CN105675378A - 一种简单的分离单个循环肿瘤细胞的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种简单的分离单个循环肿瘤细胞的方法和装置。具体地，本发明公开了一种单个循环肿瘤细胞的分离方法，先对外周血样本进行阴性富集，获得富集的CTC细胞样本；分别使用第一荧光标记的抗上皮细胞标志物抗体和第二荧光标记的抗CD45抗体对富集的CTC细胞样本进行荧光染色，并对染色后的CTC细胞样本进行稀释；对第一荧光阳性且第二荧光阴性的目的细胞进行单细胞分离。本发明还公开了一种适用于上述方法的分离单个循环肿瘤细胞的装置。本发明用CTC阴性富集技术进行CTC富集，相比阳性磁珠富集法，目的细胞受到的干扰更少，结合挑取分离的细胞可以完全保持细胞活性，除能进行核酸和蛋白分析外，还可用于细胞培养。

Description

一种简单的分离单个循环肿瘤细胞的方法和装置

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是涉及一种简单的分离单个循环肿瘤细胞的方法和装置。

背景技术

肿瘤的转移是导致癌症病人死亡的主要原因。近年来，循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCell,CTC)在恶性肿瘤转移过程中的作用日益受到关注。在肿瘤转移过程中，癌细胞从原发肿瘤脱落进入血液循环系统，少数细胞存活下来成为循环肿瘤细胞，并进一步发展为远端器官转移肿瘤。因此在外周血中检测到肿瘤细胞预示着有发生肿瘤转移的可能。

对于癌症病人血液中CTC的计数已逐渐用于癌症治疗的疗效评估。如果能对CTC进行基因组分析将有助于我们更好地了解肿瘤转移的生物学机制，并为疗效评价、预后判断以及个体化治疗提供及时可靠的依据。然而，循环肿瘤细胞在病人外周血中存在的数量极其稀少，大约每10⁵－10⁷个单核细胞中才有一个CTC，对体积微小(10－50μm)的单个细胞的分离，以及对单个细胞及其微量的核酸的提取和分析都对现代生物技术提出了极大的挑战。随着循环肿瘤细胞富集和鉴定技术的提高，单细胞测序技术的发展，对单个循环肿瘤细胞基因组特性进行分析已成为现实。

在目前的单个循环肿瘤细胞测序的研究中，循环肿瘤细胞的捕获，主要是用偶联EpCAM抗体的免疫磁珠进行CTC阳性捕获。市场上有很多自动化的CTC检测仪器，但大多数价格高昂，市场应用有限。且这种阳性捕获法依赖于肿瘤细胞对EpCAM抗原的表达。而不同组织来源的CTC，细胞表面EpCAM表达水平不同；且肿瘤细胞脱落组织进行血液循环之后好，表面抗原的表达状况会发生很大的变化。因此用这种方法进行CTC捕获，会遗漏很多EpCAM表达较弱或者无表达的肿瘤细胞，导致很多样本CTC检测结果阴性(假阴性)，无法进行单个CTC挑取，以及后续的基因组分析。

当前的获取单个CTC细胞的方法主要是利用荧光流式细胞分选和激光捕获显微切割技术。这两种方法都对相应仪器设备的性能要求较高，价格昂贵，难以推广应用。因此，本领域技术人员致力于开发一种简单高效的分离单个循环肿瘤细胞的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单的分离单个循环肿瘤细胞的方法。

