JP2021501885A - 細胞解析におけるか細胞解析に関連する改善 - Google Patents

細胞解析におけるか細胞解析に関連する改善 Download PDF

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Abstract

本発明は、細胞解析法であって、表面抗原、細胞質抗原、または核抗原(マーカー)を有する有核細胞を含む血液試料を調製する工程;細胞マーカーを抗体染色する工程;前述の細胞を固定および透過処理する工程;FISHプローブを細胞内の染色体にハイブリッド形成させる工程;前述の細胞に対してイメージングフローサイトメトリーを実施する工程;イメージングフローサイトメトリーの実施から得たデータを解析する工程;データ解析に基づいて医学的状態を診断、予後診断、またはモニタリングする工程を含む、方法を提供する。【選択図】なし

Description

技術分野
本発明は、細胞解析に関する。特定の非限定的な態様では、本発明は、組織試料の診断方法および予後診断方法ならびに/または細胞解析に関する。例えば、本発明は、医学的状態または治療状態の診断、予後診断、またはモニタリングのための解析方法を提供する。
背景技術
以下の背景技術の考察は、本発明の理解を容易にすることのみを意図する。この考察は、参照された任意の資料が本出願の優先日時点の一般知識の一部である、または一部であったことを了承または承認するものではない。
細胞遺伝学的解析は、悪性疾患、トリソミー21などの染色体数異常を伴う症候群(ダウン症候群)、および移植レシピエントにおけるキメラ現象などの多数の障害の評価における不可欠な構成要素である。
診断研究所では、現在、特定のゲノムの欠損を同定するために、ガラススライド上の細胞(細胞スミアまたは組織切片のいずれか)に対する蛍光in situハイブリッド形成(FISH)解析を使用している。FISHでは、蛍光標識された一本鎖DNAプローブの、標的ゲノム中のその相補配列へのアニーリグに基づいて、DNA配列および超顕微鏡的な遺伝子の変化を検出する。プローブは、染色体座(領域)を標的にして細胞全体における間期および中期の両方の再編成、欠失、および獲得を同定するように設計される。染色体に結合した蛍光プローブの位置を試験するために蛍光顕微鏡法が使用されるので、このことが解析される細胞数を制限している(一般に、1ケースあたり500個未満)。それ故、この方法の感度は低い。さらに、細胞内の染色体異常を可視化するためのFISH法は、悪性疾患(特に、血液学的悪性疾患)および非悪性疾患(例えば、遺伝病の出生前診断)の診断評価に重要である一方で、労働集約的であり、目的の細胞は特異的に同定されない−核のみが可視化され、これらの核は、任意の細胞型に由来し得る。
スライドベースのFISHの特異性を、目的の細胞の表現型同定(免疫表現型検査)と組み合わせた場合に(すなわち、細胞の抗原の免疫蛍光標識およびFISHとの統合)増加させることができる。この組み合わせは、「免疫FISH」または「新生物調査ツールとしての蛍光免疫表現型および間期細胞遺伝学」(FICTION)として公知である。免疫FISH/FICTIONは、細胞遠心分離調製物、細胞スミア、または組織切片に対して実施することができる表現型に基づいた細胞内の遺伝子異常の同定に有用なツールであり、細胞(例えば、CD138陽性形質細胞)内のその表現型によって同定された特異的な遺伝子異常を検出することができる(図1)。これは、全新生物細胞に存在する遺伝子の一次異常(例えば、MYC転座)および表現型によって区別される細胞亜集団に存在する二次変化(クローンの不均一性)も検出可能である。免疫表現型検査と遺伝子解析の組み合わせ(すなわち、FICTION)は染色体異常のFISH検出の特異性が増大するが、この方法には、染色体に結合した蛍光プローブの位置を手作業で試験するための蛍光顕微鏡法を依然として必要とし、したがって、(FISHと同様に)解析される細胞数が制限される。それ故、方法の感度は依然として低い。
対照的に、従来のフローサイトメトリーによる免疫表現型検査は、何千もの細胞を解析して定量的な集団データを提供し、異常細胞集団を検出可能な自動化された細胞表現型検査法である。しかし、最近まで、この方法は、FISHプローブ結合を検出するために適用することができなかった(図1)。
最近になって、FISHは、「懸濁液中の」細胞に対して実施され(すなわち、「FISH−IS」、「懸濁液−FISH」、または「S−FISH」)、フローサイトメトリーによって解析されている。FISH−ISは、細胞をインタクトな状態に保ち、元は三次元の(すなわち、球形の)間期核の、スライド上で実施されるFISHのための風乾工程に伴って生じる平坦化の問題に対処している。試験の原理は同一であるが、ハイブリッド形成条件のストリンジェンシーによってプローブ標識が特異的であることを確実にする一方で、細胞およびDNAをインタクトに保持しなければならないので、ハイブリッド形成手順がスライド用のプロトコールと異なる。間期のFISH−IS標識された細胞全体を、顕微鏡法ベースのアプローチより数ログ多い細胞の自動化遺伝子解析が可能なフローサイトメトリーで解析することができる。しかし、これは、実施することができるFISH解析のタイプに制限される。
イメージングフローサイトメトリーは、伝統的なFISH法よりも感度がさらに改善されていることが示されている。自動細胞イメージングフローサイトメトリーは、懸濁液中の細胞を1,000〜2,000細胞/秒の速度で解析する。このテクノロジーは、各細胞について12枚までの画像を取得することができ、この画像には倍率600倍の顕微鏡法に匹敵する品質の10枚の蛍光画像が含まれる。このマルチパラメータアプローチは、標準的なフローサイトメトリーの感度および統計的検出力とデジタル顕微鏡法とを組み合わせている。このテクノロジーを使用すると、細胞内シグナル(結合したFISHプローブの蛍光シグナルまたは「スポット」が含まれる)が、広範囲の被写界深度のイメージングを使用して高精度に局在化することが可能である。したがって、蛍光プローブを使用して特定の遺伝子異常を検出するために使用される可能性がある。Minderman et al.による最近の報告では、FISH−ISを使用してハイブリッド形成された細胞をイメージングフローサイトメトリーによって解析することができることが明確に実証されている(Minderman H,Humphrey K,Arcadi JK,et al.Image Cytometry−Based Detection of Aneuploidy by Fluorescence In Situ Hybridization in Suspension.Cytometry Part A 2012;81A:776−784)。この解析方法は、動原体プローブを用いて白血病細胞内の染色体コピー数を決定するために首尾よく使用されている。この高処理自動イメージング解析アプローチは、FISH−ISを評価するための従来のフローサイトメトリーと比較して以下の1つの大きな利点がある:この利点はイメージングに関し、ハイブリッド形成「スポット」を可視化してカウントする能力である。このアプローチは、細胞集団を定量的に解析して多数の細胞について「スポット」を高処理カウントすることが可能であり、染色体異常がより正確に解析される。しかし、その利点にもかかわらず、FISH−ISは、各試料を解析する能力に限界があり、感度およびばらつきの面から改善の余地がかなりある。
したがって、先行技術に関連する問題、欠点、または不利益のいくつかを低減、制限、克服、または改善するか、有効な代替物を提供する新規の方法、デバイス、および/またはシステムを提供することが有利であろう。
発明の概要
本発明者らは、医学的状態または治療状態を診断、予後診断、またはモニタリングするための細胞解析の改良された「免疫フローFISH」技術を開発することによって、先行技術の1つまたは複数の欠点に対処しようとした。
前述の技術は、イメージングフローサイトメーターを使用した懸濁液中の細胞の免疫表現型検査とFISH解析の組み合わせである。イメージングフローサイトメトリーは、単一のプラットフォームにおいて、高解像度のデジタル画像を、標準的なフローサイトメトリーから入手した定量的情報と組み合わせている。概して、本発明の医学的状態または治療状態を診断、予後診断、またはモニタリングするための細胞解析法は、
a.フローサイトメトリーの免疫表現型検査を使用して細胞集団の抗原プロフィールに基づいて解析すべき細胞集団を選択する工程、および
b.イメージングフローサイトメトリーの結果から、その正確な表現型によって同定されたこれらの特定の細胞中のFISHプローブのシグナルをカウントする工程
を含む。
結果として、目的の細胞(例えば、白血病細胞)の抗原発現パターンまたは表現型に基づいて、これらの細胞中のFISH染色体シグナルのみが評価される。
したがって、第1の形態によれば、本発明は、細胞集団における状態を診断、予後診断、またはモニタリングする方法であって、
a.解析すべき細胞集団を選択し、細胞集団の抗原プロフィールを、フローサイトメトリーを使用して前述の集団を免疫表現型検査することによって解析して、測定または評価されるべき前述の状態に関連する1つまたは複数の生物学的マーカーまたはパラメーターの有無を検出する、選択および解析する工程、および
b.前述の集団を前述の細胞を可視化してカウントすることが可能な少なくとも1つのFISHプローブに供して、特定の細胞をその正確な表現型によって同定し、表現型によって同定された細胞のゲノム異常を同定する、FISHプローブに供する工程
を含む、方法にある。
方法の第1の工程によれば、フローサイトメトリーを使用して細胞集団を免疫表現型検査することにより、複数の蛍光パラメーターを同時に評価することができる。この工程はまた、集団の細胞形態(細胞の特徴)の可視化を可能にし、細胞を免疫表現型検査し、膜上、細胞質内、または核内のいずれかの抗原の位置を同定可能である。この後者の結果は、マーカーの局在を可視化すること、または膜抗原、細胞質抗原、または核抗原を区別する異なるマーカーまたは測定パラメーターを使用することによって達成することができる。
好ましくは、FISHプローブは、その正確な表現型によって同定された(すなわち、工程;(a)で選択された)これらの特定の細胞においてカウント(または測定)すべき蛍光「スポット」または別のシグナルを生成する。
免疫フローFISH解析は複雑であり、細胞の完全性、抗体結合のためのエピトープ、および特定の染色体座へのプローブハイブリッド形成を維持するために注意深くバランスをとることが必要である。技術的に困難であるが、免疫フローFISHは、従来のスライドベースのFISHよりもはるかに多くのデータを提供し、以前に記載された免疫−S−FISHより感度が高く、ばらつきが少ない(試料あたり80%未満の細胞に制限される)。免疫フローFISHは、細胞が試料中の細胞のサブセットのみを構成する場合でさえも、その細胞表現型によって同定される多数の細胞を自動でFISH解析することが可能である。
イメージングフローサイトメーターがマルチスペクトル画像機能を備えているので、「免疫フローFISH」(すなわち、懸濁液中の細胞の免疫FISH)が可能である。免疫フローFISHは、表現型によって同定された細胞におけるゲノム異常を同定するための統合された自動高処理単一プラットフォーム試験を提供する機能を備えており、より高い感度が得られる。
懸濁液中の細胞に対するFISH(FISH−IS)の細胞表現型検査との組み合わせにより、遺伝子座特異的プローブ(すなわち、特定の遺伝子配列に指向するプローブ;その配列は、研究される材料に応じて、正常な遺伝子でも異常な遺伝子でもよい)を、単一の高処理自動試験において表現型によってゲーティングされた(「選択された」)細胞の遺伝子型を同定するために使用することができる。これにより、スライドベースの免疫FISH(多数の細胞を解析することができることに起因する)およびフローサイトメトリーFISH−IS(懸濁液中の表現型に基づいて目的の細胞集団を同定する能力に起因する)に検出力を付加することができる。
本発明者らのテクノロジーは、現在のマニュアルFISH法、FISH−IS法、およびFICTION法、または従来のフローサイトメトリーによる免疫表現型検査に寄与する不利益を改善することを目指している。特に、本発明者らは、免疫フローFISHが、以下の現在のFISHおよびFICTIONテクノロジーとの差別化要因のうちの少なくとも1つを達成すると考えている:
a.単一の高処理イメージングフローサイトメトリープラットフォームでインタクトな新生物細胞全体の形態、表現型、および遺伝子型の全体的な評価が可能であること;
b.現在のマニュアルFISH法(1〜3%細胞)より感度が高いこと(1:10,000細胞超);
c.現在のマニュアルFICTION法より迅速であること(特に、総じてインタクトな細胞を評価する場合に迅速かつ正確である)こと。FICTIONは、免疫表現型として間違った結果を生じる可能性があり、FISHは、3〜4umの組織切片で実施される。試験が全細胞を評価するのではなく、その「スライス」を評価するので、これにより誤った結果を生じる可能性がある;
d.従来のフローサイトメトリー法のための免疫表現型検査に類似する試料調製を使用すること;
e.現在のFISH法またはFICTION法を使用した数百個の細胞と比較して、何千もの細胞を解析する手段を提供すること;
f.目的の細胞集団(血液学的悪性疾患における新生物細胞など)における染色体異常の検出について、現在のFISHをよりも感度が高いこと;または
g.イメージングフローサイトメーターにおいて抗原ベースのゲーティングストラテジーを使用し、それにより、少数の目的の細胞を有する試料でも信頼性のある解析ができること。低レベルの目的の細胞を検出することができ、それ故、残存疾患の評価(モニタリング)に適用することができる。このことは、疾患の重荷が低い疾患の検出を補助し、大量療法(患者のアウトカムの改善が予想される移植が含まれる)の早期導入が可能であろう。
第2の態様では、本発明は、細胞解析法であって、
a.細胞表面膜上、細胞質内、または細胞核内に存在する細胞の抗原(細胞マーカーとしても公知)を発現する有核細胞を含む単細胞懸濁液を調製する工程;
b.細胞抗原を抗体染色する工程;
c.細胞を固定する工程;
d.前述の細胞の核内の染色体領域/遺伝子座/その特徴を検出するために、前述の細胞に対して細胞遺伝学的技術(本明細書中に記載)を実施する工程;
e.前述の細胞に対してイメージングフローサイトメトリーを実施する工程
を含む方法を提供する。
好ましくは、細胞遺伝学的技術は、細胞のプローブ(好ましくは、細胞の核内の染色体領域/遺伝子座/その特徴の検出に適切なFISHプローブ)とのハイブリッド形成を含む。細胞のDNAの変性、非特異的プローブDNA結合のブロッキング、およびFISHプローブの試験中の細胞内の核物質とのハイブリッド形成によってこれを行うことができる。望ましくは、細胞を、ハイブリッド形成後に氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でクエンチし、次いで、遠心分離する。
好ましくは、ブロッキングを使用するとき、非特異的プローブDNAを、FISHプローブハイブリッド形成物への結合からブロッキングする。試料のPBS/BSAへの曝露およびその後の細胞の洗浄によってこれを行うことができる。次いで、得られた上清を除去し、細胞を、FISHプローブ解析のためのハイブリッド形成緩衝液に再懸濁することができる。本発明のこの形態では、次いで、細胞を加熱してDNAを変性させ、そして/またはプローブアニーリングを容易にする。この工程を、自動サーモサイクラーで行うことが好ましい。次いで、細胞を、ストリンジェンシー溶液で少なくとも1回洗浄し、再懸濁することができる。次いで、細胞の核DNA染色を行う。
本発明の一形態において、本方法は、さらに、イメージングフローサイトメトリーから得たデータを解析する工程を含む。
細胞集団の免疫表現型、集団中の細胞数、プローブの存在/位置、および各細胞内に存在するプローブスポット数などの試料の情報(すなわち、細胞遺伝学)を決定するためのIDEAS(AMNIS Merck,Seattle,USA)および類似のソフトウェアなどのイメージングフローサイトメトリーソフトウェアでデータを解析する。
あるいは、単一の染色された細胞を、明視野技術を使用せずに解析することができ、補正行列を計算することができる。
好ましくは、細胞に対するイメージングフローサイトメトリーは、励起レーザーを使用し、その発光を捕捉する。励起レーザーは、100mW 405nm、および/または50mW 488nm、および/または150mW 561nm、および/または150mW 592nm、および/または120mW 642nmのレーザーを含み得る。これに関して、細胞に対するイメージングフローサイトメトリーの実施において、細胞をイメージングフローサイトメーター(例えば、AMNIS ImageStreamX markII;AMNIS,Seattle,USA)で解析し、明視野(形態)画像および蛍光画像ならびに蛍光強度などのデータを記録する。
イメージングサイトメトリーの実施は、好ましくは、少なくとも40倍の対物レンズを使用して画像を取り込むことを含む。画像を、30倍〜70倍の範囲の対物レンズで取り込むことができる。望ましくは、画像を、およそ60倍の対物レンズで取り込む。
イメージングサイトメトリーの実施はまた、散布図中の細胞の同定を含み得る。望ましくは、試料中のおよそ10,000〜20,000個の細胞が記録される。
本発明のさらなる形態または別の形態では、本方法は、データ解析に基づいて医学的状態または治療状態を診断、予後診断、またはモニタリングする工程を含む。
本発明の一形態によれば、イメージングフローサイトメトリー工程において、免疫フローFISHのデータ解析を、画像解析ソフトウェアを使用して行う。データ解析は、画像の鮮明さまたは品質を測定することによって、焦点画像を選択することを含み得る。望ましくは、データを、散布図にする。散布図は、アスペクト比対明視野領域の好ましい一形態である。
解析は、蛍光強度の高い細胞を排除することによって蛍光強度ヒストグラム中の有核非分裂細胞を同定する工程も含み得る。かかるデータ解析は、理想的には、使用したアプリケーションおよび細胞マーカーに応じて、正常細胞および新生物細胞(例えば、リンパ球、白血球)などのマーカーの蛍光強度に基づいて目的の細胞集団をゲーティングする工程を含むであろう。
好ましくは、データ解析は、2つの画像がマスキングした領域内で線形に相関する程度の尺度を使用して、FISHプローブシグナルの核染色剤との共存を決定することを含む。データ解析は、ピーク、スポット、または強度マスクを使用して、細胞あたりのFISHプローブスポット数をカウントすることを含み得る。これは、各ピクセルが特定のスポットまたはバックグラウンドに連結するかどうかに基づいた各ピクセルの連結性を試験することを含み得る。好ましくは、スポットカウントを、各スポットカウント集団についてFISHシグナルの蛍光強度の測定値を比較して、1スポット、2スポット、および3スポットまたはそれを超えるスポットカウントを確認するか、染色体転座があるときにスポットを重ねる単一パラメーターヒストグラムによって検証する。細胞集団間のスポットカウントの比較により、FISHプローブに関連する細胞遺伝学の存在を決定することができる。正常細胞と比較した異常細胞の核内の「スポット」数の比を計算することができる(例えば、白血球の核内のスポットを正常なリンパ球と比較してスポット比を得ることができる)。
第3の態様では、本発明は、細胞解析のための診断方法であって、
a.細胞試料から単細胞懸濁液を調製する工程;
b.懸濁液を抗体染色して1つまたは複数の細胞マーカーを検出する、抗体染色する工程;
c.前述の細胞を固定する工程;
d.懸濁液中の細胞のDNAを変性させる工程;
e.少なくとも1つのFISHプローブを工程(d)由来の細胞DNAにハイブリッド形成させる工程;
f.前述の細胞に対してイメージングフローサイトメトリーを実施して、明視野画像、蛍光画像、ならびに免疫表現型検査マーカーおよびFISHプローブの強度測定値に関するデータを取得する、イメージングフローサイトメトリーを実施する工程;および
g.前述のデータを解析して、医学的状態の有無を診断、予後診断、またはモニタリングする、解析する工程
を含む、方法を提供する。
好ましくは、明確な境界を同定できるように、上記方法を、コントロール細胞および試料細胞に対して実施する。
第4の態様では、本発明は、本発明の方法の1つまたは複数の構成要素を、方法におけるキットの使用方法についての説明書と共に含む診断キットを提供する。
特に、本発明は、(a)少なくとも1つの標準的なフローサイトメトリーに適切なマーカー検出システム、(b)1つまたは複数の本発明のFISHプローブを含むキットであって、(a)および(b)の各々が、1つまたは複数の容器に、本発明の方法における(a)および(b)の使用に関する指示および/または情報を提供する指示書または情報小冊子と組み合わせて存在する、キットに及ぶ。
