JP2006503589A - 形成異常の改善された診断方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1つ以上のINK4a遺伝子産物の検出のための試薬
1つ以上の増殖マーカー遺伝子産物の検出のための試薬
検出反応を行うために一般に使用される試薬および緩衝液(例えば、緩衝液、レポーター反応物(色素など)、キャリア物質他)
ポジティブコントロール反応を行うためのINK4a遺伝子産物サンプル
ポジティブコントロール反応を行うための増殖マーカー遺伝子産物サンプル。
ホルマリン固定し、パラフィン包埋した子宮頸の組織サンプルの切片を、p16INK4aおよびKi67に特異的な抗体を用いて免疫蛍光染色した。
子宮頸のスメアを、インサイチュ染色反応において、p16INK4aおよびmcm2のmRNAレベルについて半定量的に分析し得る。染色反応は、以下のように行う:
再水和のために、スプレー固定したスメア(spray−fixed smear)を、新鮮な50% EtOHにおいて震盪デバイス上でインキュベートする。固定手順によって産生されたPEGフィルムを、徹底したリンスによって除去する。次いで、スメアをaqua bidest中でリンスする。スメアを、プロテイナーゼK(PBS中10μg/ml)と共に37℃で10分間インキュベートする。次いで、スライドを洗浄緩衝液(PBS/0.1% Tween 20)に移し、そして最後に、細胞を含む領域を脂質ペンシル(lipid−pencil)で囲った。
Merckofix(登録商標)固定した子宮頸の細胞学的サンプル(従来的なスメアおよび液体ベースの細胞学(ThinPreps(登録商標)))を、p16INK4aおよびKi−S2に特異的な抗体を用いて免疫蛍光染色した。
患者の気管支肺胞洗浄液試料に含まれる細胞を、ThinPrep技術に従って調製した。小細胞肺癌と診断された患者の洗浄液のMerckofix(登録商標)固定した細胞学的サンプルを、p16INK4a、Ki67およびPCNAに特異的な抗体を用いて免疫蛍光染色した。
子宮頸の細胞学的サンプル(PBS(pH 7.4)中の細胞懸濁物)を、p14ARF特異的抗体およびKi−67特異的抗体、ならびにmcm−5についてのオリゴプローブを用いて蛍光染色し、3色蛍光FACS分析によって評価した。
ホルマリン固定し、パラフィン包埋した子宮頸の組織サンプルの切片を、p16INK4aおよびKi67に特異的な抗体を用いて免疫酵素学的二重染色した。
Merckofix(登録商標)固定した子宮頸の細胞学的サンプル(従来的なスメアおよび液体ベースの細胞学的サンプル(ThinPreps(登録商標)))を、p16INK4aおよびKi67に特異的な抗体を用いて免疫酵素学的二重染色した。
Claims (38)
- 生物学的サンプル内で、INK4a遺伝子産物を過剰発現する形成異常細胞を、INK4a遺伝子産物を検出可能なレベルで発現する他の細胞から識別するための方法であって、該方法は、少なくとも1つの単一の細胞内での少なくとも2つのマーカー分子の同時発現を、細胞学的試験手順または組織学的試験手順で決定する工程を包含し、ここで、少なくとも1つのマーカー分子は、INK4a遺伝子によってコードされる発現産物であって、かつ、少なくとも1つのさらなるマーカー分子は、細胞増殖マーカーであって、ここで、少なくとも1つのINK4a遺伝子産物の過剰発現および該単一の細胞内での検出可能なレベルでの活性な細胞増殖に対する少なくとも1つのマーカーの発現は、該細胞の形成異常状態の指標であって、ここで、該単一の細胞内における少なくとも1つのINK4a遺伝子産物の過剰発現、および老化、細胞末期分化、アポトーシスまたは細胞周期停止についての少なくとも1つのマーカーの検出可能なレベルでの発現は、細胞の非形成異常状態の指標である、方法。
- 2つ以上の細胞増殖マーカーのセットが検出される、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つのINK4a遺伝子産物が、13kDaと19kDaとの間の分子量を有する、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 少なくとも1つのINK4a遺伝子産物が、p16INK4aおよびp14ARFを含む群から選択される、請求項1〜3に記載の方法。
- 少なくとも1つの細胞増殖マーカーが、細胞増殖の維持に必要な増殖なマーカー、DNA複製に関係する増殖マーカー、進行中の複製フォークのメンバーであるかもしくは進行中の複製フォークのメンバーをコードする増殖マーカー、老化マーカー、細胞周期停止マーカーおよびアポトーシスマーカーを含む群から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞増殖の維持に必要な遺伝子産物が、Ki67分子、Ki−S5分子およびKi−S2分子を含む群から選択される分子である、請求項5に記載の方法。
- 前記DNA複製に関係する遺伝子産物が、ヘリカーゼもしくはそのサブユニット、細胞分裂サイクル(cdc)分子、ホスファターゼ分子およびキナーゼ分子を含む群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記ヘリカーゼまたはそのサブユニットが、MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6、MCM7およびHELAD1を含む群から選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記cdc分子、キナーゼおよびホスファターゼが、CDC6、CDC7、プロテインキナーゼ、Dbf4、CDC14プロテインホスファターゼ、CDC45およびMCM10を含む群から選択される、請求項7に記載の方法。
- 進行中の複製フォークに関係する前記分子が、PCNAおよびPOLDを含む群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記遺伝子産物が、ポリペプチドまたは核酸分子である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つのさらなるマーカー分子が診断または予後の評価の改善のためにさらに検出される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記さらなるマーカー分子が少なくとも1つのさらなる増殖マーカー分子である、請求項12に記載の方法。
- 前記さらなるマーカー分子が、老化マーカー、アポトーシスマーカー、細胞周期停止マーカー、細胞の末期分化に対するマーカー、ウイルス感染に対するマーカー、ウイルス活性に対するマーカー、細胞周期調節タンパク質、細胞増殖の維持に必要な遺伝子産物、DNA複製に関係する遺伝子産物、進行中の複製フォークのメンバーである遺伝子産物を含む群から選択される、請求項12または請求項13に記載の方法。