本发明的第一方面，提供了一种单个循环肿瘤细胞(CTC)的分离方法，所述方法包括步骤：

(1)对外周血样本进行阴性富集，获得富集的CTC细胞样本；

(2)分别使用第一荧光标记的抗上皮细胞标志物抗体和第二荧光标记的抗CD45抗体对富集的CTC细胞样本进行荧光染色，并对染色后的CTC细胞样本进行稀释；

(3)对第一荧光阳性且第二荧光阴性的目的细胞进行单细胞分离。

在另一优选例中，所述抗上皮细胞标志物抗体为抗EpCAM抗体和/或抗pan-CK抗体。

在另一优选例中，所述第一荧光为Alexafluor488荧光。

在另一优选例中，所述第二荧光为Alexafluor594荧光。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，使用水平离心机对外周血样本进行密度梯度离心，取单个核细胞聚集层制成单个核细胞悬液，接入偶联白细胞表面抗原CD45的免疫磁珠，分离白细胞，从而达到阴性富集CTC的目的。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，在富集的CTC细胞样本中加入PBS清洗一到两次；离心弃上清后用PBS重悬细胞，添加所述第一荧光标记的抗上皮细胞标志物抗体和所述第二荧光标记的抗CD45抗体后进行孵育。

在另一优选例中，所述第一荧光标记的抗上皮细胞标志物抗体与细胞悬液的体积比为1：20－100，优选为1：40-60。

在另一优选例中，所述第二荧光标记的抗CD45抗体与细胞悬液的体积比为1：20－100，优选为1：40-60。

在另一优选例中，所述孵育时间为30min-90min。

在另一优选例中，所述步骤(3)中，使用基于微径玻璃管的单细胞分离装置分离所述目的细胞。

在另一优选例中，所述微径玻璃管的内径为15μm－50μm，优选为25μm－45μm。

在另一优选例中，所述步骤(3)中，先用所述微径玻璃管吸入一段标记物，然后在倒置荧光显微镜下，将单个目的细胞吸入到微径玻璃管中，从而达到单细胞分离的目的。从微径玻璃管移除细胞时，待所述标记物移至微径玻璃管口则表明目的细胞已经从微径玻璃管移除。

在另一优选例中，所述标记物可以为带颜色的无菌液体或者无菌液体封闭的气泡。

在另一优选例中，所述无菌液体封闭的气泡可以采用以下方式制备：将所述微径玻璃管插入无菌液体(优选PBS溶液)中立即取出再插入所述无菌液体中，即可制得所述无菌液体封闭的气泡作为标记物。

在另一优选例中，所述基于微径玻璃管的单细胞分离装置包括依次连接的：微径玻璃管、手持管、连通管、微孔过滤器和口吸管；

其中，所述细胞采集管被设置用于从样品中吸取单个细胞；所述手持管被设置用于控制所述细胞采集管；所述微孔过滤器被设置用于阻隔微生物。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(4)对分离得到的所述目的细胞进行培养或者对分离得到的目的细胞进行核酸或蛋白分析。