さらに、キットは、1つまたは複数の容器に本発明の方法での使用に適切な1つまたは複数の緩衝液も含むことができる。
好ましくは、キット中に存在するマーカー検出システムは、細胞試料の免疫表現型検査に適切な抗体である。
このテクノロジーを適用することができる用途には、制限されないが、以下が含まれる:出生前の適用(染色体欠損または母体血との相違を有する疾患の出生前診断、母体循環系内の胎児細胞(例えば、有核赤血球、栄養芽層、またはリンパ球)の同定、胎児起源の有核赤血球の同定、HbF(細胞内の胎児ヘモグロビン)、CD71(細胞表面上のトランスフェリン受容体)、栄養芽層を同定するためのHLA−Gに対する抗体を使用した有核赤血球を同定するための免疫表現型検査、目的の疾患のためのプローブ(例えば、ダウン症候群におけるトリソミー21のためのCEP21)の同定;母体血中の男性起源の胎児リンパ球の同定(Y染色体FISHプローブ):免疫表現型解析(CD45、HbF、HLA−G、CD71による同定が含まれる);キメラ現象(移植後性別不適合移植が含まれる)の同定、およびCD45によるリンパ球を同定するための免疫表現型検査が含まれる)などの非悪性疾患の同定。
あるいは、本方法を、悪性疾患(血液学的悪性疾患(血液がん)または他のタイプのがんなど)の同定;表現型によって同定された新生物細胞における染色体異常の検出のために使用することができる。表現型および染色体を利用したWHO分類に基づいた疾患分類、数の異常(「異数性」):モノソミー、トリソミー、テトラソミー、高二倍性、低二倍性(例:急性白血病、慢性白血病、形質細胞性骨髄腫、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫);構造異常:欠失、転座、重複、増幅(例:急性白血病、慢性白血病、形質細胞性骨髄腫、骨髄異形成症候群、慢性好酸球性白血病、非ホジキンリンパ腫)。「液体生検」とも呼ばれる血液(すなわち、循環腫瘍細胞を同定するための血液試料)または組織試料から得た癌細胞における他のタイプのがんの染色体の数および構造の両方の異常の検出。特に、本方法を、任意の身体部位(例えば、リンパ節、乳房、皮膚)由来の脱凝集した組織試料に対して使用して、染色体の異常を検出することができる。
あるいは、本方法を、細胞内ウイルス検出などの非ヒト遺伝子型評価のために使用することができる:表現型によって同定されたヒト細胞に取り込まれたウイルスゲノムDNA配列の検出。エプスタイン・バーウイルス(EBV)はB細胞に感染し、細胞複製およびアポトーシスを調節解除する(例えば、MYC遺伝子およびBCL2L11遺伝子のハイジャック)公知のオンコウイルスである。WHOによって分類されるように、血液学的悪性疾患(非ホジキンリンパ腫(例えば、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫またはバーキットリンパ腫)およびホジキンリンパ腫など)は、EBV感染と強く関連する。EBV DNAまたは関連転写物(例えば、ペプチド核酸プローブ)の検出用の市販のプローブを利用可能であり、EBVゲノムの特異的検出のための種々のタイプのフルオロフォアに抱合した特異的オリゴヌクレオチドプローブを合成することも可能である。
本方法を、処置の決定を伝えるために使用することができる:表現型によって同定された特定の疾患(例えば、del(17p)を有する慢性リンパ球性白血病;del(5q)を有する骨髄異形成症候群)における染色体欠損の存在に基づいた処置の選択。
本方法を、予後診断を伝えるために使用することができる:染色体の異常によって層別化された疾患(慢性リンパ球性白血病、形質細胞性骨髄腫、骨髄異形成症候群、急性骨髄球性白血病、および急性リンパ芽球性白血病、EBV陽性リンパ腫など)。
本方法を、残存疾患(その表現型によって同定された特定の細胞における染色体欠損に基づいた微小残存病変の負荷が含まれる)を伝えるために使用することができる。あるいは、本方法を、新規の染色体欠損に基づいた新規のクローンの獲得または自家移植のための採取前の疾患根絶を伝えるために使用することができる。
本方法を、原発性腫瘍などの非造血細胞の診断および分類を伝えるために使用することができる:組織:組織から抽出した細胞の鑑別診断。数の異常:異数性(例えば、黒色腫対非定型母斑の鑑別診断)および構造異常:欠失、融合。
本方法を、表現型によって同定された特定の疾患における染色体欠損の存在に基づいた処置の選択を伝えるために使用することができる。これには、妊娠中の母体血中の異常な胎児細胞の検出が含まれる。
本方法を、新生物細胞(循環腫瘍細胞が含まれる)に特徴的な表面または細胞内の非造血抗原(non−haemopoietic antigen)によって同定するために使用することができる。例:乳房;黒色腫、および骨髄の転移細胞。
本方法を、導入遺伝子ベクター配列に対するプローブによるCAR−T細胞耐性を同定するために使用することもできる。特に、本方法を、操作された導入核酸配列および細胞内のその発現の検出のため使用することができる。
本発明のさらなる特徴を、以下のいくつかのその非限定的な実施形態の説明でより完全に説明する。この説明は、本発明の例示のみを目的として含まれる。この説明は、上記発明の広範な概要、開示、または説明を制限するものと理解すべきではない。
添付の図面を参照して説明する:
図1は、細胞解析のための現在の診断方法(スライド上の細胞に対するマニュアルFISH(核の青色対比染色を使用したVysis CLLプローブキット)、自動フローサイトメトリーによる免疫表現型検査(FISHを行うことはできない)、および免疫表現型検査をFISHと組み合わせたマニュアルFICTION法が含まれる)を示す。 図2は、本発明の適切な実施形態にしたがって細胞解析法を使用した12番染色体コピー数についての代表的なCLL血液試料の評価を示す。(A)細胞集団を、免疫表現型マーカーの組み合わせの発現に基づいてゲーティングする。(B)各CD3+T細胞におけるVysis CEP12 FISHプローブのハイブリッド形成スポットの「スポットカウント」またはスポット数。(C)各CD19+B細胞におけるVysis CEP12 FISHプローブのハイブリッド形成スポットの「スポットカウント」またはスポット数。ゲーティングした集団を、画像ギャラリー中に見ることもできる(D)。細胞639は、CD19−BV480陰性、CD3−AF647陽性、CD5−BB515陽性のCEP12ダイソミーT細胞であり、細胞326は、CD19−BV480陽性、CD3−AF647陰性、CD5−BB515陽性のCEP12ダイソミーB細胞であり、細胞164は、CD19−BV480陽性、CD3−AF647陰性、CD5−BB515陽性のCEP12トリソミーB CLL細胞である。オーバーレイ画像は、免疫表現型検査、CEP12プローブ、および核SYTOX AADvanced画像の重ね合わせである。 図3は、本発明の適切な実施形態にしたがって細胞解析法を使用した代表的な急性リンパ芽球性白血病(ALL)骨髄試料およびReh(ALL)細胞株の免疫表現型検査の例を実証している画像ギャラリーを示す。(A)ALL細胞5634および8370は、CD22−BB700陽性、TdT−BV421陽性、CD19−AF647陽性、およびCD33−BV605陰性である。(B)Reh細胞390および403は、CD22−BB700陽性、CD34−BV421陰性、CD45−V500c陽性、CD10−BV605陽性、CD19−AF647陽性、およびFVDeFluor780陰性であり、これらの細胞が、免疫表現型評価時に生存細胞であったことを示す。略語:AF−アレクサフルオル、BB−Brilliant Blueフルオロフォア、BF−明視野、BV−Brilliant Violetフルオロフォア、FVD−Fixable viability色素。 図4は、本発明の適切な実施形態にしたがって細胞解析法を使用した代表的な形質細胞性骨髄腫の骨髄試料の免疫表現型検査の例を実証している画像ギャラリーを示す。上および中央の細胞は、CD138−V500c陽性、CD45−BV480陰性、CD19−AF647陰性の形質細胞骨髄腫の細胞であり、下の細胞は、CD138−V500c陰性、CD45−BV480陽性、CD19−AF647陽性の正常な形質細胞である。略語:AF−アレクサフルオル、FVD−Fixable viability色素。 図5は、本発明の適切な実施形態にしたがって細胞解析法を使用した急性リンパ芽球性白血病(ALL)の骨髄試料の評価を実証している。(A)細胞1570は、3コピーの4番染色体またはトリソミー4(緑色スポット)を有する。トリソミーは、SYTOX AADvanced核染色剤との共存解析によって確認される。オーバーレイ画像は、CEP4プローブおよび核SYTOX AADvanced画像の重ね合わせである。(B)細胞1853は、ETV6−SG/RUNX1−SOオーバーレイ画像中の重複スポットによって認められるように、1コピーのETV6(緑色スポット)および1コピーのRUNX1(橙色スポット)が並置しているETV6−RUNX1転座を有するALL細胞である。略語:BFおよびBF1−明視野、CEP4−4番染色体計数プローブ、SG−SpectrumGreen、SO−SpectrumOrange、SYTOX AADv−SYTOX AADvanced。 図6は、本発明の適切な実施形態にしたがった免疫表現型検査の性能に及ぼす固定液および透過処理液の影響を示す。BB515と抱合したCD3クローンSK7で染色した健康な末梢血単核球(PBMC)を使用して、異なる固定および透過処理法を試験した。両プロトコール由来のアリコートを、細胞表面染色後(Post−Stain)、固定および透過処理後(Post−Fix/perm)、1M塩酸変性後(Post−Acid)、および蛍光in situハイブリッド形成後(FISH;Post−Hyb)のAMNIS ISX MKIIでの解析のために取り出した。この代表的な実験由来のデータにより、(A)70%メタノール+4%ホルムアルデヒド(FA)+5%酢酸(AA)での固定および透過処理後のCD3−BB515陽性染色細胞の喪失および相対蛍光強度の増加ならびに(B)4%FA+0.1%Tween20での固定および透過処理後のCD3−BB515陽性染色細胞の解像度の保存が実証された。プロトコールを通した陽性染色集団のシグナル解像度の低下は、480〜560nmの範囲(Ch02)で検出された陰性集団の自己蛍光の増加にも原因していた。 図7は、本発明の適切な実施形態にしたがって細胞解析法を使用した細胞外観の進行性の変化についての代表的な健康な血液試料の評価を示す。画像を、AMNIS ISX MKIIにて倍率40倍で作成した。(A)分離直後の新鮮な末梢血単核球(PBMC)。(B)細胞は、4%ホルムアルデヒド(FA)+0.1%Tween20での固定および透過処理後にインタクトなままであり、比較的十分に保存された。(C)細胞は、酸変性後に外観がより単調になった。(D)一晩のプローブハイブリッド形成後、細胞は、処理を通して細胞膜、細胞質、核の変化の一貫した顕著な変化の証拠として単調な外観であり続け、より大きくかつ丸く見える。 図8は、SpectrumOrangeおよびSpectrumGreenの蛍光FISHプローブ抱合体の比較を示す。この代表的なCLL患者由来のデータにより、Vysis CEP12−SpectrumOrange抱合プローブを使用してカウントしたFISH「スポット」数(A)がVysis CEP12−SpectrumGreen抱合プローブを用いてカウントしたFISH「スポット」数(B)と等しいことが実証された。 図9は、免疫フローFISHによる二重FISHプローブ解析を示す。この代表的な実験由来のデータにより、2つのFISHプローブが細胞に同時にハイブリッド形成することができることが実証された。核DNAの正確なハイブリッド形成を確認するためにHoechst 33342核染色剤を用いたVysis CEP12−SGプローブおよびCEP1−SOプローブとハイブリッド形成した細胞。 図10は、本発明の適切な実施形態にしたがって細胞解析法を使用した17p内の遺伝子座を欠失した代表的なCLL血液試料の評価を示す。(A)各CD3+T細胞におけるSureFISH 17p PMP FISHプローブのハイブリッド形成スポットの「スポットカウント」またはスポット数。(B)各CD19+B細胞におけるSureFISH 17p PMP FISHプローブのハイブリッド形成スポットの「スポットカウント」またはスポット数。ゲーティングした集団を、画像ギャラリー中に見ることもできる(C)。細胞166および641は、CD19−BV480陽性、CD3−V500c陰性、CD5−AF647陽性の17pモノソミーB細胞(del17p)であり、細胞724は、CD19−BV480陽性、CD3−V500c陰性、CD5−AF647陽性の17pダイソミーB細胞であり、細胞1610および2845は、CD19−BV480陰性、CD3−V500c陽性、CD5−AF647陽性の17pダイソミーT細胞である。オーバーレイ画像は、免疫表現型検査、17pプローブ、および核SYTOX AADvanced画像の重ね合わせである。 図11は、本発明の適切な実施形態にしたがった細胞解析法のプロトコールを示す。A:細胞集団を、免疫表現型マーカーの組み合わせの発現に基づいてゲーティングし、画像ギャラリーに示す。B:各細胞において目視可能なVysis CEP1 FISHプローブのハイブリッド形成の「スポットカウント」またはスポット数。C:FISHプローブスポット計数の正確度は、Vysis CEP1 FISHプローブシグナルの核マーカーHoechst33342との共存の解析によっても増加した。これは、ダブレット(細胞229および820)および核外のプローブシグナル(細胞13746)を除外している。適切には、異数性解析を正確に行うためにこれらの細胞は排除される。 図12は、プローブスポットの平均蛍光強度に基づいたスポットカウントの調整を示す。(A)2−スポット集団の平均蛍光強度(MFI)は、22266蛍光単位であり、3またはスポットのMFIは61511であった。(B)1−スポット集団のMFIは22343蛍光単位であり、2−スポット集団とほとんど同一であった。(C)B由来の1−スポット細胞のHoechstおよびCEP12−SpectrumOrangeのオーバーレイ画像ギャラリー。(D)A由来の2−スポット単細胞の画像ギャラリー。(E)A由来の2またはそれを超えるスポットを有する細胞クランプの画像ギャラリー。 図13は、本発明の実施形態にしたがって細胞解析法を実施したときの処理中の蛍光強度の減少を示す。免疫フローFISHを、(A)BB515、(B)BV480、および(C)AF647と抱合したCD19クローンHIB19で染色した末梢血単核球(PBMC)に対して実施した。アリコートを、細胞表面抗体染色後(post−stain)、4%ホルムアルデヒド(FA)+0.1%Tween20での固定および透過処理後(post−fix/perm)、1M塩酸(HCl)での酸変性後(post−acid)、および蛍光in situハイブリッド形成後(FISH)(post−hyb)のAMNIS ISX MKIIでの解析のために取り出した。この代表的な実験由来のデータは、(A)免疫フローFISHを通してCD19−BB515陽性細胞の解像度の保存が最高であったこと、(B)陽性細胞においてCD19−BV480蛍光が十分に保存されたこと、および(C)post−hybのCD19−AF647陽性細胞の喪失が顕著であったことが証明された。post acidおよび特にpost−hybのCD19クローンHIB19抗体によって染色された全陽性集団にわたってMFIが減少し、陽性集団のシグナル解像度はフルオロフォアに依存していた。全マーカーを使用した陽性集団のシグナル解像度の喪失は、post−hyb後の陰性集団の蛍光強度の減少およびバックグラウンド/自己蛍光の増加の両方に起因し、これは、全プロトコール後にCh02(480〜560nm)範囲およびCh11(670〜745nm)範囲と比較してCh07(430〜505nm)範囲で顕著に検出された。 図14は、本発明の実施形態にしたがって細胞解析法を実施したときの処理中のAPC蛍光の喪失を示す。細胞解析法を、BB515、APC、およびFITCと抱合したCD3クローンSK7で染色した末梢血有核細胞に対して実施した。アリコートを、細胞表面染色後(Post−Stain)、4%ホルムアルデヒド(FA)+0.1%Tween20での固定および透過処理後(Post−Fix/perm)、1M塩酸変性後(Post−Acid)、および蛍光in situハイブリッド形成後(FISH;Post−Hyb)のAMNIS ISX MKIIでの解析のために取り出した。この代表的な実験由来のデータにより、以下が実証された:(A)CD3−BB515陽性細胞の解像度の保存;(B)post−hybのCD3−APC陽性細胞の完全な喪失;および(C)フルオロフォアと無関係のCD3−FITC陽性細胞のpost−acid集団の顕著な喪失。さらに、陰性集団の自己蛍光は480〜560nmの波長(Ch02)においてpost−hybで増加し、BB515またはFITCと抱合された陽性染色亜集団の解像度も減少した。略語:APC−アロフィコシアニンフルオロフォア、BB515−Brilliant Blue515フルオロフォア、Ch−チャネル、FITC−フルオレセインイソチオシアナートフルオロフォア、ISX MKII− ImageStreamX MarkII 図15は、本発明の実施形態にしたがって細胞解析法を実施したときのビス(スルホスクシンイミジル)基質(BS3)架橋を使用した処理中の蛍光強度の保存を示す。細胞解析法を、染色後にBS3架橋を(A)用いない場合および(B)用いた場合の両方におけるAF647と抱合されたCD5クローンUCTHC2で染色した末梢血有核細胞に対して実施した。アリコートを、細胞表面染色および架橋後(Post−Stain)、4%ホルムアルデヒド(FA)+0.1%Tween20での固定および透過処理後(Post−Fix/perm)、1M塩酸変性後(Post−Acid)、および蛍光in situハイブリッド形成後(FISH;Post−Hyb)のAMNIS ISX MKIIでの解析のために取り出した。この代表的な実験由来のデータにより、免疫フローFISHプロトコール中にBS3架橋を用いた場合にCD3−AF647陽性染色細胞の数および蛍光強度が保存されることが実証された。略語:AF−アレクサフルオル。 図16は、本発明の適切な実施形態にしたがって細胞解析法を実施したときのCLL試料の評価のための2つの免疫表現型検査パネルの比較を示す。免疫表現型検査パネル1(A)、パネル2(B)を用いたCD3、CD5、およびCD19集団およびCEP12スポットカウントの代表的なCLL患者試料の評価は、等価な集団密度およびFISHスポットカウントを実証している。ゲーティングした集団を、画像ギャラリーに認めることができる。(C).免疫表現型検査パネル1では、細胞198は、CD19−BV480陽性、CD3−V500c陰性、CD5−AF647陽性のCEP12ダイソミーB CLL細胞であり、細胞392は、CD19−BV480陰性、CD3−V500c陽性、CD5−AF647陽性のCEP12ダイソミーTリンパ球である。(D)パネル2では、細胞4は、CD19−BV480陽性、CD3−AF647陰性、CD5−BB515陽性のCEP12ダイソミーB CLL細胞であり、細胞6764は、CD19−BV480陰性、CD3−AF647陽性、CD5−BB515陽性のCEP12ダイソミーTリンパ球である。オーバーレイ画像は、免疫表現型検査の画像およびCEP12プローブ画像の重ね合わせである。
実施形態の説明
便宜上、以下のセクションでは、本明細書中で使用した用語の種々の意味を概説している。この考察の後、本発明の組成物、医薬の使用、および方法に関する一般的な態様が考察され、本発明の種々の実施形態の性質および実施形態をどのように使用することができるかを実証する具体例が続く。
定義
将来の特許出願は、本出願に基づくか、本出願の優先権を主張して、オーストラリアまたは海外に出願する可能性がある。添付の特許請求の範囲はほんの一例として提供しており、任意の前述の将来の出願において主張し得る範囲を制限することを意図しないと理解すべきである。特徴を、1つまたは複数の発明をさらに定義するか再定義するために、後日に仮の請求項に追加するか、仮請求項から省略することが可能である。
本明細書、実施例、および添付の仮請求項で使用した一定の用語および句の意味を以下に提供する。当該分野での用語の用法と本明細書中に提供した定義との間に明らかな不一致がある場合、本明細書内に提供された定義が優先されるものとする。
当業者は、本明細書中に記載の発明が、具体的に記載されたもの以外の変更および修正の余地があると認識するであろう。本発明は、全てのかかる変形および修正を含む。本発明はまた、個別にまたは集合的に、本明細書で言及または示されるすべての工程、特徴、製剤、および化合物、ならびに工程および特徴のありとあらゆる組み合わせまたは任意の2つ以上を含む。
