって提供されたVysis CEPハイブリッド形成緩衝液
FA−ホルムアルデヒド、HCl−塩酸、Igepal−Igepal CA−630、M−モル、Tw20−Tween20、SFHB−17p欠失プローブを含むAgilent Technologiesによって提供されたSureFISHハイブリッド形成緩衝液、SSC−標準クエン酸ナトリウム緩衝液
表9に示した以下の実施例は、免疫フローFISHテクノロジーを免疫−S−FISHテクノロジーと比較している。一方で、表10は、末梢血単核球(PBMC)調製物の解析についての広範な作業範囲およびその方法論において非常に好ましい最適条件を提供している。
注意:プロトコールを通して試料を光から防御すべきである。
注意:プロトコールを通して試料を光から防御すべきである。
Claims (21)
- 細胞解析法であって、
a.細胞のマーカーまたは抗原(細胞表面抗原、細胞質抗原、または核抗原)を有する有核細胞を含む単細胞懸濁液を調製する工程;
b.細胞マーカーを抗体染色する工程;
c.前記細胞を固定および/または透過処理する工程;
d.前記細胞に対して細胞遺伝学的技術を実施して、目的の染色体の特徴を検出する、細胞遺伝学的技術を実施する工程;
e.細胞のDNAを染色する工程;および
f.前記細胞に対してイメージングフローサイトメトリーを実施して、工程(b)における抗体の存在および工程(d)で標的にされた目的の染色体の特徴を測定し、定量し、そして/または同定する、イメージングフローサイトメトリーを実施する工程
を含む、方法。 - 有核細胞の単細胞懸濁液を調製する工程が、血液試料もしくは骨髄試料内の赤血球を溶解することまたは組織試料中の細胞外基質および細胞間接着の酵素消化を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記有核細胞試料を調製する工程が、調製された試料を適切な緩衝液で緩衝化することを含む、請求項2に記載の方法。
- 赤血球を溶解することまたは細胞外基質を消化することが、溶解または消化が生じる条件下で前記試料をインキュベートする工程を含む、請求項2または請求項3に記載の方法。
- 前記単細胞懸濁液を調製する工程が、(a)前記試料を遠心分離し、上清を除去すること、または(b)余剰細胞外基質を除去するのに適切な条件下で前記細胞を洗浄することのうちの少なくとも1つを含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞マーカーを抗体染色する工程が、免疫表現型検査の抗体調製物を使用して前記細胞を染色することを含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞を固定および透過処理する工程が、ホルムアルデヒドおよび非イオン性界面活性剤を前記試料に添加して、前記試料を固定および透過処理する、添加する工程を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞遺伝学的技術が、前記細胞のDNAを変性させる工程を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞遺伝学的技術が、リン酸緩衝生理食塩水中で前記細胞をクエンチする工程を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞遺伝学的技術を実施する工程が、細胞を遠心分離する工程、上清を除去する工程、前記細胞を再懸濁する工程を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞遺伝学的技術が、前記細胞内のDNAを少なくとも1つのFISHプローブとハイブリッド形成させる工程を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ハイブリッド形成物を、ストリンジェンシー溶液で洗浄して非結合プローブを除去する、請求項11に記載の方法。
- 前記細胞遺伝学的技術が、前記細胞を核DNA染色する工程を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- イメージングフローサイトメトリーを、工程(b)または(d)の結果を測定するのに適切なレーザーを使用した励起レーザーおよび発光の捕捉を用いて実施する、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- イメージングサイトメトリーの実施が、前記試料中の少なくとも10,000個の細胞を記録することを含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- データ解析が、蛍光強度が高い細胞を排除することによって蛍光強度ヒストグラム中の有核非分裂細胞を同定することを含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- データ解析に基づいて医学的状態を診断、予後診断、またはモニタリングすることを含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 本発明の方法の構成要素のうちの1つまたは複数を、1つまたは複数の容器に、前記本発明の方法の構成要素の使用に関する指示および/または情報を提供する指示書または情報小冊子と組み合わせて含む、キット。
- (a)標準的なフローサイトメトリーに適切な少なくとも1つの抗原マーカー検出システム、および(b)1つまたは複数の本発明のFISHプローブを含むキットであって、(a)および(b)の各々が、1つまたは複数の容器に、本発明の方法における(a)および(b)の使用に関する指示および/または情報を提供する指示書または情報小冊子と組み合わせて存在する、キット。
- 1つまたは複数の容器に本発明の方法での使用に適切な1つまたは複数の緩衝液をさらに含む、請求項39および40に記載のキット。
- 前記キット中に存在するマーカー検出システムが、細胞試料の免疫表現型検査に適切な抗体である、請求項40に記載のキット。
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