在另一优选例中，所述步骤(4)中，细胞培养体系为：

在基础培养基(DMEM或PRIM1640)中添加含1％-2％(v/v)原患者血清、胰岛素和/或氢化可的松。

本发明的第二方面，提供了一种分离单个循环肿瘤细胞的装置，所述装置包括依次连接的：

细胞采集管、手持管、连通管、微孔过滤器和口吸管。

其中，所述细胞采集管被设置用于从样品中吸取单个细胞；

所述手持管被设置用于控制所述细胞采集管；

所述微孔过滤器被设置用于阻隔微生物。

在另一优选例中，所述装置还包括第一接头，所述细胞采集管和所述手持管通过所述第一接头连接。

在另一优选例中，所述第一接头由硅胶制成，在所述接头的一端设有供所述细胞采集管插入的孔。

在另一优选例中，所述手持管中填充有吸附材料，所述吸附材料优选为脱脂棉。

在另一优选例中，所述手持管由硬质透明材料制成。所述硬质透明材料包括但不限于玻璃、塑料等。

在另一优选例中，所述装置还包括第二接头，所述微孔过滤器和所述口吸管通过所述第二接头连接。

在另一优选例中，所述微孔过滤器的过滤面积为口吸管横截面面积的2-10倍，优选地为3-5倍。

在另一优选例中，所述微孔过滤器孔径为0.1-0.5μm，优选地为0.1-0.22μm。

在另一优选例中，所述细胞采集管为微径玻璃管。

在另一优选例中，所述微径玻璃管直径为15-50μm，优选地为25-45μm，更优选地为30μm。

在另一优选例中，所述连通管的长度为30cm-60cm，优选地为50cm。

在另一优选例中，所述连通管由柔性的材质制成，所述柔性的材质包括但不限于橡胶、PVC、聚烯烃热塑弹性体(TPE)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是可继续培养的活细胞染色后在倒置显微镜下观察到的白细胞(WBC)和循环肿瘤细胞(CTC)。其中绿色荧光代表EpCAM、pan-CK等上皮标志物的表达，红色荧光代表白细胞标志物CD45的表达，Bright为显微镜在明场条件下观察到的细胞形态。其中CTC为绿色荧光阳性，红色荧光阴性；WBC为绿色荧光阴性，红色荧光阳性。

图2是可用于基因组分析的细胞液染后在倒置显微镜下观察到的白细胞(WBC)和循环肿瘤细胞(CTC)。其中绿色荧光代表EpCAM、pan-CK等上皮标志物的表达，红色荧光代表白细胞标志物CD45的表达，蓝色荧光为细胞核染料DAPI。其中CTC为绿色荧光阳性，红色荧光阴性；WBC为绿色荧光阴性，红色荧光阳性。

图3是本发明中提供的单个细胞分离装置结构示意图。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种简单的分离单个循环肿瘤细胞的方法，本发明中利用一种不依赖CTC表面抗原表达的CTC阴性分离法进行CTC富集，然后对富集的细胞进行特异抗体染色标记。之后再通过单细胞分离装置在荧光显微镜下进行单个CTC的分离。

本发明提供了一种利用循环肿瘤细胞(CTC)阴性富集技术和免疫荧光染色技术对外周血中单个循环肿瘤细胞进行分离的方法，分离得到的单个循环肿瘤细胞可应用于多种细胞、蛋白以及基因组研究。本发明首先利用梯度离心法对实体瘤患者外周血进行梯度离心以去除血浆和红细胞，再利用偶联白细胞特异表面抗原的免疫磁珠去除绝大多数血源性的白细胞，从而进行外周血CTC的富集。之后对富集到的细胞悬液进行免疫荧光液态染色，在荧光显微镜下根据细胞的表面抗原表达特性进行CTC判定，最后用口吸法将其挑取出来。

为了配合上述方法，本发明提供了一种分离单个细胞的装置，所述装置包括依次连接的：

细胞采集管、手持管、连通管、微孔过滤器和口吸管。

其中，所述细胞采集管被设置用于从样品中吸取单个细胞；

所述手持管被设置用于控制所述细胞采集管；

所述微孔过滤器被设置用于阻隔微生物。

在另一优选例中，所述装置还包括第一接头，所述细胞采集管和所述手持管通过所述第一接头连接。

在另一优选例中，所述第一接头由硅胶制成，在所述接头的一端设有供所述细胞采集管插入的孔。

在另一优选例中，所述手持管中填充有吸附材料，所述吸附材料优选为脱脂棉。

在另一优选例中，所述手持管由硬质透明材料制成。所述硬质透明材料包括但不限于玻璃、塑料等。

在另一优选例中，所述装置还包括第二接头，所述微孔过滤器和所述口吸管通过所述第二接头连接。

在另一优选例中，所述微孔过滤器的过滤面积为口吸管横截面面积的2-10倍，优选地为3-5倍。

在另一优选例中，所述微孔过滤器孔径为0.1-0.5μm，优选地为0.1-0.22μm。

在另一优选例中，所述细胞采集管为微径玻璃管。

在另一优选例中，所述微径玻璃管直径为15-50μm，优选地为25-45μm，更优选地为30μm。

在另一优选例中，所述连通管的长度为30cm-60cm，优选地为50cm。

在另一优选例中，所述连通管由柔性的材质制成，所述柔性的材质包括但不限于橡胶、PVC、聚烯烃热塑弹性体(TPE)。

如图3所示，本发明的分离单个细胞的装置包括依次连接的细胞采集管1、手持管3、连通管4、微孔过滤器5和口吸管6；所述细胞采集管1被设置用于从样品中吸取单个细胞；所述手持管3被设置用于控制所述细胞采集管，通过握持手持管3控制细胞采集管的运动方向；所述微孔过滤器5被设置用于阻隔微生物。