このテキストで引用されている各文書、参考文献、特許出願、または特許は、その全体が本明細書中で参考として明確に援用される。これは、前述の引用文献をこのテキストの一部として読者が読んで検討すべきであることを意味する。前述のテキストで引用されている文書、参考文献、特許出願、または特許がこのテキスト中で繰り返されていないのは、単に簡潔にするためである。しかし、引用されている資料またはその資料に含まれる情報は、一般的な知識ではないと理解すべきである。
本明細書中で、または本明細書中で参考として援用される任意の文書で言及される任意の製品の製造者の指示、説明、製品仕様書、および製品シートは、本明細書中で参考として援用され、本発明の実施において使用され得る。
本発明は、本明細書中に記載の特定の実施形態のいずれによってもその範囲が限定されるべきではない。これらの実施形態は、例示のみを目的とする。機能的に同等の製品、処方物、および方法は、明らかに本明細書中に記載の発明の範囲内にある。
操作例において、または別段の表示をしたときを除き、本明細書中で使用される成分または反応条件の量を表すすべての数字は、すべての例で用語「およそ」または「約」によって修飾されていると理解すべきである。百分率と併せて使用されるときの用語「およそ」または「約」は、±1%を意味し得る。
本明細書中に記載の発明は、値(例えば、サイズ、濃度など)の1つまたは複数の範囲を含み得る。値の範囲は、範囲内の全ての値(範囲を定義する値が含まれる)、および前述の範囲の境界を画定する値のすぐ近くにある値と同一または実質的に同一の結果をもたらす、前述の範囲に隣接する値を含むと理解されるであろう。例えば、当業者は、範囲の上限または下限の10%の変動が完全に適切であり得、本発明に包含されると理解するであろう。より具体的には、範囲の上限または下限の変動は、5%または当該分野で認識されている変動のうちのどちらか大きい方であろう。
本出願では、特に別記しない限り、単数形の使用には複数形が含まれる。本出願では、別段の記載がない限り、「または」は「および/または」を意味する。さらに、用語「含む(including)」ならびに「含む(includes)」および「含まれる(included)」などの他の形態の使用は、限定ではない。また、「要素」または「構成要素」などの用語は、特に明記しない限り、1つの単位を含む要素および構成要素ならびに1つを超えるサブユニットを含む要素および構成要素の両方を含む。また、用語「部分(portion)」の使用は、ある区分(moiety)の一部(part)または区分全体を含み得る。
本明細書を通して、文脈上別段の解釈を必要としない限り、用語「含む(comprise)」または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」などの変形形態は、述べられた整数または整数群を含むが、いかなる他の整数または整数群も排除しないことを意味すると理解されるであろう。
本明細書中で使用される選択された用語の他の定義は、発明の詳細な説明内に見出すことができ、本明細書を通して適用することができる。別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての他の科学用語および技術用語は、本発明に属する当業者が一般的に理解している意味を有する。
本発明の特徴は、以下の非限定的な説明および実施例を参照してここで考察されるであろう。
例示的な実施形態
第1の形態によれば、本発明は、細胞集団における状態を診断または予後診断する方法であって、
a.解析すべき細胞集団を選択し、細胞集団の抗原プロフィールを、フローサイトメトリーを使用して前述の集団を免疫表現型検査することによって解析して、測定または評価されるべき状態に関連する1つまたは複数の生物学的マーカーまたはパラメーターの有無を検出する、選択および解析する工程、および
b.前述の集団を前述の細胞を可視化してカウントすることが可能な少なくとも1つのFISHプローブに供して、特定の細胞をその正確な表現型によって同定し、表現型によって同定された細胞のゲノム異常を同定する、FISHプローブに供する工程
を含む方法にある。
方法の第1の工程によれば、フローサイトメトリーを使用した細胞集団の免疫表現型検査により、複数の蛍光パラメーターを同時に評価することができる。この工程は、集団の細胞形態(細胞特性)の可視化も可能であり、細胞の免疫表現型検査および膜上;細胞質内;核内のいずれかの抗原の位置の同定が可能である。
好ましくは、第2の工程では、FISHプローブは、その正確な表現型によって同定されたこれらの特定の細胞でカウントすべき蛍光「スポット」または別のシグナルを生成する。
次いで、(工程1および2由来の)両方のデータセットを使用して、イメージングフローサイトメトリーを用いて、特定の医学的状態または治療状態の有無を判定することができる。
本発明によれば、本明細書中に記載の例示的な方法は、血液学的悪性疾患の評価のために最適化されており、表現型によって同定された細胞における異数性ならびに欠失、転座、または融合が検出される可能性がある。好ましくは、本発明の方法を、以下のために使用することができる:
a.悪性疾患の診断、分類、および病期分類;
b.処置後残存疾患のモニタリングの評価。これは、疾患の重荷が低い疾患の検出を補助し、大量療法(患者のアウトカムの改善が予想される移植が含まれる)の早期導入が可能であろう;
c.予後の判断;および/または
d.処置の決定。
本発明の制限されない好ましい形態では、免疫フローFISH法を、新生物細胞の亜集団の遺伝子の相違の検出のために使用する。例えば、異なる遺伝子異常を有する新生物細胞の細胞動態(すなわち、倍数性、アポトーシス、および細胞周期)の相違および疾患進行に伴うゲノムドリフトまたはクローン進化(すなわち、新規の染色体異常の獲得)を研究することができる。これらの生物学的特徴を利用して、臨床転帰を改善する可能性がある治療(例えば、特定の標的療法)のタイミングおよび選択を修正することができる。
がん関連の解析に加えて、免疫フローFISHプロトコールを、非悪性疾患の調査(母体血中に存在する胎児細胞における染色体欠損の検出による出生前診断または血液キメラ現象(ある個体に由来する別の個体の血液中の遺伝的に異なる細胞の存在である)が含まれる)のために使用することができる。胎児−母体間輸送、双生児研究、固形臓器移植または同種造血細胞移植、および非白血球輸血が含まれるいくつかの臨床環境でこの調査が発生することが実証されている。したがって、いくつかの非悪性疾患で免疫フローFISH法が適用されている。
好ましくは、本発明の方法を、以下の例示的な方法の実行できる適用のうちの1つまたは複数の調査のために使用する:
a.以下などの非悪性疾患への適用:
i.出生前の適用
1.染色体欠損または母体血との相違を有する疾患の出生前診断:母体循環系内の胎児細胞(有核赤血球または栄養芽層)の同定
a.胎児起源の有核細胞:
i.HbF(細胞内)、CD71(トランスフェリン受容体)に対する抗体を使用した有核赤血球、またはHLA−Gに対する(そして、CD45に陰性の)抗体を使用した栄養芽層を同定するための免疫表現型
ii.目的の疾患のためのプローブ、
1.数:例えば、CEP21ダウン症候群
2.構造:あまり一般的でない
b.母体血中の男性起源の胎児リンパ球:
i.免疫表現型:CD45による同定(母系と胎児とを区別できないであろう)
ii.プローブ:Y染色体を有する男性の性別
ii.キメラ現象:
1.移植後性別不適合移植
a.免疫表現型:CD45によるリンパ球の同定(レシピエントとドナーとを区別できないであろう)
b.プローブ:X染色体およびY染色体
b.悪性疾患:
i.血液学的悪性疾患:表現型によって同定された新生物細胞における染色体異常の検出。適切な抗体−蛍光色素の組み合わせおよびプローブのみに制限される
1.分類:表現型および染色体を利用したWHO分類に基づいた疾患の診断および分類。
a.数の異常(「異数性」):モノソミー、トリソミー、テトラソミー、高二倍性、低二倍性(hypodipoidy)
i.例:急性白血病、慢性白血病、形質細胞性骨髄腫、骨髄異形成症候群、リンパ腫
b.構造異常:欠失、融合
i.例:急性白血病、慢性白血病、形質細胞性骨髄腫、骨髄異形成症候群、慢性好酸球性白血病、リンパ腫
2.処置の決定:表現型によって同定された特定の疾患(例えば、del(17p)を有する慢性リンパ球性白血病;del(5q)を有する骨髄異形成症候群)における染色体欠損の存在に基づいた処置の選択
a.高感度
b.低クローン負荷が検出され得る
3.予後診断:染色体の異常によって層別化された疾患、例えば、
a.慢性リンパ球性白血病
b.形質細胞性骨髄腫
c.骨髄異形成症候群
d.急性骨髄球性白血病
e.急性リンパ芽球性白血病
f.リンパ腫
4.残存疾患:
a.染色体欠損に基づいた微小残存病変の負荷
b.染色体欠損に基づいた新規のクローンの獲得
c.自家移植のための採取前の疾患根絶
d.感度の問題:感度1:10
i.形態学より高感度
ii.FISHより高感度(1〜5細胞/100)
iii.フローMRDより高感度
iv.RT−PCRより低感度かもしれない(1:10
ii.非造血細胞:診断および分類
1.原発性腫瘍:以下の鑑別診断
a.組織:組織から抽出した細胞。
i.数の異常:異数性(例えば、黒色腫対非定型母斑の鑑別診断)
ii.構造異常:欠失、融合(例えば、非ホジキンリンパ腫)
b.処置の決定:表現型によって同定された特定の疾患における染色体欠損の存在に基づいた処置の選択
2.転移性疾患:新生物細胞に特徴的な表面または細胞内の非造血抗原(non−haemopoietic antigen)によって同定する。
a.血液:循環腫瘍細胞(CTC)
b.例:乳房;黒色腫
c.骨髄:転移細胞
c.他の適用には、以下が含まれる:
i.DNA:特定の遺伝子領域のためのBAKプローブ
ii.RNAプローブ:転写物の検出
iii.科学的適用:
1.細胞倍数性(例えば、巨核球)
d.非ヒト遺伝子型の評価:
i.細胞内ウイルス検出:表現型によって同定されたヒト細胞に取り込まれたウイルスゲノムDNA配列の検出。
1.エプスタイン・バーウイルス(EBV):B細胞に感染し、細胞複製およびアポトーシスを調節解除する(例えば、MYC遺伝子およびBCL2L11遺伝子のハイジャック)公知のオンコウイルスである。
a.WHOによって分類されるように、血液学的悪性疾患(非ホジキンリンパ腫(すなわち、バーキットリンパ腫)およびホジキンリンパ腫など)は、潜伏EBV感染と強く関連する。
2.EBV DNAまたは関連転写物(例えば、ペプチド核酸プローブ)の検出用の市販のプローブを利用可能であり、EBVゲノムの特異的検出のための種々のタイプのフルオロフォアに抱合した特異的オリゴヌクレオチドプローブを合成することも可能である。
本方法を、導入遺伝子ベクター配列に対するプローブによるCAR−T細胞耐性を同定するために使用することもできる。特に、本方法を、操作された導入核酸配列および細胞内のその発現の検出のため使用することができる。
本発明のテクノロジーが特に有用な主な非悪性適用のうちの1つは、胎児の疾患、特にダウン症候群の出生前(または出産前)診断である。ダウン症候群は、例えば、1959年に最初に報告されており、オーストラリアでは1000人に1人、米国では800人に1人が罹患する、新生児における最も一般的な染色体状態である。ダウン症候群を有する人は、通常、特有の顔の特徴、いくつかの知的障害、心臓または消化管の問題、および視覚または聴覚の障害を有する。ダウン症候群は、2コピーの代わりに3コピーの21番染色体の存在に起因する(「トリソミー21」)。高齢の母親ほど卵子内の染色体数にエラーを有する可能性が高くなり、35歳を超える母親におけるダウン症候群を有する生産児の確率は1/259まで増加する(Morris JK,Mutton DE,Alberman E.Revised estimates of maternal age specific live birth prevalence of Down syndrome.Journal of Medical Screening.2002;9:2−6)。現在提供されている出産前スクリーニング検査には、妊娠初期のリスク評価、母体血清検体スクリーニング、および胎児構造の超音波解析が含まれる。これらはリスクを予測するだけであり、確認診断検査は侵襲的検査(羊水穿刺または絨毛生検)であり、胎児の損傷または流産の重大なリスクを伴う。診断には21番染色体のコピー数を検出する必要があり、この診断は、21番染色体を特異的に「タグ付けして識別する」ための全染色体分析(核型分析)またはFISHによって行われる。1969年に、母体循環系に少数の有核胎児赤血球(10,000母体血球あたり1)が存在することが最初に報告された。これにより、これらの血球を分離して非侵襲的な出産前検査に使用できる可能性が高まった。いくつかの分離、濃縮、評価方法が開発されたが、これらの方法の複雑さ、細胞収率の低さ、および結果の一貫性のなさにより、いずれの方法も臨床診療につながっていない。しかし、免疫フローFISH法は、分離、濃縮、または侵襲的検査を用いずに、胎児細胞内の21番染色体のコピー数を母体循環系内で判定可能である。
当業者は、出願人の免疫フローFISHプロトコールを、免疫表現型検査された試料の高処理FISH解析を必要とする多数の異なる試料の調査に適用することができ、そのようなものとして、国内外の診断病理検査室および研究所で大いに役立つ可能性があると認識するであろう。
第2の態様では、本発明は、細胞解析のための免疫フローFISH法であって、
a.細胞表面マーカー、細胞質マーカー、または核マーカー(抗原)を有する有核細胞を含む単細胞懸濁液を調製する工程;
b.前述の細胞マーカーを抗体染色して前述の細胞を表現型検査する、抗体染色する工程;
c.同一工程において細胞を固定および透過処理する工程;
d.細胞染色体(正常または異常)の検出のために前述の細胞に対して(本明細書中に記載の)細胞遺伝学的技術を実施する工程;
e.前述の細胞のDNAを染色する工程;および
f.前述の細胞に対してイメージングフローサイトメトリーを実施する工程
を含む、方法を提供する。
本発明の一形態において、本方法は、
a.イメージングフローサイトメトリーから得たデータを解析して、前述のデータ解析に基づいて医学的状態または治療状態の有無を検出する、解析する工程をさらに含む。
好ましくは、本発明の実施において、プロトコールを通して試料を光から防御する。
細胞試料の調製において、試料を、軽度疾患または障害を罹患している疑いのある被験体から採取する。試料は、末梢血もしくは骨髄または組織の試料を含み得る。例えば有核細胞を含む末梢血から試料を採取する場合、試料中の有核細胞は、悪性細胞(例えば、CLL細胞)および正常な染色体を有する健康なコントロールとして解析で使用することができるリンパ球(例えば、Tリンパ球)を含み得る。
好ましくは、方法で使用される試料は、1×10個と5×10個との間またはこれらの細胞数の間の任意の数の有核細胞を有するであろう。
最初に、試料が血液または骨髄である場合、好ましくは赤血球を溶解することによって単細胞懸濁液を調製する。試料を、好ましくは塩化アンモニウムなどの低張緩衝液または塩化アンモニウムカリウムなどの市販の溶解液の存在下でインキュベートするか、0.1%のTriton X−100、NP−40、またはBrij−58での処理によって調製することができる。単細胞懸濁液を、密度勾配遠心分離、磁気細胞分離、または酵素消化によって調製することもできる。遠心分離の条件は、細胞を破損することなく細胞を分離するのに十分な条件であろう。かかる条件は、当業者に認識されているであろう。
試料が組織生検である場合、有核細胞の単細胞懸濁液を、組織基質および細胞間接着を切断(「消化」)するための酵素(コラゲナーゼ、プロテアーゼ、およびDNアーゼIなど)を含む緩衝液と試料をインキュベートすることによって調製する。
試料を凍結保存する場合(例えば、バイオバンク)、有核細胞の細胞懸濁液を、塩化マグネシウムおよびDNアーゼI酵素を含むロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地または類似の培地中で試料を解凍および洗浄することによって調製することができる。
細胞試料調製工程はまた、遠心分離工程(例えば、200×gで5分間または任意の同様の分離速度での遠心分離を含む)、その後の有核細胞からの溶解または消化された細胞材料の分離のための上清の除去を含み得る。
好ましくは、工程はまた、例えば、5ml PBSを用いた200×gで5分間の遠心分離を含む洗浄工程を含む。遠心分離の条件には、細胞を破損することなく細胞を分離するのに十分な条件が含まれ、この条件は当業者に認識されているであろう。
本発明によれば、細胞マーカーの抗体染色は、好ましくは、目的の集団の適切な免疫表現型検査であるBD BioscienceまたはBioLegendなどの企業から購入した抗体(例えば、慢性リンパ球性白血病 [CLL] 解析のための抗ヒトCD19、CD5、およびCD3)の免疫表現型検査のための抗体混合物で有核細胞を染色することを含む。かかる免疫表現型検査抗体は市販されており、以下の抗体が含まれる:FITC−CD3、FITC−CD4、BB515−CD3、BB515−CD4、BB515−CD5、BB515−CD19、BB700−CD4、PE−CD3、PE−CD4、PECy5−CD4、PECF594−CD4、PECy7−CD4、PECy7−CD19、PerCPCy5.5−CD4、BV421−CD4、BV480−CD3、BV480−CD4、BV480−CD5、BV480−CD19、BV510−CD4、V500c−CD3、BV605−CD4、BV650−CD4、BV650−CD19、BV711−CD3、APC−CD3、APC−CD4、APC−CD19、AF647−CD3、AF647−CD5、AF647−CD19、APCCy7−CD4、APCH7−CD3、APCH7−CD19、AF700−CD3、AF700−CD4、APCR700−CD4、APCeFlour780−CD3、APCeFlour780−CD19、またはAPCFire750−CD3。
抗体染色は、抗体がその細胞の抗原またはリガンドに結合するのに十分な時間細胞をインキュベートすることをさらに含み得る。例えば、細胞を、およそ4℃でおよそ30分間インキュベートすることができる。抗体染色の条件は、細胞を破損することなく抗体抗原相互作用を容易にするのに十分な条件であろう。かかる条件は、当業者に認識されているであろう。
抗体染色はまた、過剰な非結合抗体を除去するための洗浄工程を含み得る。かかる工程を、800uL 2%FCS/PBSおよび950×gで3分間の細胞の遠心分離を用いて行うことができる。しかし、かかる環境における洗浄条件は、結合した抗体を除去しないようにしながら非結合抗体を除去するのに十分な条件であり、この条件は当業者に認識されているであろう。
本発明によれば、細胞固定工程は、好ましくは、ホルムアルデヒドを試料に添加することを含む。最適なレジメンは、およそ4パーセントのホルムアルデヒドを細胞懸濁液とインキュベートすることである。代替の細胞固定には、以下が含まれる:0.5〜3%ホルムアルデヒド;カルノア固定液(メタノール3:1酢酸);メタノール50〜100%;70%メタノール+4%ホルムアルデヒド+5%酢酸;50%メタノール+4%ホルムアルデヒド+5%酢酸;70%メタノール+4%ホルムアルデヒド;70%メタノール+5〜25%酢酸;ホルムアルデヒド4%+0.1%Tween20、および70%アセトン。さらに、この4パーセントのホルムアルデヒド固定工程は、およそ0.1パーセントの非イオン性界面活性剤の非イオン性界面活性剤の添加を含み得る。非イオン性界面活性剤は、FISHのために標的DNAにプローブがアクセスできるようにするための細胞透過処理に必要である。ホルムアルデヒドと非イオン性界面活性剤の組み合わせにより、単一の工程で細胞を固定および透過処理することが可能であり、この組み合わせはより経済的であり、プロトコールにおける時間および操作が削減される。例えば、非イオン性界面活性剤はTween20であり得る。このTween20は、通常、フローサイトメトリーまたは細胞内抗原もしくは標的DNAをそれぞれ検出するためのFISHでの適用の両方のための細胞透過処理のために利用される。望ましくは、試料はまた、ホルムアルデヒドおよびtween20での固定および透過処理のために、インキュベーション、洗浄、および/または遠心分離にこの順序で供される。
次いで、試料を、固定後に、例えば、4℃で3〜5日間保存するために、ウシ胎児/ウシ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、その間に、試料を輸送するか、または他の試料とまとめ、その後にハイブリッド形成および解析することができる。
細胞遺伝学的技術の実施には、細胞をプローブ、好ましくはFISHプローブとハイブリッド形成する必要がある。この点において、細胞遺伝学的技術の工程には、DNAの変性、非特異的プローブDNA結合のブロッキング、および試験中の細胞内の核物質とのFISHプローブのハイブリッド形成の工程も含まれ得る。
