CN106370867B - 一种联合检测评估肝癌肝移植术后转移复发风险的试剂盒 - Google Patents

一种联合检测评估肝癌肝移植术后转移复发风险的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学生物检测领域，具体是一种将AFP和iFISH‑CTC检测联合使用，用于评估肝癌肝移植术后转移复发风险的检测试剂或试剂盒及其检测方法。本发明通过检测AFP含量和CTC数目，评估肝癌肝移植术后转移复发的风险，为肝癌肝移植术后转移复发检测提供了新的手段，以便尽早进行临床干预，防止病情进展，改善患者预后。

Description

一种联合检测评估肝癌肝移植术后转移复发风险的试剂盒
技术领域
本发明涉及医学生物检测技术领域，具体地说，是一种将AFP和iFISH-CTC检测联合使用，用于评估肝癌肝移植术后转移复发风险的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球最常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在所有肿瘤疾病中分列第五位和第三位(Zhang Y,Li J,Cao L,etal.Circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma:detection techniques,clinical implications,and future perspectives[J].Semin Oncol,2012,39(4):449-460.)。我国是肝病大国，每年约有11万人死于HCC，占全球肝癌死亡人数的45％。肝移植是治疗肝癌的重要手段之一，肝癌患者约占我国每年肝移植受体总数的40-50％，即使经过多种治疗手段(手术切除、放疗，化疗及联合治疗方法)，HCC患者预后仍然不佳，肝癌切除术后1年复发率高达40％，而肝移植术后1年复发率也超过10％(Mazzaferro V,Llovet J M,Miceli R,et al.Predicting survival after liver transplantation in patientswith hepatocellular carcinoma beyond the Milan criteria:a retrospective,exploratory analysis[J].Lancet Oncol,2009,10(1):35-43.)。秉承早发现早治疗的原则，及早发现肝癌的发生和转移，对于改善患者预后，提高临床治疗效果至关重要。
甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)是一种糖蛋白，主要是胚胎内胚层相关组织细胞的同源蛋白产物。肝癌是造成血清中AFP含量升高的原因之一，但临床上存在三分之一肝癌患者的AFP水平未明显升高，而且在慢性活动性肝炎(CAH)患者也有20％-40％的人的AFP升高。因此2010版美国肝病研究协会(AASLD)建议在常规监测HCC时以B超为主，不再将AFP作为常规筛查指标。但是在肝癌肝移植术后转移复发风险评估过程中，同一患者AFP水平高低具有参考价值，可作为治疗成功与否，是否复发的重要指标。
循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)是自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。肝癌细胞极易通过血液播散，部分肝癌患者在肝癌切除或肝移植前，已有肿瘤细胞脱落进入血液循环系统中(Paterlini-Brechot P,Benali N L.Circulating tumor cells(CTC)detection:clinical impact and futuredirections[J].Cancer Lett,2007,253(2):180-204.)，手术中对肿瘤的挤压操作又可能导致肿瘤细胞通过血液播散。并且肝移植术后的免疫抑制状态使得CTC产生并存活的概率大大增加，入血的CTC是导致肝癌术后复发和转移的首要条件。