本实施方式中，细胞采集管1为内径为30μm的微径玻璃管。所述装置还包括第一接头2，所述细胞采集管1和所述手持管3通过所述第一接头2连接。接头2由硅胶制成，在所述接头2的一端设有供所述细胞采集管1插入的孔。该设计方便随时更换细胞采集管1，以分离不同的细胞，或处理不同的样品，而不用更换整个细胞分离装置。

在手持管3为外径为10mm的中空中性玻璃管，填充有脱脂棉，可以吸取使用过程中产生的水汽，也可以吸取过量吸入的细胞培养液。

本实施例中，连通管4为50cm长的内径为8mm外径为12mm的橡胶管，一端于手持管3连接，另一端宇微孔过滤器5连接。

微孔过滤器5的孔径为0.2μm，可以有效的将人与细胞样品相隔离，既能有效的防止人的呼出气体对细胞样品的污染，也可以防止细胞样本可能带有的微生物对人造成感染。微孔过滤器5的过滤面积远大于口吸管横截面的面积，使得吸气更顺畅，操作更稳定。

在其它实施方式中，在微孔过滤器5和口吸管6之间设置第二连接头，在口吸管6内放入适量干净的吸水纸，以吸附呼出气体中的水蒸气，当需要更换口吸管时，可以方便地将口器管6取下更换，而不需要更换整个的分离装置。

在使用本发明的装置前，需要检测装置的气密性，将装置置于水中，从口吸管6吹气，观察各个连接处是否有气泡产生，如果没有气泡产生，而且只有细胞采集管1处冒气泡，说明装置气密性好，可以用于单细胞挑取实验。

本发明的一个优选的实施方式如下：

一种利用循环肿瘤细胞(CTC)阴性富集技术和免疫荧光染色技术，并结合单细胞分离装置对外周血中单个循环肿瘤细胞进行分离的方法它包括如下步骤：

(1)抗凝管采集外周血样本7.5ml，实验前检查无溶血凝血现象；

(2)水平离心机进行密度梯度离心，取单个核细胞聚集层；在单个核细胞悬液中加入偶联白细胞表面抗原CD45的免疫磁珠，分离白细胞，从而达到阴性富集CTC的目的；

(4)收获待测细胞，根据不同实验目的分别对细胞进行免疫荧光染色处理：

a.要对分离的单个CTC进行后续培养，处理步骤为：

加入PBS清洗一到两次；离心弃上清后用PBS重悬细胞，根据抗体说明书要求添加一定比例的Alexafluor488荧光标记的抗体EpCAM、pan-CK、和/或其他上皮特有细胞表面抗体，同时添加Alexafluor594荧光标记的抗体CD45；孵育后，用Hoechst进行细胞核染色，或者不染核；最后用PBS清洗并重悬细胞；

b.要对分离的单个CTC进行核酸或蛋白分析，处理步骤为：

先分别用固定液和破膜剂处理细胞，PBS清洗一到两次；离心弃上清后用PBS重悬细胞，添加Alexafluor488荧光标记的抗体EpCAM、pan-CK、和/或其他上皮特有细胞表面抗体，同时添加Alexafluor594荧光标记的抗体CD45；孵育后，再用DAPI进行细胞核染色，最后用PBS清洗并重悬细胞；