酸を使用してDNAを変性させることができる。変性のために酸を使用する場合、酸は、好ましくは、およそ0.5M〜1Mの濃度の塩酸である。試験した別のDNA変性条件には、以下が含まれる:0.5〜4M塩酸;5〜25%酢酸;5〜15%ジメチルスルホキシド(DMSO);70%アセトン、および0.1ug/mlプロテイナーゼK。
細胞遺伝学的技術工程の好ましい形態において、細胞を、3mlの氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でクエンチする。次いで、クエンチした細胞を、600×gで10分間遠心分離し、上清を除去する。
好ましくは、ブロッキング工程の間に、非特異的プローブDNAを、FISHプローブハイブリッド形成物への結合からブロックする。試料をPBS/BSAに曝露し、次いで、細胞を洗浄すること(例えば、1ml PBS/BSAを使用した950×gで3分間の遠心分離)によってこれを行うことができる。次いで、得られた上清を除去することができ、細胞を、ハイブリッド形成緩衝液(FISHプローブ解析用の50%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、0.1%Tween20を含む2×標準クエン酸ナトリウムなど)に再懸濁する。本発明のこの形態では、次いで、細胞を、73〜74℃まで加熱してDNAを変性させ、そして/またはプローブアニーリングを容易にする。この工程を、好ましくは、自動サーモサイクラーで行う。次いで、細胞を、ストリンジェンシー溶液(0.1〜0.3%Igepal CA−630を含む0.4〜2×標準クエン酸ナトリウム緩衝液など)で少なくとも1回洗浄し、再懸濁することができる。Igepal CA−630は、膜性構成要素および非特異的プローブ結合を溶解する非イオン性界面活性剤であり、標準クエン酸ナトリウムは、細胞を懸濁液中に維持しながら濃度依存様式で(すなわち、塩濃度が低いほどストリンジェンシーが高い)非特異的プローブ結合を不安定化もする塩である。次いで、細胞の核DNA染色を行い、この染色は、室温で20分間のHoechst(1:1000または1ug/ml)またはSYTOX AADvanced(1:5000または0.2uM)を含み得る。
本発明によれば、細胞に対してイメージングサイトメトリーを実施する工程は、励起レーザーを使用することおよび明視野画像を取り込むことを含み、蛍光発光および画像の波長範囲は515〜810nmである。励起レーザーは、100mW 405nm、および/または50mW 488nm、および/または150mW 561nm、および/または150mW 592nm、および/または120mW 642nmのレーザーを含み得る。イメージングサイトメトリーの実施は、好ましくは、少なくとも40倍の対物レンズを使用して画像を取り込むことを含む。画像を、30倍〜70倍の範囲の対物レンズで取り込むことができる。望ましくは、画像を、およそ60倍の対物レンズで取り込むことができる。
イメージングサイトメトリーの実施はまた、散布図中の細胞を同定することを含み得る。最低でも試料中の10,000細胞が記録されることが適切であり、合計で100,000〜1,000,000細胞が記録されることが好ましい。さらに、単一の染色細胞を、明視野および785nmの「散乱」レーザーの非存在下で解析することができ、補正行列を計算することができる。
本発明によれば、イメージングフローサイトメトリー工程において、免疫フローFISHのデータ解析を、画像解析ソフトウェア(IDEAS(AMNIS Merck,Seattle,USA)、CellProfiler(Broad Institute,Massachusetts,USA)、およびFCS Express v6 Image Cytometry(De Novo Software,California,USA)など)を使用して行う。データ解析は、画像の鮮明さまたは品質を測定すること(例えば、勾配二乗平均平方根、すなわちGRMS)によって、焦点画像を選択することを含むことができ、それにより、FISH解析のためのプローブスポットカプンとの正確度が向上するであろう。好ましくは、データをアスペクト比対明視野領域の散布図にして単細胞を同定し、偽陽性のFISH結果(例えば、高数性)を生じ得るダブレットおよび細胞クランプを除去する。
解析は、蛍光強度の高い細胞を排除することによって蛍光強度ヒストグラム中の有核非分裂細胞を同定する工程も含み得る。かかるデータ解析は、理想的には、使用したアプリケーションおよび細胞マーカーに応じて、正常なリンパ球(すなわち、Tリンパ球、Bリンパ球)および悪性細胞(例えば、CLL、急性骨髄球性白血病、形質細胞性骨髄腫の細胞)などのマーカーの蛍光強度に基づいて目的の細胞集団をゲーティングする工程を含むであろう。
好ましくは、データ解析は、2つの画像がマスキングした領域内で線形に相関する程度の尺度を使用して、FISHプローブシグナルの核染色剤との共存を決定することを含む。データ解析は、ピーク、スポット、または強度マスクを使用して、細胞あたりのFISHプローブスポット数をカウントすることを含み得る。これは、各ピクセルが特定のスポットまたはバックグラウンドに連結するかどうかに基づいた各ピクセルの連結性を試験することを含み得る。好ましくは、スポットカウントを、各スポットカウント集団についてFISHシグナルの蛍光強度の測定値を比較する単一パラメーターヒストグラムによって検証する。
第3の態様では、本発明は、細胞解析のための診断方法であって、
a.有核単細胞懸濁液を調製する工程;
b.(a)で生成された懸濁液由来の細胞表面マーカー、細胞質マーカー、または核マーカーを抗体染色し、染色された抗体を検出する工程;
c.同一工程において懸濁液中の細胞を固定および透過処理する工程;
d.DNAを変性させ、非特異的プローブDNA結合をブロッキングし、FISHプローブを試験中の細胞内の核物質とハイブリッド形成させる工程;
e.細胞に対してイメージングフローサイトメトリーを実施する工程;および
f.工程(e)由来のデータを解析して、工程(b)および(e)由来の結果に基づいて医学的状態の有無を診断する、解析する工程
を含む、方法を提供する。
本発明の第3の態様の特定の形態では、方法は、以下の工程を含む:
a.有核細胞を単離し、細胞懸濁液を調製する工程;
b.特に試験される条件について細胞マーカーを認識する免疫表現型検査抗体を使用して抗原−抗体複合体を形成することによって細胞表面抗原、細胞質抗原、または核抗原を染色する工程、
c.安定化を含む完全な抗原抗体反応を行い、80分以内にクエンチする工程、
d.次いで、同一工程において細胞を固定および透過処理する工程、
e.次いで、細胞由来のDNAを変性させ、低濃度の塩酸を用いてクエンチする工程;
f.次いで、好ましくはBSAを用いて非特異的プローブDNA結合をブロックする工程;
g.次いで、少なくとも1つのFISHプローブを添加し、DNAにアニーリングし、ハイブリッド形成させる工程;
h.次いで、試料を、ストリンジェントな条件下で洗浄して過剰なFISHプローブを除去する、洗浄する工程;
i.次いで、DNAを染色して核を可視化し、フローサイトメトリーを使用して試料を試験する工程;
j.次いで、工程(b)および(i)由来のデータを、ImageStreamXを使用して解析して、医学的状態(CLLにおけるトリソミー12(染色体数の増加)または欠失17p(染色体の一部の喪失)など)の有無を判定する、解析する工程。
特に、このプロトコールは、一定の重要な点で以前の先行技術のプロトコールと異なる(表1を参照のこと)。例えば、血液試料および骨髄試料において、最初に赤血球を溶解する。この溶解を、低張液(塩化アンモニウムまたはBD PharmLyse(BD Bioscience,Sydney,Australia)のような市販の溶液など)との試料のインキュベーションによって行うことができる。次に、同一工程において細胞の固定および透過処理を行い、それにより、より効率的に透過処理が行われる。第3に、抗体抗原架橋クエンチ後の洗浄工程の省略により、細胞の破損が軽減され、プロトコール終了時の収率がより向上する。次に、酸濃度が低いことにより、プロトコール終了時の細胞収率が大幅に改善される(免疫−S−FISHプロトコールに制限される)。次に、DNAとFISHプローブのハイブリッド形成工程中に、本方法は、非特異的プローブDNA結合のためのBSAを用いたブロッキング工程を含む。次に、ストリンジェンシー洗浄の順序が、プローブ製造者(例えば、Vysis CEPプローブについてはAbbott Molecular)の推奨事項と比較して逆であり、それにより、非結合FISHプローブおよび非特異的FISHプローブ結合がより適切に除去される。
第4の態様では、本発明は、本発明の方法の1つまたは複数の構成要素を、方法におけるキットの使用方法についての説明書と共に含む診断キットを提供する。
特に、本発明は、(a)少なくとも1つの標準的なフローサイトメトリーに適切なマーカー検出システム、(b)1つまたは複数の本発明のFISHプローブを含むキットであって、(a)および(b)の各々が、1つまたは複数の容器に、本発明の方法における(a)および(b)の使用に関する指示および/または情報を提供する指示書または情報小冊子と組み合わせて存在する、キットに及ぶ。
さらに、キットは、1つまたは複数の容器に本発明の方法での使用に適切な1つまたは複数の緩衝液も含むことができる。
好ましくは、キット中に存在するマーカー検出システムは、細胞試料の免疫表現型検査に適切な抗体である。
Figure 2021501885
方法の実例
本発明を、ここに、以下の本発明の特定の非限定的な例を考慮して記載するであろう。
本発明の非常に好ましい例では、免疫フローFISHプロトコールは、制限されないが以下の工程を含み、以下の工程は個別に提示されているが、共通の段階で共にグループ化することができる:
a.細胞試料を採取し、単細胞懸濁液を調製する(例えば、血液/骨髄中の赤血球(RBC)を溶解し、酵素とインキュベートして組織生検中の組織基質を除去するか、凍結保存された試料を解凍する);
b.製造者の説明書に従って細胞を蛍光抱合された抗体と4℃で30分間インキュベートして細胞の抗原を検出する;
c.細胞をPBS/2%FCSで洗浄する;
d.1mM BS3中にて4℃で30分間インキュベートする(細胞を洗浄しない);
e.100mM Tris−HCL pH7.4/150mM NaClとインキュベートし、4℃で20分間クエンチする(好ましくは、吸引しない);
f.0.1%Tween20を含む4%ホルムアルデヒドを添加し、穏やかに吸引して混合し、室温で10分間インキュベートする;
g.細胞をPBS/2%FCSで洗浄する;
h.0.5M HCL(酸)にて室温で20分間インキュベートする;
i.氷冷PBSを添加し、600×gで10分間遠心分離し、上清を除去する;
j.PBS/1%BSAで試料をブロックする;
k.洗浄し、上清を除去する;
l.0.1%NP−40を含む2×SSCに再懸濁する−細胞を0.2ml微量遠心管に移す;
m.950×gで3分間遠心分離し、全ての過剰な緩衝液を除去する;
n.FISHプローブを含むCEPハイブリッド形成緩衝液に再懸濁する;
o.73〜74℃で5分間変性させる;
p.37℃で16〜20時間ハイブリッド形成させる;
q.0.1%NP−40を含む2×SSCで洗浄し、上清を除去する;
r.0.3%NP−40を含む0.4×SSC(42℃に予熱する)に再懸濁し、42℃で5分間インキュベートする;
s.細胞をPBS/2%FCSで洗浄する;
t.DNA染色剤(例えば、SYTOX AADvancedのPBSでの5倍希釈液)に再懸濁し、室温で20分間インキュベートする;
u.AMNIS ImageStreamXにて倍率60倍およびEDFを用いて解析する。
この方法では、以下の略語を使用する:
a.BSA−ウシ血清アルブミン
b.CEP−染色体計数プローブ
c.DAPI−DAPI(4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)
d.EDF−被写界深度
e.FBS/FCS−胎児ウシ血清(別名FCSまたは仔ウシ血清)
f.PBS−リン酸緩衝生理食塩水
g.SSC−生理食塩水−クエン酸ナトリウム
好ましくは、上記のように、プロトコールを通して試料を光から防御する。
好ましくは、免疫フローFISHプロトコールで解析される細胞は有核細胞であり、特に、このプロトコールにより、染色体(1、12、および17番染色体など)および/もしくは染色体の一部、遺伝子座、または遺伝子(17番染色体の短腕上の遺伝子など)を解析可能である。
かかる細胞および遺伝子材料を解析して、遺伝子または染色体の獲得または喪失から生じる細胞遺伝学的異常または先天性障害を同定することができる。
特定の態様では、免疫フローFISHプロトコールを使用して、医学的状態(慢性リンパ球性白血病(CLL)など)を染色体の変化(トリソミー12または17pの欠失(del17p)など)について試験することができる。本発明の説明を容易にするために、例として、12番染色体のコピー数および17pの欠失(del17p)についての慢性リンパ球性白血病(CLL)の試験における正常な血液Bリンパ球およびTリンパ球集団の解析での免疫フローFISHプロトコールを記載している。したがって、これらの例は、健康で正常なB細胞集団およびT細胞集団における1番および12番染色体ダイソミー解析ならびにCLLにおける12番染色体トリソミー解析(図2)を用いた染色体数解析、ならびに構造変異(17p番染色体上の遺伝子座の欠失など)への本方法の適用を例示している。
生存染色
死細胞は「粘着性」を示し、免疫表現型検査のために使用される抗体への非特異的な結合により偽陽性の結果を生じ得る。従来のフローサイトメトリー免疫表現型検査のアッセイにおいて生存細胞と死細胞の相対比率を決定することは日常的な作業である。この決定は、しばしば、生存染色(すなわち、損傷した/透過処理した膜を有する細胞内の核酸のみを染色する細胞不透過性色素(ヨウ化プロピジウム、7AAD、またはDRAQ7など)での生(非固定)細胞の染色)によって行われる。このDNA染色は、蛍光染色とDNAとが平衡状態にある場合に生じるため、その後の処理中にDNAから染色剤が解離し、最終的には試料中の全ての細胞が染色される。
現在のプロトコールによれば、生存細胞に対して弱い陽性蛍光を示す(表面アミン染色のみ)のに対して、死細胞には強い陽性染色を示す(表面および細胞内のアミン染色)アミン反応性色素であるBioLegend Zombie Dyes、eBioscience Fixable Viability Dye(FVD)eFluor780、またはThermo FisherのLIVE/DEAD Fixable Viability Dyesなどの固定可能な生存マーカーを使用することが好ましい。固定可能な生存色素の最適量を、予備滴定試験によって決定される必要があり得る。
有核単細胞懸濁液の調製
好ましくは、免疫フローFISHプロトコールの第1の工程は、患者から試料を単離することを含み、前述の試料は、およそ5×10個の細胞を含む。かかる試料は、イメージングフローサイトメトリーによって少なくとも200,000の事象を解析することが可能であろう。
好ましくは、プロトコールの構築において、既知の染色体の異常を有するポジティブコントロール(トリソミー12を有することが知られているCLL患者または細胞培養物など)およびネガティブコントロール(トリソミー12を持たないCLL患者または健康なドナー血液など)も存在するであろう。
例示的なプロトコールでは、血液から有核単細胞懸濁液を調製する工程は、以下を含み得る:
a.前腕前部静脈穿刺によって健康なボランティアおよびCLL患者からVACUETTE EDTA真空採血管(Greiner Bio−One Preanalytics,Frickenhausen,Germany)に採血すること;
b.全血を1:40体積のBD PharmLyse(BD Bioscience,Sydney,Australia)(緩衝化塩化アンモニウムベースの溶解試薬、pH7.1〜7.4)と(例えば、250μLの血液を10mL PharmLyseと)10分間インキュベートして赤血球を溶解することによって末梢血有核細胞を調製すること(凍結保存された試料を、5mM塩化マグネシウムおよび10U/mL DNアーゼI酵素を含むRPMI培地で急速解凍し、洗浄することができる);および
c.細胞を200gで5分間遠心分離し、上清を除去すること。
さらに、方法におけるこの工程は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、胎児ウシ血清(FBS)やEDTAを含まない)での細胞の洗浄(好ましくは、2回)および200gで5分間の遠心分離を含み得る。任意選択的に、洗浄緩衝液は、(プロトコールを通して)PBS/2〜6%FBS、PBS/0.5〜1%BSA、PBS/2%FBS/1〜5mM EDTA、PBS/1mM EDTAを有する。最適な洗浄緩衝液は、新たに採取した試料についてはPBS/2%FBSであり、凍結保存された試料についてはPBS/1mM EDTAである。
表面マーカーの抗体染色(免疫表現型検査)
プロトコールの次の工程は、細胞抗原を染色することである。本発明の1つの例において、これは、細胞のマーカーの抗体ベースの染色を含む。プロトコールはまた、特異的抗体抗原結合と非特異的な細胞への抗体の結合とを識別する「アイソタイプコントロール」を含み得る。アイソタイプコントロール抗体での染色によってこれを行う。
さらに、マルチパラメトリック解析を行う場合、プロトコールはまた、バックグラウンドレベルを超える蛍光を示す細胞を正確に同定可能な「フルオレセンス・マイナス・ワン(FMO)」コントロールを含み得る。好ましくは、データ解析中に細胞の自己蛍光のバックグラウンドレベルを判定するための未染色試料も含まれる。アイソタイプコントロールおよびFMOコントロールは、完全なプロトコールを経て進行しないので、試料あたり1×10細胞のみを必要とし得る。表2は、CLLの場合の12番染色体のコピー数の評価のための試料およびコントロールの設定を示す。
Figure 2021501885
AF647−アレクサフルオル647フルオロフォア、BB515−Brilliant Blue 515フルオロフォア、CLL−慢性リンパ球性白血病、PBMC−末梢血単核球、CEP−染色体計数プローブ、FMO−フルオレセンス・マイナス・ワン
本発明の1つの例示的な形態において、細胞のマーカーの抗体染色工程(免疫表現型検査)は、
a.以下を含む免疫表現型検査抗体カクテルで有核細胞を染色する工程:
i.CLL評価のためのAF647抱合マウス抗ヒトCD3(クローンSK7,Australian Biosearch)、BD Horizon BB515抱合CD5(クローンUCHTC2,BD Biosciences)、およびBD Horizon BV480抱合マウス抗ヒトCD19(クローンSJ25C1,BD Biosciences)(図2、表3a);または
ii.CLL評価のためのBD Horizon V500c抱合マウス抗ヒトCD3(クローンSK7,BD Biosciences)、AF647抱合CD5(クローンUCHTC2,Australian Biosearch)、およびBD Horizon BV480抱合マウス抗ヒトCD19(クローンSJ25C1,BD Biosciences)(表3a);または
iii.急性リンパ芽球性白血病評価のためのBD Horizon BB700抱合マウス抗ヒトCD22(クローンHIB22,BD Biosciences)、BV421抱合マウス抗ヒトCD34(クローン581,BD Biosciences)、V500c抱合マウス抗ヒトCD45(クローン2D1,BD Biosciences)、BV605抱合マウス抗ヒトCD10(クローンHI10A,BD Biosciences)、AF647抱合CD19(クローンHIB19,Australian Biosearch)、およびFixable Viability Dye eFluor780(ThermoFisher Scientific)(図3、表3b);または
iv.多発性骨髄腫評価のためのBD Horizon BV480抱合マウス抗ヒトCD38(クローンHIT2,BD Biosciences)、V500c抱合マウス抗ヒトCD138(クローンMI15,BD Biosciences)、BV605抱合マウス抗ヒトCD45(クローンHI30,BD Biosciences)、AF647抱合CD19(クローンHIB19,Australian Biosearch)、およびFixable Viability Dye eFluor780(ThermoFisher Scientific)(図4、表3b);or
v.製造者の推奨に従った適切なアイソタイプコントロール(表3);
b.5×10細胞を4℃で30分間インキュベートする工程;
c.細胞をPBS/2%FBSで洗浄する工程;および
d.細胞を950gで3分間遠心分離する工程
を含む。
Figure 2021501885