- DAPI、キナクリン、クロモマイシン、アザン、アクリジン−オレンジ、ヘマトキシリン、エオシン、スダン赤、トルイジン青およびチオニンからなる群から選択される少なくとも1つの色素を使用するさらなる細胞学的な染色手順、または、PAP染色、ギムザ染色、ヘマトキシリン−エオシン染色、ワンギーソン染色、シッフ染色、金属沈殿物による染色、ターンブル青染色および金属シアン化物による染色を含む群から選択される染色方法が適用される、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記形成異常細胞が癌性病変または前癌性病変の細胞である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記形成異常細胞が乳頭腫ウイルスと関連する形成異常の細胞である、請求項16に記載の方法。
- 前記乳頭腫ウイルスが、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66およびHPV68を含む群から選択される危険性の高いヒト乳頭腫ウイルスである、請求項17に記載の方法。
- 前記病変が、肛門性器道の病変、気道の病変ならびに皮膚およびその付属器の病変を含む群から選択される、請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記病変が、子宮頚の病変、膣の病変、外陰の病変、陰茎の病変、肛門の病変、直腸の病変、気管支の病変、肺の病変、腹膜腔の病変、鼻咽頭腔の病変、口腔の病変または皮膚の病変を含む群から選択される、請求項17または請求項19に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、肛門性器道、気道または皮膚およびその付属体に由来する細胞を含有するサンプルである、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、子宮頚、膣、外陰、陰茎、肛門、直腸、気管支、肺、鼻咽頭腔、口腔または皮膚に由来する細胞である、請求項21に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、細胞学的調製物または組織学的調製物である、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記INK4a遺伝子産物および/または前記細胞増殖マーカー分子の検出が、検出されるべきそれぞれの分子を少なくとも1つ特異的に識別する少なくとも1つのプローブを使用して実施される、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つのプローブが検出可能に標識される、請求項24に記載の方法。
- 少なくとも1つの標識が、放射性同位体、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート剤または酵素からなる群から選択される請求項25に記載の方法。
- 少なくとも1つのプローブがタンパク質および/または核酸である、請求項24〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つのプローブがINK4aをコードする遺伝子産物または細胞増殖マーカー遺伝子産物に対して指向された抗体である、請求項27に記載の方法。
- 免疫細胞化学染色手順を包含する、請求項28に記載の方法。
- 少なくとも1つのプローブがINK4a遺伝子産物または細胞増殖マーカー遺伝子産物に特異的にハイブリダイズする核酸である、請求項25または請求項26に記載の方法。
- インサイチュハイブリダーゼーション反応を包含する、請求項30に記載の方法。
- 核酸増幅反応を包含する、請求項30に記載の方法。
- 前記核酸増幅反応がPCR、NASBAまたはLCRである、請求項32に記載の方法。
- 核酸プローブおよびポリペプチドプローブを使用する検出反応が同時に実施される、請求項1〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法を実施するためのキットであって、生物学的サンプル中の少なくとも1つのINK4a遺伝子産物および少なくとも1つの細胞増殖マーカー遺伝子産物の存在もしくは非存在および/または過剰発現のレベルの検出のための少なくとも1つ以上のプローブを備える、診断キットまたは研究キット。
- 前記INK4a遺伝子産物が、p16INK4aおよびp14ARFを含む群から選択される、請求項35に記載のキット。
- 前記細胞増殖マーカー遺伝子産物が、CDC6、MCM3、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6、MCM7、CDC7プロテインキナーゼ、Dbf4、CDC14プロテインホスファターゼ、CDC45およびMCM10、Ki67、Ki−S2、PCNAまたはPOLDを含む群から選択される、請求項35または請求項36に記載のキット。
- 請求項35〜37に記載のキットであって、該キットは、以下
a.ポジティブコントロール反応を行なうためのp16INK4aサンプル
b.ポジティブコントロール反応を行なうためのp14ARFサンプル
c.ポジティブコントロール反応を行なうためのKi67サンプル
d.ポジティブコントロール反応を行なうためのKi−S2サンプル
e.ポジティブコントロール反応を行なうためのMCM5サンプル
f.ポジティブコントロール反応を行なうためのMCM2サンプル
g.ポジティブコントロール反応を行なうためのPCNAサンプル
h.p16INK4aの存在もしくは非存在および/またはレベルの検出のための試薬
i.p14ARFの存在もしくは非存在および/またはレベルの検出のための試薬
j.Ki67の存在もしくは非存在および/またはレベルの検出のための試薬
k.Ki−S2の存在もしくは非存在および/またはレベルの検出のための試薬
l.MCM5の存在もしくは非存在および/またはレベルの検出のための試薬
m.MCM2の存在もしくは非存在および/またはレベルの検出のための試薬
n.PCNAの存在もしくは非存在および/またはレベルの検出のための試薬
o.ポジティブコントロール反応を実施するためのINK4a遺伝子産物の1つ以上のサンプル
p.ポジティブコントロール反応を実施するための細胞増殖マーカー遺伝子産物の1つ以上のサンプル
q.他のINK4a遺伝子産物の存在もしくは非存在および/またはレベルの検出のための1つ以上の試薬
r.他の細胞増殖マーカー遺伝子産物の存在もしくは非存在および/またはレベルの検出のための1つ以上の試薬
の内の少なくとも1つをさらに備える、キット。
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