(5)将染色后的细胞置于96孔平底细胞培养板，并稀释至每孔小于200个细胞；然后在倒置荧光显微镜下寻找EpCAM、CK或者其他上皮标志物表达阳性(绿色荧光阳性)，且CD45表达阴性(红色阴性)的真核细胞(DAPI蓝色阳性)；

(6)最后用单细胞分离装置分离单个目的细胞

所述单细胞分离装置包括依次连接的微径玻璃管、微径玻璃管接头(第一接头)、无菌中性玻璃管(手持管)、无菌塑料软管(连通管)、0.2μm微孔过滤器、和吸气管；先将微径玻璃管插入PBS中并立即取出再插入PBS，由于毛细管吸附和大气压强的作用，玻璃口吸管中会自动吸入由一个气泡分隔成两段的PBS液体；再在倒置显微镜下，将单个目的细胞吸入到玻璃口吸管；

(7)将吸入细胞的玻璃口吸管移出，插入细胞培养液或者细胞裂解液，小心吹出至PBS气泡处；如果是后续培养细胞，则将吸取的细胞置于细胞培养液中；如果是后续进行核酸或蛋白分析，则将细胞置于相应的裂解液中，立即进行细胞裂解。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明用CTC阴性富集技术进行CTC富集，相比阳性磁珠富集法，目的细胞受到的干扰更少，结合挑取分离的细胞可以完全保持细胞活性，除能进行核酸和蛋白分析外，还可用于细胞培养；

(2)本发明富集到的细胞进行免疫荧光鉴定时，结合了多种上皮细胞标志物，包括EpCAM和Pan-CK(包括CK7、CK8、CK19等多种常见上皮标志物)，提高了CTC的检出率。荧光免疫染色的效果直接影响了后续的目标细胞鉴定和单细胞分离，本发明中经过大量实验确定了优选的针对CTC细胞分离的免疫荧光染色条件。使用本发明优选地免疫荧光染色条件进行染色，具有良好的特异性和灵敏度。

(3)本发明所用的实验设备简单，不需要额外的分选仪器，成本低廉，使用便捷。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂均可从市售渠道获得。本实施例中所用的抗体可以购自Abcam公司,荧光染料可以买自Invitrogen公司，免疫磁珠可以购自Stemcelltechnologies公司。

实施例1一种用于后续培养的活的单个循环肿瘤细胞的分离方法

(1)ACD抗凝管采集肿瘤患者外周血样本7.5ml，48小时内进行富集处理，实验前检查无溶血凝血现象。另用促凝管收集2ml该患者外周血，分离血清，以用作后续细胞培养添加剂。

(2)对外周血循环肿瘤细胞进行阴性富集。

将采血管配平，头尾颠倒混匀后，室温离心7分钟(800g)。弃上清至棕红色沉淀上方5毫米处。

于50ml离心管中加入3ml细胞密度梯度离心分离介质，将分离血浆后的血细胞混合液沿管壁液面处缓慢加到分离介质顶层。使用1ml1×CTC缓冲液洗涤原血样管壁，并将洗涤液转移至离心管B的溶液顶层。室温离心7分钟(450g)。

离心后可见三层液体，先从上层和中间层的液面交界处开始吸取液体，并转移至另一50ml离心管，然后将底层沉积红细胞上的所有液体转移到新的离心管。然后在该离心管中添加150ul耦联anti-CD45的免疫磁珠，置于水平摇床上，水平孵育10min。

再重新取一50ml离心管并加入3ml离心分离介质，然后将磁珠孵育后的细胞悬液沿管壁液面处缓慢加到分离介质顶层。室温离心7分钟(450g)。转移上清液后，用缓冲液清洗离心3分钟(700g)，弃上清至1ml，转移至2ml离心管，并置于磁力架上3分钟以彻底吸附磁珠。将未被磁场吸附全部上清取出，则为富集到的含CTC的细胞悬液。富集到的细胞总量约300个。其中包括CTC，以及残留的白细胞等血源性细胞。CTC数量根据患者本身的情况而不同。