試験したフルオロフォアに関連するチャネルのみを列挙している。**CD3クローンSK7、CD5クローンUCTHC2、CD19クローンSJ25C1。略語:AF647−アレクサフルオル647フルオロフォア、BF−明視野、BB515−Brilliant Blue 515フルオロフォア、BV480−Brilliant Violet 480フルオロフォア、CEP−染色体計数プローブ、Ch−チャネル、Del−欠失、SG−SpectrumGreen、SO−SpectrumOrange、OR−OrangeRed
Figure 2021501885
Figure 2021501885
試験したフルオロフォアに関連するチャネルのみを列挙している。略語:AF647−アレクサフルオル647フルオロフォア、ALL−急性リンパ芽球性白血病、BF−明視野、BB515−Brilliant Blue 515フルオロフォア、BB700−Brilliant Blue 700 フルオロフォア、BV421−Brilliant Violet 421 フルオロフォア、BV480−Brilliant Violet 480 フルオロフォア、Ch−チャネル、G−Greenフルオロフォア、R−Redフルオロフォア、SG−SpectrumGreen、SO−SpectrumOrange
酸変性中の細胞の抗原へのフルオロフォア抱合抗体結合の安定性を改善するために、細胞を、製造者の推奨事項にしたがって1mMビス(スルホスクシンイミジル)基質(BS3)のMilliQ水溶液(アミン−アミン架橋剤(Thermo Scientific,Sydney,Australia))中にて4℃で30分間インキュベートし、その後に5体積の100mM Tris−HCL(pH7.4)/150mM NaCl中にて4℃で20分間クエンチする。
固定および透過処理
本発明の1つの例示的な形態において、固定工程は、
a.0.1%Tween20を含む新たに調製した4%ホルムアルデヒドを細胞溶液に添加し、穏やかに吸引することによって混合すること;および
b.細胞溶液を室温で10分間インキュベートして、細胞タンパク質を固定し、細胞膜を透過処理すること
を含む。
本発明の別の形態において、工程(a)は、1〜4.2%ホルムアルデヒド固定および0.05〜2.5%Tween20を含むことができ、ここで、ホルムアルデヒドの最適量は4%であり、Tween20の最適量は0.05〜0.1%である。
ホルムアルデヒドは、フローサイトメトリーにおける一般的な固定液であり、これは、細胞のタンパク質を架橋し、可溶性タンパク質を細胞骨格に係留して細胞構造を保持する。ホルムアルデヒド固定は、細胞の形態を維持し、FISHシグナルを頑強にすることが可能である。別の形態では、アルコールを使用して、タンパク質の沈殿/変性によって細胞を固定することができ、酢酸(例えば、カルノア固定液)と組み合わせて使用することで形態およびDNAの完全性をより適切に保持することができる。カルノア固定液はスライドFISH関連プロトコールのために日常的に使用されるが、ほとんどの市販のフルオロフォアを破損し、その結果、固定工程中に蛍光および免疫表現型検査が損なわれるので、このプロトコールで使用することができない。本発明者らは、メタノールベースの固定によって細胞が適切に固定されるが、免疫フローFISHプロトコールにおいては、最適な結果が得られるのでメタノールを含まないホルムアルデヒドを使用したホルムアルデヒド固定が好ましいことを確認した。
この工程はまた、インタクトな細胞の十分な透過処理(プローブの核に接近させる処理)を容易にする。すなわち、ホルムアルデヒドを非イオン性界面活性剤(例えば、Tween20)などの原形質膜可溶化試薬と組み合わせて使用したときに細胞を透過処理することができる。しかし、フローサイトメトリーのために利用可能な様々な透過処理のキットおよびプロトコールが存在する。適用される方法は、通常、調査中の細胞型およびその後の分析に依存する(例えば、サイトカインおよび核膜タンパク質の細胞内染色)。例えば、サポニンは膜コレステロールを選択的に除去して細胞膜に穴をあけるが、多数の細胞型はサポニン活性に耐性がある。TritonX−100は、細胞透過処理プロトコールのために広く使用されている非イオン性界面活性物質の別の例であるが、これは、細胞膜を迅速に破壊する即効性の「強力な」界面活性剤であり、引き続くインキュベーション後の核酸蛍光解析を10分間もの短期間に短縮することが認められている(Amidzadeh Z,Behbahani AB,Erfani N,et al.Assessment of different permeabilization methods of minimizing damage to the adherent cells for detection of intracellular RNA by flow cytometry.Avicenna J Med Biotechnol.2014;6(1):38−46)。Tween20(本プロトコールで好ましい)は、より親水性の高い非イオン性界面活性剤であり、したがって、細胞膜をよりゆっくりと穏やかに透過処理する弱い乖離剤である。Tween20のような弱い界面活性物質を使用することの利点は、TritonX−100などの即効性の薬剤と比較したときに科学的純度の変動が小さいのでその作用に影響を及ぼす可能性が低く、それにより、実験中または診断研究所間で界面活性剤の異なるバッチを使用した場合により再現性の高い結果が得られるという点である。さらに、ある範囲の細胞型(例えば、末梢血球、脾細胞、およびいくつかの組織培養細胞株)にわたって細胞膜への影響が類似していることが認められており、免疫フローFISH解析中の細胞内での試薬によって変動が生じる可能性が低くなる。
例示のプロトコールでは、本発明者らは、0.1%Tween20を使用する。これにより、他のハイブリッド形成研究で認められるように、FISHプローブが細胞膜の完全性を損なうことなく細胞に侵入するのに十分な大きさの孔が細胞膜に生成される。0.1%Tween20溶液はまた、細胞膜を破壊し、その後の酸変性およびハイブリッド形成中に高度に細胞喪失させる濃度よりも十分に低い濃度である。
上記工程後、細胞をPBS/2%FBSで洗浄する。細胞を、酸変性(次の工程)前に950gで3分間遠心分離することもできる。
任意選択:試料を、固定後に、4℃で3〜5日間保存するために、胎児仔ウシ/ウシ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁することができ、その間に、試料を輸送するか、または他の試料とまとめ、その後にハイブリッド形成および解析することができる。
DNA変性条件およびFISHプローブハイブリッド形成条件
本発明の1つの例示的な形態において、DNAを変性し、FISHプローブをハイブリッド形成する工程は、以下を含む:
a.0.5M〜1M(好ましくは、0.5M HCl)塩酸(37%AnalaR,SG1.18,Normapur,VWR Sydney,Australia)にて室温で20分間DNAを変性すること;
b.氷冷PBS中でクエンチすること;
c.遠心分離し、細胞をPBS/1%BSAに再懸濁して非特異的プローブ結合をブロックすること;
d.細胞を再度遠心分離すること;
e.細胞を、0.1%Igepal CA−630(Sigma−Aldrich,Sydney,Australia)を含む2×標準クエン酸ナトリウム(SSC)緩衝液(3M塩化ナトリウムおよび0.3Mクエン酸ナトリウムのMilliQ水溶液(pH7)の20×SSCストックからMilliQ水で20倍に希釈する)に再懸濁すること;
f.細胞を最大容積0.2mlの回収用PCRチューブ(Axygen,California,USA)に移すこと;
g.950gで遠心分離すること;
h.ピペットによって全ての上清を慎重に除去すること;および
i.単一FISHプローブ解析については、MilliQ水(2μL)および1μL FISHプローブを含むハイブリッド形成緩衝液(7μL)に細胞を再懸濁し、または、二重FISHプローブ解析については、MilliQ水(1uL)および1μLの各FISHプローブ(全部で2μLのプローブ)を含むハイブリッド形成緩衝液(7μL)に細胞を再懸濁すること。
解析されるプローブには、Vysis CEP12−SpectrumOrangeプローブ、Vysis CEP12−SpectrumGreenプローブ、Vysis CEP1−SpectrumOrangeプローブ、およびVysis CEP4−SpectrumGreenプローブ(Abbott Molecular,Sydney,Australia)またはVysis ETV6−RUNX1転座プローブ(Abbott Molecular)(図5)またはSureFISH 17p12 PMP22−OrangeRed 458kb遺伝子座特異的プローブ(Agilent Technologies)が含まれ得る。
適切なCEPプローブを、別段の記載がない限り、55%ホルムアミドおよび10%硫酸デキストランを含む1×SSCであるVysis CEP(VCEP)ハイブリッド形成緩衝液または50%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、0.1%Tween20を含む2×SSCのインハウスのFISHハイブリッド形成緩衝液とインキュベートする。
ハイブリッド形成前処理には、時折、特にインタクトなホールセルにおいて細胞核/クロマチンが容易に変性できるようにすることが必要である。最適な変性およびハイブリッド形成条件は、クロマチン構造の相違により、細胞のタイプごとに異なり得る(例えば、顆粒球は、リンパ球より高い温度を必要とする)。化学的処理(例えば、塩酸)または酵素処理(例えば、ペプシンまたはプロテイナーゼK)を、透過処理および核内のクロマチンを安定化するヒストンタンパク質の除去のために使用することができる。酸および塩基は、加熱または溶媒変性と同様に、二本鎖DNAの塩基対合に関与する水素結合も破壊する。プロテイナーゼKは、内因性ヌクレアーゼを活性化する高活性のエンドペプチダーゼであり、例示の方法においては、固定後にヌクレアーゼ活性が低下するので、ハイブリッド形成の改善は見いだされなかった。
このプロトコールの開発において、本発明者らは、ほとんどのヒストンが0.1N塩酸に可溶であるので、0.5〜1M HClでの末梢血有核細胞の酸処理がその後のFISHに最適であることを確認した。このタイプのヒストン抽出は広範な核凝集が生じ、FISH解析には不適切であるので、イオン強度の高い緩衝液(例えば、2M NaCl)でのヒストンの除去を解析しなかった。
製造者は、FISHプローブを標的DNAに結合させるのに最短で6〜8時間を推奨し、プローブによっては一晩(16時間)のインキュベーションが必要であった。このプロトコールでは、37℃で8〜30時間のハイブリッド時間を試験して、診断環境において都合がよいと考えられるインキュベーション時間の最適な範囲を判定した。バックグラウンドの非特異的プローブ結合が増加し、免疫表現型を染色する蛍光が減少するので、ハイブリッド形成時間の長期化は回避することが好ましい。非イオン性の非変性界面活性剤(Igepal CA−630など)またはその化学的同等物Nonidet P−40をストリンジェンシー洗浄に含めると、その後のプローブスポット数が増加する。しかし、高濃度および長時間でのインキュベーションによって免疫表現型検査のために使用される細胞表面マーカーなどの膜タンパク質が破壊され得るので、Igepalは、低濃度(0.3%以下)で10分未満使用することが好ましい(Amidzadeh Z,Behbahani AB,Erfani N,et al.Assessment of different permeabilization methods of minimizing damage to the adherent cells for detection of intracellular RNA by flow cytometry.Avicenna J Med Biotechnol.2014;6(1):38−46)。NP−40(Tergitol−type NP−40)は使用しないことが好ましくは、なぜなら、この界面活性剤は親水−親油平衡(HLB)が高く、原形質膜および核膜の両方を破壊するからである。ストリンジェンシー洗浄緩衝液に加えて、反応体積、ハイブリッド形成緩衝液中のホルムアミドおよび硫酸デキストランの濃度、ならびにタンパク質lo−bind反応チューブの使用などのハイブリッド形成条件も極めて重要である。したがって、プロトコールに記載のチューブおよび体積を使用することが好ましい。
市販のFISHプローブは、1つの試料内で複数のプローブの解析を可能にするためのある範囲の蛍光抱合体または「色」を用いて作製されている。複数のプローブを使用して、悪性疾患の亜型の細胞遺伝学的状態を判断することができる(例えば、Vysis CLL FISHプローブキット(Abbott Molecular)は、SpectrumOrange、SpectrumGreen、およびSpectrumAquaフルオロフォアを抱合した3つまでのプローブを組み合わせて、13q−、+12、または正常遺伝子型のCLL群と11q−または17p−予後不良群を判定する)。あるいは、処理エラーのために染色体全体が喪失されるか、不適切に探索される偽陽性の「喪失」とは対照的に、欠失プローブ(del17p)を染色体計数プローブ(CEP17)と組み合わせて染色体上の特定の遺伝子座の欠失を確認することができる。このプロトコールは、SpectrumOrange抱合プローブおよびSpectrumGreen抱合プローブの両方ならびに二重探索試料を正確に計数することが示されている。
企業が専売するFISHフルオロフォアが化学的に変動することは、プロトコールの強みであり、かつ限定要因でもある。伝統的に、FISHプローブは、高エネルギー発光範囲の波長がより短く、450〜550nmである(Abbott Molecular Vysis SpectrumGreenフルオロフォア、Agilent OrangeRedフルオロフォア、およびKreatech SpectrumBright495フルオロフォアなど)。これにより、前述の波長範囲でのプローブスポット解析によって計数に理想的な鋭く明確に画定されたスポットが得られるはずであるという点で、例示的方法に有利である。しかし、これは大部分のPBMCの内因性および処置に誘導された自己蛍光が生じる範囲でもある。より多数のフルオロフォアが結合する巨大プローブ(例えば、CEPプローブ)については、スポットの蛍光は、バックグラウンドより依然として明るいが、長さが200kb未満のプローブ(遺伝子座特異的欠失プローブなど)の蛍光は小さく、解析ソフトウェアの検出限界を下回り得る。AMNIS ISXmkIIは、蛍光測定値を収集するために時間遅延積分を利用する。この時間遅延積分により、細胞が検出カメラの前を通過すると薄暗いシグナルが増幅されるので、本質的に細胞によって放射された全ての蛍光が回収および蓄積される(Ortyn WE,Hall BE,George TC,Frost K,Basiji DA,Perry DJ,Zimmerman CA,Coder D,Morrissey PJ.Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.Cytometry Part A 2006;69(8):852−62)。しかし、依然としてシグナル解像度には閾値が存在し、いくつかの小さな遺伝子座特異的プローブはそれを下回る可能性があり、それにより、スポットの検出および計数が不十分になる。現在開発中の装置の次世代のハードウェアの改良によってこの制限の影響が軽減されると予想されている。その一方で、所望する適用により小さなプローブが不可欠である場合、DNAプローブに適合させるために小さなRNAプローブを用いて認められる蛍光プローブシグナルを増幅するプローブレポーター増幅キット(AffymetrixのQuantiGeneまたはPrimeFlowなど)のリリースが検討され得る。
本発明の実例では、別段の記載がない限り、SureFISH 17p12 PMP22プローブを、Agilent Technologiesが提供する50〜75%ホルムアミドを含む5〜10%塩化ナトリウム溶液であるSureFISH ハイブリッド形成緩衝液(SFHB)とインキュベートする。この例によれば、プローブハイブリッド形成は、
a.細胞を73℃〜76℃(好ましくは、73℃〜74℃)に5分間加熱して、DNAを変性させ、特異的プローブのアニーリングを確実にする、加熱する工程;
b.自動サーモサイクラーにおいて37℃で16〜30時間(好ましくは、16〜20時間)ハイブリッド形成する工程;
c.0.1%Igepalを含む2×SSCから構成されるストリンジェンシー溶液で細胞を洗浄する工程;
d.細胞をClearview lo−bind微量遠心管(Sigma,Sydney,Australia)に移す工程、
e.細胞を0.3%Igepal 2−0.4×SSC(好ましくは、0.3%Igepal 0.4×SSC)から構成されるストリンジェンシー溶液にて42℃で5分間洗浄する工程;
f.細胞をPBS/2%FBSで洗浄する工程;および
g.細胞を再懸濁し、SYTOX(登録商標)AADvanced核DNA染色剤(0.2μMのPBS溶液,Thermo Fisher Scientific)にて室温で30分間染色する工程
を含む。
これらの工程は、好ましくは、酸変性およびDNAハイブリッド形成のための高温インキュベーションを含み、これらはフルオロフォアの性能に影響を及ぼすことが知られている。初期の免疫表現型検査パネルには、タンパク質ベースの巨大分子アロフィコシアニン(APC)(ほとんどの免疫蛍光実験で現在使用されている最高輝度のプローブのうちの1つ)および光安定性が増強されるように化学修飾されているその類似体AF647が含まれていた。驚いたことに、APCの蛍光はハイブリッド形成中に喪失し、一方で、AF647の蛍光は大幅に減少するが、依然として陽性細胞は非染色集団と区別可能であり、これはおそらくこの分子が受けた化学修飾に起因する。より新規の高分子色素であるBrilliant Violet(BV)およびBrilliant Blue(BB)は、プロトコールを通して最も安定していることが見いだされ、これらの色素は、蛍光がわずかに喪失するが、依然としてAPCおよびAF647より明るい蛍光を維持する。この所見は、テロメアフローFISH解析においてBVおよびBBフルオロフォアを用いて認められるストリンジェントな条件での熱耐性および蛍光維持能に関する公開データと一致していた。p−共役ポリマーとして公知のBV分子およびBB分子(OLEDおよび太陽光電池で見いだされる)は、電子の非局在化、大きな吸収波長範囲、および効率的な蛍光を可能にするp軌道の合成的に調整可能なネットワークを有する。しかし、有機色素分子(例えば、フィコエリトリンまたはPE)と異なり、共役ポリマーの主鎖構造により、ポリマー鎖内の多数の反復単位にわたって非局在化を生じ、それにより分子吸光係数が高くなり、量子効率が上昇し、その結果おそらくFISH中に認められる蛍光が安定化する。これらのフルオロフォアは、4℃で長期間保存する場合の診断研究所において、また、抱合された抗体を細胞と3〜24時間培養し、酵素切断に曝露する可能性のある共培養アッセイにおいて、抗体「カクテル」混合物中で安定であることも見いだされている。例示的な方法で十分に機能する別のフルオロフォアは、クマリン色素V500およびV500c抱合物であり、これらのフルオロフォアは、例示的な方法の解析中に蛍光強度が減少するが、依然として維持される。これは、酸性度が高くなるにつれて蛍光強度が低下するが、細胞の刺激、固定、および透過処理中に蛍光強度が維持されたことが見いだされるV500の安定性に関する以前に発表された研究と一致している。V500の量子効率はPEまたはBrilliantポリマー色素より大いに低いが、そのサイズが小さいためにPEの50倍の分子が免疫表現型検査抗体に抱合し、処理中のいくらかの蛍光の喪失が相殺され得る。細胞表面タンパク質の架橋は、タンパク質:タンパク質複合体を安定化させるために一般的に使用されている。類似の原理を使用して、本発明者らは、BS3(通常はタンパク質の外面に見いだされる第一級アミンにタンパク質を変性させることなく架橋する膜不透過性N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル)を解析した。酸変性またはハイブリダイゼーション後の染色により高レベルの非特異的抗体結合が生じることが示されているので、プロトコールの開始時に免疫表現型検査を行うことが重要である。
イメージングフローサイトメトリー
DNAプローブおよびFISHプローブのハイブリッド形成後、試料を、イメージングフローサイトメトリーを使用して解析する。好ましくは、これは、
a.INSPIRE v4.1取得ソフトウェア(Amnis,Seattle,USA)を備えたAmnis ImageStreamX markII ISXmkIIを使用して細胞懸濁液に対してイメージングフローサイトメトリーを実施する工程
を含む。
解析に適切な励起レーザーには、100mW 405nm、50mW 488nm、150mW 561nm、150mW 592nm、および120mW 642nmが含まれ得る。
本発明の1つの例示的な形態において、細胞懸濁液に対するイメージングフローサイトメトリーは、
a.1.5mW 785nmレーザーを使用して散乱シグナルを得、内部較正用のSpeedBeadsを測定すること;
b.BD Horizon BV480を405nmレーザーによって励起し、430〜505nmの波長範囲(Ch07)で発光を取り込むこと;
c.BD Horizon BB515およびSpectrumGreenを488nmレーザーによって励起し、480〜560nmの範囲(Ch02)の発光を取り込むこと;
d.SYTOX AADvanced DNA染色剤を488nmレーザーによって励起し、660〜740nmの範囲(Ch05)の発光を取り込むこと;
e.Biolegend AF647を642nmレーザーによって励起し、640〜745nmの波長範囲(Ch11)の発光を取り込むこと;および
f.Vysis SpectrumOrange抱合12番染色体計数プローブおよびSureFISH del17p PMP−OrangeRedプローブを561nmまたは592nmレーザーによって励起し、560〜595nmの範囲(Ch03)の発光を取り込むこと
を含む。
全ての画像は、60倍の対物レンズで、焦点深度を4〜16ミクロンに拡大するための専用の光学系および画像処理を使用する被写界深度(EDF)画像化を使用して取り込まれる。
本発明の1つの例示的な形態において、データを、
a.アスペクト比対明視野領域の散布図(Ch01)中の細胞を同定し、試料あたりおよそ10,000〜20,000個の細胞を記録する工程;および
b.明視野および785nmレーザー照射が存在しない同一のレーザー設定を使用して単一染色された補正標準コントロール(例えば、Simply Cellular抗マウス補正標準コントロール,Bangs Laboratories Inc.,Indiana,USA)およびSYTOX AADvanced染色細胞を解析し、INSPIRE v4.1ソフトウェア(Amnis)を使用して補正行列を計算する工程
をさらに含むイメージングフローサイトメトリーを使用して取得する。
理想的には、コントロール試料あたり最低で1,000個の補正粒子またはSYTOX AADvanced染色細胞を記録する。
IDEAS解析
好ましくは、例示的なデータ解析工程は、補正データを使用したIDEAS v6.0画像解析ソフトウェア(Amnis)を使用して免疫フローFISHデータ解析を実施することを含む。データ解析は、
a.画像中のピクセル値の大きな変化を検出することによって画像の鮮明さの品質を測定するGradient RMS機能を使用して焦点画像を選択する工程であって、前述のGradient RMS機能は、より焦点のあった細胞ほどGradient RMS値が高くなる強度レベルのばらつきについて正規化されたピクセルの平均勾配を使用して計算される、選択する工程;
b.アスペクト比対明視野領域の散布図中の単細胞を同定する工程であって、ここで、アスペクト比は、対象または細胞の短軸を長軸で割ったものであり、対象の円形または矩形の程度を示し、単一有核細胞はアスペクト比が高く、かつ領域値が低い、同定する工程;
c.SYTOX AADvanced蛍光強度ヒストグラムにおいて蛍光強度が高い細胞(分裂細胞)を排除することによって有核非分裂細胞を同定する工程;
d.CD19−BV480(正常Bリンパ球および新生物性Bリンパ球)、CD5−BB515(新生物性Bリンパ球および正常Tリンパ球)、およびCD3−AF647(正常Tリンパ球)の蛍光強度に基づいて目的の集団をゲーティングする工程;
e.Similarity Featureを使用してCEP12 FISHプローブシグナル(SpectrumOrange蛍光)の核染色剤(SYTOX AADvanced蛍光)との共存を判定する工程であって、この機能は、2つの画像がマスクした領域内で線形に相関する程度の尺度であり、それにより、核内のFISHプローブシグナルの類似性スコアは高い一方で、細胞膜に接着した破壊細胞由来のDNAにハイブリッド形成した非特異的プローブの類似性スコアは低い、判定する工程;
f.Spot Count Featureを使用して、ピーク、スポット、または強度マスク(表4)を用いて細胞あたりのCEP12 FISHプローブ(Ch03)のスポット数をカウントする工程であって、ここで、Spot Count Featureアルゴリズムは、ピクセルが特定のスポットまたはバックグラウンドに連結しているかどうかに基づいて各ピクセルの連結性を試験し、ブライトピークマスクオプションにより、スポット間の強度の相違と無関係に画像から明るい領域が得られ、スポット対細胞バックグラウンド比は、スポットピクセル値を明るい詳細画像における平均バックグラウンド値で割ったものである、Spot Count Featureを使用する工程;および
g.各スポットカウント集団についてのFISHシグナルの蛍光強度の測定値を比較する単一パラメーターのヒストグラム(すなわち、1−スポット対2−スポット対3−スポット)によってソフトウェアによって生成されたスポットカウントをさらに定量的に検証する工程であって、ここで、蛍光強度の測定値の変化が、ハイブリッド形成プローブ数に対応し、それにより、二次元画像の投影に固有の重複シグナル(すなわち、1−スポットとして現れる2−スポット)を補正して、真の特異的FISHスポット数を判定し、モノソミー亜集団およびダイソミー亜集団の信頼性ある区別が可能である、検証する工程(Minderman H,Humphrey K,Arcadi JK,et al.Image Cytometry−Based Detection of Aneuploidy by Fluorescence In Situ Hybridization in Suspension.Cytometry Part A 2012;81A:776−784)、
h.細胞あたりの平均スポットカウントからスポットカウント比をさらに計算する工程であって、総スポット数を、表現型亜集団サイズに対して正規化する、計算する工程(スポットカウント比=平均スポットカウント新生物細胞/平均スポットカウント正常細胞(例えば、CD19+CD5+CLL/CD3+C5+T−細胞:del(17p)<2、トリソミー12>2比)
を含む。
Figure 2021501885
他の適切な例示的方法において、
a.メタノール固定緩衝液(70%メタノール/4%ホルムアルデヒド/5%酢酸)を、上記プロトコール中の0.1%Tween20を含む4%ホルムアルデヒド固定液の代わりに使用することができる。
b.ハイブリッド形成のバリエーションは、0.1ug/mlプロテイナーゼKおよび以下の代替のDMSO、ホルムアミド、または炭酸エチレンベースのハイブリッド形成緩衝液での前処理を含み得る:15%DMSO、35%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、0.1%Tween20、2×SSC;5%DMSO、45%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、0.1%Tween20、2×SSC;5%DMSO、10%硫酸デキストラン、0.1%Tween20、2×SSC;10%DMSO、10%硫酸デキストラン、0.1%Tween20、2×SSC;15%DMSO、10%硫酸デキストラン、0.1%Tween20、2×SSC;15%ホルムアミド、10%デキストラン、0.1%Tween20、2×SSC;15%ホルムアミド、20%デキストラン、0.1%Tween20、4×SSC;50%ホルムアミド、10%デキストラン、0.1%Tween20、2×SSC;または15%炭酸エチレン、20%デキストラン、0.1%Tw20、2×SSC。
c.代替のハイブリッド形成後の第2のストリンジェンシー洗浄緩衝液(0.3%Igepalを含む0.1×SSC)を使用することができる。
d.陽性の変動がエピトープまたはフルオロフォアの安定性に起因するかどうかを判定するために、BD Horizon BB515(BD Biosciences)またはAF647(Australian Biosearch)のいずれかと抱合した抗CD3抗体クローンSK7、BD Horizon BB515(BD Biosciences)またはAF647(Australian Biosearch)のいずれかと抱合した抗CD5抗体クローンUCTHC2、およびBD Horizon BV480(BD Biosciences)、BD Horizon BB515(BD Biosciences)、またはAF647(BD Biosciences)のいずれかと抱合した抗CD19抗体クローンHIB19を解析することができる。
e.代替のDNAマーカーには、Hoechst 33342(BD Biosciences)およびDRAQ7(BioLegend)が含まれ得る。
以下の結果は、例示的プロトコールの開発試験および性能を考察している。特に、プロトコールを、健康なドナー末梢血有核細胞におけるセントロメア付近に存在する高度に反復配列を有するヒトサテライトDNA配列にハイブリッド形成する1番染色体計数プローブ(CEP1)を用いて行った。
結果は、本発明をさらに例示するのに役立ち、本発明を制限するものと解釈すべきではない。
例示的な結果
プロトコールで試験した第1の固定液は、70%メタノール/4%ホルムアルデヒド/5%酢酸のメタノールベースの緩衝液であり、この緩衝液は、伝統的なFISHおよびFISH−ISのために使用されるカルノア固定液(例えば、Minderman H,Humphrey K,Arcadi JK,et al.Image Cytometry−Based Detection of Aneuploidy by Fluorescence In Situ Hybridization in Suspension.Cytometry Part A 2012;81A:776−784に記載)と、免疫−S−FISHプロトコールで使用される4%ホルムアルデヒド固定液(例えば、K.Fuller,S.Bennett,H.Hui,A.Chakera and W.Erber.Development of a robust immuno−S−FISH protocol using imaging flow cytometry.Cytometry Part A.2016;89A:720−730に記載)の組み合わせであった。
CD3−BB515免疫表現型検査(図6)および健康なドナー有核細胞における染色体のセントロメア付近に存在する高度に反復配列を有するヒトサテライトDNA配列にハイブリッド形成する1番または12番染色体計数プローブ(CEP1またはCEP12)を使用して実験を行った。FISHは、細胞あたり1〜2プローブスポットが得られると予想された。
メタノール固定緩衝液を製造者(Abbott Molecular)によって推奨されるように80℃または73℃のDNA変性温度で試験し、その結果、それぞれ、53%および59%の細胞において1〜2個のCEP1 FISHプローブスポットカウントが認められた(表5)。3個またはそれを超えるプローブスポットを有する細胞数の増加および細胞形態の目視検査によって判定したところ、80℃でより高いDNA変性レベルが認められた(明視野チャネル、データ示さず)。免疫−S−FISHプロトコールに類似する66℃への変性温度の低下により、たった50%の細胞において核Hoechst染色が認められ、2%の細胞でFISHプローブスポットが認められた。
Figure 2021501885
Figure 2021501885
Figure 2021501885
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略語:AA−酢酸、CEP−染色体計数プローブ、DS−硫酸デキストラン、DMSO−ジメチルスルホキシド、EC−炭酸エチレン、FA−ホルムアルデヒド、FM−ホルムアミド、HCl−塩酸、MeOH−メタノール、PK−プロテイナーゼK、SSC−クエン酸ナトリウム、SO−SpectrumOrange、VCEP−Vysis染色体計数プローブハイブリッド形成緩衝液
4℃で10分間 **室温で20分間 ***37℃で10分間 ****5分間の熱変性および37℃で16〜24時間のハイブリッド形成
^MFI計算によって未確認の1または2スポットカウント

AA−酢酸、CEP−染色体計数プローブ、DMSO−ジメチルスルホキシド、FA−ホルムアルデヒド、HCl−塩酸、M−モル、MeOH−メタノール、SO−SpectrumOrange、SSC−標準クエン酸ナトリウム緩衝液、Tw20−Tween20、VCEP−CEPプローブを含むAbbott Molecularによって提供されたVysis CEPハイブリッド形成緩衝液
Vysis CEP1およびCEP12プローブが供給され、Vysis CEP(VCEP)ハイブリッド形成緩衝液を用いて事前に解析した。ハイブリッド形成効率を増加させ(1〜2プローブスポットを有する細胞)、ゼロスポット(不十分なDNA変性)の細胞数を減少させるために、いくつかのハイブリッド形成緩衝液のバリエーションを試験した。第1に、15%DMSOをハイブリッド形成緩衝液に添加し、ホルムアミド濃度を35%まで減少させると、DNAを73℃で変性させた場合に58%の細胞において、および66℃の場合48%の細胞において、細胞あたり1〜2スポットのCEP1プローブカウントが得られた(表5)。両方の温度でハイブリッド形成が改善され、VCEP緩衝液を使用した場合よりもDNA変性が少なかった。DMSO濃度の5%までの減少およびホルムアミド濃度の45%までの増加により、73℃のDNA変性温度で60%の細胞において1〜2プローブスポットが得られたが、DNA変性は29%の細胞まで増加した。また、ハイブリッド形成効率を、DMSOのみ(ホルムアミドなし)を含むハイブリッド形成緩衝液(X%DMSO、10%デキストラン、0.1%Tw20、2×SSC)を使用して、73℃および66℃のDNA変性温度で試験した。5%DMSOを含むハイブリッド形成緩衝液により、73℃で24%の細胞および66℃で28%の細胞、10%DMSOを使用すると66℃で26%の細胞、または15%DMSOを使用すると73℃で26%の細胞および66℃で20.3%の細胞において1〜2個のCEP1スポットが得られた。緩衝液へのDMSOのみの添加では、ハイブリッド形成は十分に改善されなかった。FISHプローブスポットカウントは、73℃の変性温度で一貫してより高かったので、このDNA温度を、その後の染色体計数プローブ(CEP)実験のために使用した。ハイブリッド形成に及ぼすデキストラン濃度の影響の解析により、標準濃度10%の硫酸デキストランを含めてホルムアミド濃度を減少させても(15%)DNAを十分に変性させられず、それにより、たった2%の細胞においてしかプローブスポットが得られないことが見いだされた。濃度を20%まで増加させた硫酸デキストランおよび4×SSCでは、24%の細胞において1〜2個しかCEP1プローブスポットが得られなかった。インハウスの50%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、0.1%Tween20を含む2×SSCハイブリッド形成緩衝液でのハイブリッド形成前に1M塩酸(HCl)を加えて室温で5分間インキュベートすると、1〜2個のCEP1プローブスポットを有する細胞数が94%に増加した。1M HCl変性およびインハウスの50%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、0.1%Tween20を含む2×SSCハイブリッド形成緩衝液でのハイブリッド形成前に37℃で5分間のプロテイナーゼK(0.1μg/ml)予備消化工程を含めることにより、1〜2個のCEP1プローブスポットを有する細胞の減少は83%とわずかであったが(表5)、試料中の細胞がかなり喪失された(データ示さず)。ハイブリッド形成緩衝液の最終的な調整は炭酸エチレンを含めることであったが、これは、スライド上のFISHのハイブリッド形成時間をかなり減少させることが以前に見いだされている。試料を1M HCLで変性させ、次いで、CEP1 FISHプローブと炭酸エチレンベースの緩衝液中にて73℃で5分間同時変性させた後、37℃で3時間または24時間ハイブリッド形成させた。3時間後、1〜2個のプローブスポットが47%の細胞において可視化され、24時間で54%の細胞に増加した。炭酸エチレンベースの緩衝液はインハウスの50%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、0.1%Tween20を含む2×SSCハイブリッド形成緩衝液と比較してハイブリッド形成が改善されなかったので、さらなる実験では使用しなかった。
プロトコールを、免疫−S−FISHプロトコール(K.Fuller,S.Bennett,H.Hui,A.Chakera and W.Erber.Development of a robust immuno−S−FISH protocol using imaging flow cytometry.Cytometry Part A.2016;89A:720−730に記載)で用いる個別の固定液に基づいた4%ホルムアルデヒドを含む0.1%Tween20緩衝液および透過処理緩衝液を使用して試験した。4%ホルムアルデヒド/0.1%Tween20緩衝液は、細胞膜を損なうことない核の明るいDRAQ7染色(データ示さず)によって証明されるように細胞を十分に透過処理し、それにより、その後の処理中に細胞が喪失した(図7)。FISHのためにDNAを十分に変性させるためには、4%ホルムアルデヒド/0.1%Tween20緩衝液を1M塩酸と20分間インキュベートすることが必要であり、それにより、82%の細胞において1〜2個のCEP1プローブスポットが得られ、DNA変性が減少した(表6)。製造者が推奨するおよそ73℃の変性温度を66℃(免疫−S−FISHプロトコールに類似)に低下させるとプローブハイブリッド形成が喪失し、このことは、1M HCl処置のみではFISH解析のためにDNAを適切に変性させるのに不十分であることを示していた。ホルムアルデヒド固定およびTween20透過処理を、個別の工程および組み合わせた工程として試験して、ハイブリッド形成効率に及ぼす影響を判定した。4%ホルムアルデヒドと5分間インキュベートした後に0.1%Tween20と10分間インキュベートした試料は、87%の細胞において1〜2個のCEP1プローブスポットが実証され、4%ホルムアルデヒドと0.1%Tween20溶液と組み合わせ、10分間インキュベートすると、1〜2プローブショットカウントが90%の細胞まで増加した(表6)。Tween20透過処理を用いずに4%ホルムアルデヒドで固定すると、1〜2個のプローブスポットが82%の細胞まで減少した。4%ホルムアルデヒドの0.1%Tween20緩衝液との組み合わせは、「1工程」固定/透過処理に最適と見なされ、その後の実験で使用した。
Figure 2021501885