(3)加入200μlPBS洗一次，1500rpm离心10分钟，弃上清；加入200μlPBS重悬细胞。按抗体和细胞悬液体积比1:50的比例加入Alexafluor488荧光标记的抗EpCAM抗体和抗pan-CK抗体，同时按抗体和细胞悬液体积比1:50的比例加入Alexafluor594荧光标记的抗CD45抗体。室温孵育1小时，1500rpm离心10分钟，弃上清；再用300μlPBS重悬细胞。

(4)将染色后的细胞置于96孔平底细胞培养板，一共加入到3个孔中，每孔100μl，每孔细胞约150个。然后在倒置荧光显微镜下寻找EpCAM、CK或者其他上皮标志物表达阳性(绿色荧光阳性)，且CD45表达阴性(红色荧光阴性)的细胞。

(5)找到目的细胞后，关闭荧光，在明场下再次确认细胞。用基于微径玻璃管的口控单细胞分离装置吸取目的细胞。

(6)预先配置适当的CTC培养基，并加入到培养器皿中。将吸入细胞的微径玻璃管插入培养器皿的培养基中，并小心吹出至PBS气泡处。在显微镜下确认挑出的单个细胞，然后将该培养器皿放入适当的条件进行CTC培养。

本实施例中CTC培养基配方如下：

基础培养基PRMI1640,加入2％原患者血清。

CTC培养条件为：37℃恒温培养箱，CO₂浓度为5％。

免疫荧光染色步骤对后续的目的细胞的鉴定和单细胞的分离具有显著的影响，在本实施例中，本发明人对免疫荧光条件进行了优化，最终意外地发现在抗体和细胞悬液体积比1:50的比例下，孵育1小时，染色效果最好。抗体用量高于此比例时，非特异性染色严重倒置无法区别出目的细胞，抗体用量低于此比例时，染色灵敏度显著降低，同样地无法识别出目的细胞。

实施例2一种用于基因组分析的单个循环肿瘤细胞的分离方法

(1)ACD抗凝管采集外周血样本7.5ml，48小时内进行富集处理，实验前检查无溶血凝血现象。

(2)对外周血循环肿瘤细胞进行阴性富集。

将采血管配平，头尾颠倒混匀后，室温离心7分钟(800g)。弃上清至棕红色沉淀上方5毫米处。

于50ml离心管中加入3ml细胞密度梯度离心分离介质，将分离血浆后的血细胞混合液沿管壁液面处缓慢加到分离介质顶层。使用1ml1×CTC缓冲液洗涤原血样管壁，并将洗涤液转移至离心管B的溶液顶层。室温离心7分钟(450g)。

离心后可见三层液体，先从上层和中间层的液面交界处开始吸取液体，并转移至另一50ml离心管，然后将底层沉积红细胞上的所有液体转移到新的离心管。然后在该离心管中添加150ul耦联anti-CD45的免疫磁珠，置于水平摇床上，水平孵育10min。

再重新取一50ml离心管并加入3ml离心分离介质，然后将磁珠孵育后的细胞悬液沿管壁液面处缓慢加到分离介质顶层。室温离心7分钟(450g)。转移上清液后，用缓冲液清洗离心3分钟(700g)，弃上清至1ml，转移至2ml离心管，并置于磁力架上3分钟以彻底吸附磁珠。将未被磁场吸附全部上清取出，则为富集到的含CTC的细胞悬液。富集到的细胞总量约300个。其中包括CTC，以及残留的白细胞等血源性细胞。CTC数量根据患者本身的情况而不同。

(3)加入PBS洗一次，1500rpm离心10分钟，弃上清；加入预冷(4℃)固定液，室温孵育10分钟，1500rpm离心10分钟，弃上清；加入破膜剂，室温孵育10分钟，1500rpm离心10分钟，弃上清。