Figure 2021501885
MFIによって1または2スポットに調整されない1−スポットカウント

CEP−染色体計数プローブ、FA−ホルムアルデヒド、HCl−塩酸、M−モル、SG−SpectrumGreen、SO−SpectrumOrange、Tw20−Tween20、VCEP−CEPプローブを含むAbbott Molecularによって提供されたVysis CEPハイブリッド形成緩衝液
1M HClのインキュベーションを追加するとDNA変性およびその後のFISHスポットカウントが増加したので、様々な濃度のHClもプロトコールで試験した。2Mまたは4Mに濃度を増加すると、1〜2個のCEP1プローブスポットを有する細胞が、それぞれ、67%および3%に減少した。さらに、試料中の細胞の総数が減少し(データ示さず)、0〜1個または3+個のスポットを有する細胞数が増加し、これは、DNA変性度がより高いこと、および試料中の溶解/破損細胞由来の無細胞DNAを示す(表6)。HCL酸濃度を0.5Mに減少させても、1M溶液(82%)と比較して1〜2プローブスポットカウント(79%)にあまり影響を及ぼさなかったが、試料中の全体的な細胞喪失は減少した(データ示さず)。0.5M HCl酸変性は、固定に最適と見なされ、その後の実験で実験した。
市販のFISHプローブは、ある範囲の蛍光抱合体を用いて作製されていた。ドナーおよびCLL患者の細胞を2つのアリコートに分割し、SpectrumOrange(SO)またはSpectrumGreen(SG)と抱合したVysis CEP12プローブとハイブリッド形成させて、各々の一対にした試料組内のスポットカウントが類似することを確認した(図8、表6)。さらに、細胞をCEP1−SOプローブおよびCEP12−SGプローブで二重に探索して、多プローブ解析のためにプロトコールを使用することができることが確認された(図9)。
計数に加えて、FISHプローブは、しばしば、17番染色体の短腕に見いだされる腫瘍抑制遺伝子p53などの重要な遺伝子の喪失を検出するように設計される。これらの遺伝子座特異的プローブは、通常、セントロメアプローブより小さく、それにより、蛍光抱合体の存在量が少ないので、シグナルが「薄暗い」。CLL試料を、SureFISH(SF)del17p PMP遺伝子座特異的(458kb)プローブを用いて解析して、より小さなFISHプローブを用いた計数が正確であることを確認した(表7)。CEPプローブのために最適化されたプロトコールを用いて調製したSF del17pプローブを用いた73℃で変性させた健康なコントロール試料において、59%の細胞が1〜2個のプローブスポットを実証したが、24%にプローブスポットは認められず、これは、不十分なハイブリッド形成(不正確な変性温度)または小さなプローブによる薄暗いシグナルに起因し得る。変性温度を74、76、または78℃へ上昇させるとプローブスポットの無い細胞数が2%未満に減少したが、3個またはそれを超えるスポットを有する細胞数も63〜66%に増加した。変性温度74℃を次の実験のために使用した。第2のハイブリッド形成後洗浄ストリンジェンシーを、0.3%Igepalを含む0.1×SSC緩衝液に上昇させると3個またはそれを超えるスポットを有する細胞数が40%に低下した(表7)。1〜2個のプローブスポットを有する細胞数は依然として49%でしかなかったので、ハイブリッド形成時間を30時間まで増加させると、1〜2個のプローブスポットを有する細胞数が56%にわずかに増加し、ゼロスポットを有する細胞数が12%に減少し、3個またはそれを超えるスポットを有する細胞が32%に減少した(図10)。17pの欠失が確認された患者のSF del17pプローブ計数解析はCEPプローブ計数解析ほど効率的ではないが、B CLL細胞集団と正常なT 細胞集団の相違を判断することができた(図10、表6)。ハイブリッド形成緩衝液およびストリンジェンシー緩衝液に対するさらなる調整により、3個またはそれを超えるプローブスポットを有する細胞数が減少し得るが、ゼロまたは単一プローブスポットを有する細胞の視覚的解析により、計数ソフトウェアが薄暗いプローブシグナルに起因してこれらを正確に分解するほど十分に頑強ではないことが見いだされた(データ示さず)。
Figure 2021501885
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MFIによって1または2スポットに調整されない1−スポットカウント

FA−ホルムアルデヒド、HCl−塩酸、Igepal−Igepal CA−630、M−モル、Tw20−Tween20、SFHB−17p欠失プローブを含むAgilent Technologiesによって提供されたSureFISHハイブリッド形成緩衝液、SSC−標準クエン酸ナトリウム緩衝液
ハイブリッド形成後ストリンジェンシーおよびSYTOX AADvanced共存と無関係に、Spot Count Featureは、依然として、「スポット」カウント1を有する細胞の比率(15〜20%)を報告した(図11)。Minderman et al.に従った1−スポット集団についての蛍光強度解析により、CEP1プローブおよびCEP12プローブについて、1−スポットカウントのMFIは2−スポット集団と同一であることが見いだされ、このことは、真の単一のスポットのMFIが二重スポットの半分であるので、2個のスポットが重複していることを示している(図12)。プローブスポットが重複している細胞の数を判定するためのSYTOX AADvanced共存基準(図11)に基づいた3+スポットを有する細胞の排除および1−スポット蛍光強度の解析により、健康なドナー細胞の95%超の細胞において調整された2−スポットカウントが得られた。
免疫表現型検査のフルオロフォアに及ぼす酸変性および高温(73℃)の影響を判定するために、健康なドナーおよびCLL患者の有核細胞試料を、最適化したプロトコールにしたがって処理し、アリコートを、細胞の抗体染色後、固定および透過処理後、酸変性後、およびハイブリッド形成後のAMNIS ISXmkIIの解析のために取り出した。これらは、ある範囲のフルオロフォアと抱合したCD3(クローン:SK7)、CD4(クローンSK3)、CD5(クローン:UCHTC2)、およびCD19(クローン:HIB19)を含んでいた(表8)。
Figure 2021501885
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蛍光強度は減少したが、陽性細胞を、依然として未染色集団と区別することができた。^CD3クローンSK7、CD4クローンSK3、CD5クローンUCTHC2、CD19クローンHIB19およびSJ25C。略語:AF−アレクサフルオル、APC−アロフィコシアニン、BB−Brilliant Blue、BV−Brilliant Violet、FITC−フルオレセインイソチオシアナート、PE−フィコエリトリンフルオロフォア。
BB515、BB700、BV421、BV480、BV510、V500c、AF647、およびAF700について、37℃で一晩のハイブリッド形成後に抗体結合が保存されたが、フルオロフォアの蛍光強度は減少した(図13)。PE、APCと抱合した抗体、またはこれらのタンデム抱合体は、処理中に蛍光を喪失した(図14)。フルオロフォアの蛍光強度は、陽性染色された集団と陰性染色された集団との「輝度」および解像度によって判定したところ、ビス(スルホスクシンイミジル)基質(BS3)(非切断性、膜不透過性、水溶性のアミン反応性架橋剤)との架橋によって保存された(図15)。2つの免疫表現型検査パネルを解析すると、パネルデザインは柔軟であり、その後の他の血液学的悪性疾患のためのプローブの選択に使用した。正常な血球およびCLL細胞を、両方のパネルを用いて解析し、CD3、CD5、およびCD19集団の染色プロフィールが類似することが見いだされた(図16)。
実施例2:免疫フローFISHの先行技術のテクノロジーとの比較
表9に示した以下の実施例は、免疫フローFISHテクノロジーを免疫−S−FISHテクノロジーと比較している。一方で、表10は、末梢血単核球(PBMC)調製物の解析についての広範な作業範囲およびその方法論において非常に好ましい最適条件を提供している。
Figure 2021501885
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略語:ALL−急性リンパ球性白血病、BS3−ビス(スルホスクシンイミジル)基質、BSA−ウシ血清アルブミン、Ch−チャネル、CEP−染色体計数プローブ、CLL−慢性リンパ球性白血病、del(17p)−17番染色体短腕の欠失、DMSO−ジメチルスルホキシド、DRAQ7−ディープレッドアントラキノン7、EDF−被写界深度、FISH−蛍光in situハイブリッド形成、FBS−胎児ウシ血清、HCl−塩酸、hrs−時間、IFC−イメージングフローサイトメトリー、ISX MKII−ImageStreamX MarkII、mins−分間、MM−多発性骨髄腫、OR−OrangeRed、PBS−リン酸緩衝生理食塩水、PMP−末梢ミエリンタンパク質、RBC−赤血球、RMS−二乗平均平方根、RT−室温、SFHB−SureFISH ハイブリッド形成緩衝液、SG−SpectrumGreen、SO−SpectrumOrange、SSC−標準クエン酸ナトリウム、VCEP−Vysis染色体計数、VLSI−Vysis遺伝子座特異的識別子、7−AAD−7−アミノアクチノマイシンD。
注意:プロトコールを通して試料を光から防御すべきである。
Figure 2021501885
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略語:ALL−急性リンパ球性白血病、BS3−ビス(スルホスクシンイミジル)基質、BSA−ウシ血清アルブミン、Ch−チャネル、CEP−染色体計数プローブ、CLL−慢性リンパ球性白血病、del(17p)−17番染色体短腕の欠失、DMSO−ジメチルスルホキシド、DRAQ7−ディープレッドアントラキノン7、EDF−被写界深度、FISH−蛍光in situハイブリッド形成、FBS−胎児ウシ血清、HCl−塩酸、hrs−時間、IFC−イメージングフローサイトメトリー、ISX MKII−ImageStreamX MarkII、mins−分間、MM−多発性骨髄腫、OR−OrangeRed、PBS−リン酸緩衝生理食塩水、PMP−末梢ミエリンタンパク質、RBC−赤血球、RMS−二乗平均平方根、RT−室温、SFHB−SureFISH ハイブリッド形成緩衝液、SG−SpectrumGreen、SO−SpectrumOrange、SSC−標準クエン酸ナトリウム、VCEP−Vysis染色体計数、VLSI−Vysis遺伝子座特異的識別子、7−AAD−7−アミノアクチノマイシンD。
注意:プロトコールを通して試料を光から防御すべきである。

Claims (21)

  1. 細胞解析法であって、
    a.細胞のマーカーまたは抗原(細胞表面抗原、細胞質抗原、または核抗原)を有する有核細胞を含む単細胞懸濁液を調製する工程;
    b.細胞マーカーを抗体染色する工程;
    c.前記細胞を固定および/または透過処理する工程;
    d.前記細胞に対して細胞遺伝学的技術を実施して、目的の染色体の特徴を検出する、細胞遺伝学的技術を実施する工程;
    e.細胞のDNAを染色する工程;および
    f.前記細胞に対してイメージングフローサイトメトリーを実施して、工程(b)における抗体の存在および工程(d)で標的にされた目的の染色体の特徴を測定し、定量し、そして/または同定する、イメージングフローサイトメトリーを実施する工程
    を含む、方法。
  2. 有核細胞の単細胞懸濁液を調製する工程が、血液試料もしくは骨髄試料内の赤血球を溶解することまたは組織試料中の細胞外基質および細胞間接着の酵素消化を含む、請求項1に記載の方法。
  3. 前記有核細胞試料を調製する工程が、調製された試料を適切な緩衝液で緩衝化することを含む、請求項2に記載の方法。
  4. 赤血球を溶解することまたは細胞外基質を消化することが、溶解または消化が生じる条件下で前記試料をインキュベートする工程を含む、請求項2または請求項3に記載の方法。
  5. 前記単細胞懸濁液を調製する工程が、(a)前記試料を遠心分離し、上清を除去すること、または(b)余剰細胞外基質を除去するのに適切な条件下で前記細胞を洗浄することのうちの少なくとも1つを含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
  6. 前記細胞マーカーを抗体染色する工程が、免疫表現型検査の抗体調製物を使用して前記細胞を染色することを含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
  7. 前記細胞を固定および透過処理する工程が、ホルムアルデヒドおよび非イオン性界面活性剤を前記試料に添加して、前記試料を固定および透過処理する、添加する工程を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
  8. 前記細胞遺伝学的技術が、前記細胞のDNAを変性させる工程を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
  9. 前記細胞遺伝学的技術が、リン酸緩衝生理食塩水中で前記細胞をクエンチする工程を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
  10. 前記細胞遺伝学的技術を実施する工程が、細胞を遠心分離する工程、上清を除去する工程、前記細胞を再懸濁する工程を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
  11. 前記細胞遺伝学的技術が、前記細胞内のDNAを少なくとも1つのFISHプローブとハイブリッド形成させる工程を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
  12. 前記ハイブリッド形成物を、ストリンジェンシー溶液で洗浄して非結合プローブを除去する、請求項11に記載の方法。
  13. 前記細胞遺伝学的技術が、前記細胞を核DNA染色する工程を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
  14. イメージングフローサイトメトリーを、工程(b)または(d)の結果を測定するのに適切なレーザーを使用した励起レーザーおよび発光の捕捉を用いて実施する、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
  15. イメージングサイトメトリーの実施が、前記試料中の少なくとも10,000個の細胞を記録することを含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
  16. データ解析が、蛍光強度が高い細胞を排除することによって蛍光強度ヒストグラム中の有核非分裂細胞を同定することを含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
  17. データ解析に基づいて医学的状態を診断、予後診断、またはモニタリングすることを含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
  18. 本発明の方法の構成要素のうちの1つまたは複数を、1つまたは複数の容器に、前記本発明の方法の構成要素の使用に関する指示および/または情報を提供する指示書または情報小冊子と組み合わせて含む、キット。
  19. (a)標準的なフローサイトメトリーに適切な少なくとも1つの抗原マーカー検出システム、および(b)1つまたは複数の本発明のFISHプローブを含むキットであって、(a)および(b)の各々が、1つまたは複数の容器に、本発明の方法における(a)および(b)の使用に関する指示および/または情報を提供する指示書または情報小冊子と組み合わせて存在する、キット。
  20. 1つまたは複数の容器に本発明の方法での使用に適切な1つまたは複数の緩衝液をさらに含む、請求項39および40に記載のキット。
  21. 前記キット中に存在するマーカー検出システムが、細胞試料の免疫表現型検査に適切な抗体である、請求項40に記載のキット。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10872410B2 (en) * 2016-09-29 2020-12-22 Animantis, Llc Methods and apparatus for assessing immune system activity and therapeutic efficacy
JP7054619B2 (ja) * 2017-11-30 2022-04-14 シスメックス株式会社 画像分析装置および画像分析方法
US11604195B2 (en) 2019-08-22 2023-03-14 Michael IANNOTTI High throughput analysis and sorting, and sampling interface and assembly for high throughput analysis and sorting
CN110853022B (zh) * 2019-11-14 2020-11-06 腾讯科技(深圳)有限公司 病理切片图像的处理方法、装置、系统及存储介质
WO2021231071A1 (en) * 2020-05-13 2021-11-18 Becton, Dickinson And Company Blood based controls for complex panel
CN113025567A (zh) * 2021-03-31 2021-06-25 中国人民解放军陆军特色医学中心 一种椎间盘单细胞的分离方法
JP2023027845A (ja) * 2021-08-18 2023-03-03 国立大学法人 東京医科歯科大学 蛍光画像分析方法、蛍光画像分析装置、蛍光画像分析プログラム
CN114354596A (zh) * 2021-11-12 2022-04-15 万贝医疗健康科技(上海)有限公司 放化疗术后肝、胆癌细胞活动状态评估设备
CN116542978B (zh) * 2023-07-06 2023-10-20 珠海圣美生物诊断技术有限公司 Fish探针的质量检测方法和装置

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006503589A (ja) * 2002-10-28 2006-02-02 エムティーエム ラボラトリーズ アクチェンゲゼルシャフト 形成異常の改善された診断方法
JP2016540969A (ja) * 2013-11-04 2016-12-28 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーBecton, Dickinson And Company 多能性間質細胞集団の免疫調節ポテンシャル

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060257884A1 (en) * 2004-05-20 2006-11-16 Amnis Corporation Methods for preparing and analyzing cells having chromosomal abnormalities
US9383357B2 (en) * 2012-12-07 2016-07-05 Northwestern University Biomarker for replicative senescence

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006503589A (ja) * 2002-10-28 2006-02-02 エムティーエム ラボラトリーズ アクチェンゲゼルシャフト 形成異常の改善された診断方法
JP2016540969A (ja) * 2013-11-04 2016-12-28 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーBecton, Dickinson And Company 多能性間質細胞集団の免疫調節ポテンシャル

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAROL FRANCIS: "Rapid Single-Step Method for Flow Cytometric Detection of Surface and Intracellular Antigens Using W", CYTOMETRY, vol. 25, JPN6022037956, 1996, pages 58 - 70, ISSN: 0005063921 *
INGRID SCHMID: "Simultaneous Flow Cytometric Analysis of Two Cell Surface Markers, Telomere Length, and DNA Content", CYTOMETRY, vol. 49, JPN6022037961, 29 October 2002 (2002-10-29), pages 96 - 105, ISSN: 0004873123 *
JACQUELINE P. LAW: "The Importance of Foxp3 Antibody and Fixation/ Permeabilization Buffer Combinations in Identifying C", CYTOMETRY PART A, vol. 75, JPN6022037957, 20 October 2009 (2009-10-20), pages 1040 - 1050, XP072333103, ISSN: 0005063922, DOI: 10.1002/cyto.a.20815 *
KATHRYN A. FULLER: "Development of a Robust Immuno-S-FISH Protocol Using Imaging Flow Cytometry", CYTOMETRY PART A, vol. 89, JPN6022037954, 3 May 2016 (2016-05-03), pages 720 - 730, ISSN: 0005063919 *
LIZZ F. GRIMWADE: "Applications of imaging flow cytometry in the diagnostic assessment of acute leukaemia", METHODS, vol. 112, JPN6022037955, 6 July 2016 (2016-07-06), pages 39 - 45, ISSN: 0005063920 *
ORLA MAGUIRE: "Fluorescent In Situ Hybridization In Suspension by Imaging Flow Cytometry", METHODS MOL BIOL, vol. 1389, JPN6022037960, 22 November 2015 (2015-11-22), pages 111 - 126, ISSN: 0004873122 *
SANTIAGO ROURA: "Brilliant violet fluorochromes in simultaneous multicolor flow cytometry-fluorescence in situ hybrid", LABORATORY INVESTIGATION, vol. 96, JPN6022037962, 12 September 2016 (2016-09-12), pages 1223 - 1230, ISSN: 0004873124 *
SHARON LESLEY SANDERSON: "In aged primary T cells, mitochondrial stress contributes to telomere attrition measured by a novel", AGING CELL, vol. 16, JPN6022037958, 19 August 2017 (2017-08-19), pages 1234 - 1243, ISSN: 0005063923 *
ZIXIN LIU: "Circulating tumor cell detection in hepatocellular carcinoma based on karyoplasmic ratios using imag", SCI REP, vol. 6, JPN6022037959, 23 December 2016 (2016-12-23), pages 39808, ISSN: 0004873121 *

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