(4)加入200μl破膜剂洗一次，1500rpm离心10分钟，弃上清；加入200μl破膜剂重悬细胞。按1:50的比例加入Alexafluor488荧光标记的抗EpCAM抗体和抗pan-CK抗体，同时按1:50的比例加入Alexafluor594荧光标记的抗CD45抗体。室温孵育1小时，1500rpm离心10分钟，弃上清；再用200μlPBS重悬细胞，按1:100的比例加入DAPI进行细胞核染色，室温孵育5分钟，1500rpm离心10分钟，弃上清；最后用PBS清洗并重悬细胞。

(5)将染色后的细胞置于96孔平底细胞培养板，一共加入到3个孔中，每孔细胞约150个。然后在倒置荧光显微镜下寻找EpCAM、CK或者其他上皮标志物表达阳性(绿色荧光阳性)，且CD45表达阴性(红色荧光阴性)的真核细胞(DAPI蓝色阳性)。

(6)找到目的细胞后，将荧光显微镜滤光片调至UV通道，用基于微径玻璃管的口控单细胞分离装置吸取目的细胞。

(7)预先配置好细胞裂解液，并按照每个细胞5μl的体积分装于PCR管中。将吸入细胞的玻璃口吸管插入含裂解液的PCR管中，并小心吹出至PBS气泡处。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种单个循环肿瘤细胞(CTC)的分离方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)对外周血样本进行阴性富集，获得富集的CTC细胞样本；

(2)分别使用第一荧光标记的抗上皮细胞标志物抗体和第二荧光标记的抗CD45抗体对富集的CTC细胞样本进行荧光染色，并对染色后的CTC细胞样本进行稀释；

(3)对第一荧光阳性且第二荧光阴性的目的细胞进行单细胞分离。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗上皮细胞标志物抗体为抗EpCAM抗体和/或抗pan-CK抗体。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一荧光为Alexafluor488荧光，和/或所述第二荧光为Alexafluor594荧光。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)中，使用水平离心机对外周血样本进行密度梯度离心，取单个核细胞聚集层制成单个核细胞悬液，接入偶联白细胞表面抗原CD45的免疫磁珠，分离白细胞，从而达到阴性富集CTC的目的；和/或

所述步骤(2)中，在富集的CTC细胞样本中加入PBS清洗一到两次；离心弃上清后用PBS重悬细胞，添加所述第一荧光标记的抗上皮细胞标志物抗体和所述第二荧光标记的抗CD45抗体后进行孵育。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一荧光标记的抗上皮细胞标志物抗体与细胞悬液的体积比为1：20－100，优选为1：40-60；和/或

所述第二荧光标记的抗CD45抗体与细胞悬液的体积比为1：20－100，优选为1：40-60。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(3)中，使用基于微径玻璃管的单细胞分离装置分离所述目的细胞。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述步骤(3)中，先用所述微径玻璃管吸入一段标记物，然后在倒置荧光显微镜下，将单个目的细胞吸入到微径玻璃管中，从而达到单细胞分离的目的；优选地，所述标记物可以为带颜色的无菌液体或者无菌液体封闭的气泡。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述基于微径玻璃管的单细胞分离装置包括依次连接的：微径玻璃管、手持管、连通管、微孔过滤器和口吸管；

其中，所述细胞采集管被设置用于从样品中吸取单个细胞；所述手持管被设置用于控制所述细胞采集管；所述微孔过滤器被设置用于阻隔微生物。

9.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括步骤：

(4)对分离得到的所述目的细胞进行培养或者对分离得到的目的细胞进行核酸或蛋白分析。

10.一种分离单个循环肿瘤细胞的装置，其特在于，所述装置包括依次连接的：

细胞采集管、手持管、连通管、微孔过滤器和口吸管；

其中，所述细胞采集管被设置用于从样品中吸取单个细胞；

所述手持管被设置用于控制所述细胞采集管；

所述微孔过滤器被设置用于阻隔微生物。