临床研究显示HCC肝移植术后移植肝是肝癌早期复发的最常见部位，这一过程被称为肿瘤细胞自我种植(Kim M Y,Oskarsson T,Acharyya S,et al.Tumor self-seedingby circulating cancer cells[J].Cell,2009,139(7):1315-1326.)。自我种植的肿瘤细胞不仅能够通过原位继续生长，还能促进新生血管和基质形成，提示HCC-CTC在肝移植术后肝癌复发和转移中发挥关键作用。而临床缺乏有效手段检测HCC-CTC，难以对可能出现复发转移的高危患者进行筛查和针对性的预防治疗，一旦通过影像学手段发现HCC复发转移，往往意味着患者最终难逃死亡的厄运。
因此，将甲胎蛋白检测与iFISH-CTC检测结合为HCC的术后评估和治疗反应提供了一种强大的非侵入性方法。目前对于肝癌的诊断主要依靠影像学检查，甲胎蛋白检测结合iFISH-CTC联合检测来评估肝癌肝移植术后转移复发风险的检测指标还未有相关文献报道和临床应用。
中国专利文献CN103866016A公开了一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其应用，可用于肿瘤病人微创液体活检，实现肿瘤转移复发的早期诊断和预警，监控抗肿瘤治疗疗效及肿瘤进展情况。但其检测主要依赖于肿瘤细胞对EpCAM的表达。有报道显示，HCC的EpCAM的表达率仅为14.3-39％。同时，在肿瘤的进展过程中，CTC会发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)从而丢失包括EpCAM在内的部分上皮表型。因此，EpCAM含量并不能完全代表体内循环肿瘤细胞的水平，而本发明中采用的iFISH-CTC检测能够准确定义样本中CTC的数目，单独使用iFISH的检测的特异度达到76.2％，结合血清中AFP含量分析后，在保持高特异度(71.4％)的基础上显著提升了敏感度(88.9％)，本发明在评估肝癌肝移植术后转移复发的风险方面具有优势。
发明内容
本发明的目的在于有效评估肝癌肝移植术后转移复发的风险，提供一种特异性和敏感性都极好的检测肝癌肝移植术后转移复发的检测试剂或试剂盒及其检测方法。
为了实现上述目的，本发明的主要技术方案为：
本发明的第一方面，提供甲胎蛋白(AFP)和循环肿瘤细胞(CTC)在制备评估肝癌肝移植术后转移复发的检测试剂或试剂盒中的应用。
所述的检测试剂或试剂盒通过检测肝癌患者肝移植后血清中AFP含量和血液中CTC数目，评估肝癌肝移植术后转移复发的风险，预测肝移植后是否发生转移，为后续治疗提供指导意见。
本发明的检测试剂或试剂盒是一种血清学检测试剂或试剂盒。
本发明的检测试剂，是检测AFP含量的试剂和检测CTC数量的试剂的组合。
本发明的试剂盒，包含检测AFP含量的试剂和检测CTC数量的试剂。
优选的，所述的血液中CTC数目采用iFISH检测。
优选的，所述的检测试剂为检测血清中AFP含量的试剂，和采用iFISH检测血液中CTC数目的试剂的组合。
优选的，所述的试剂盒包含检测血清中AFP含量的试剂，和采用iFISH检测血液中CTC数目的试剂。
本发明在肝癌患者进行肝移植后定期随访，并采集外周血。利用UniCel DxI 800自动微粒子发光免疫分析仪对分离得到的血清进行AFP检测。运用梯度离心和免疫吸附方法进行对阴性富集，对已富集人外周血循环肿瘤细胞的载玻片进行免疫荧光染色，使用荧光显微镜进行结果判读。监测肝癌患者进行肝移植手术后体内AFP含量和CTC数目的动态变化。
本发明通过监测30例肝癌肝移植患者术前术后血清中AFP含量和CTC数目，通过ROC分析及秩和检验发现，AFP和iFISH联合诊断复发前3个月效果显著AUC联合复发前＝0.831，P＜0.01。预测效果好于AFP和iFISH单独诊断，AUCAFP＝0.643，P>0.05；AUCiFISH＝0.643，P>0.05。虽然AFP单纯检测特异度达到95.2％，但是其敏感度只有33.3％。iFISH单纯检测敏感度和特异度分别为66.7％和76.2％。AFP+iFISH联合检测则能够将敏感度提升到88.9％，特异度依然保持较高水平。本发明首次发现了AFP和iFISH联合诊断对肝癌肝移植术后复发转移的预测作用。
本发明的第二方面，提供一种联合检测评估肝癌肝移植术后转移复发风险的试剂盒，也即一种评估肝癌肝移植术后转移复发的AFP和iFISH-CTC联合检测试剂盒，是由AFP系统、iFISH-CTC系统组成。
所述的试剂盒包含检测血清中AFP含量的试剂，和采用iFISH检测血液中CTC数目的试剂。该试剂盒是通过检测肝癌患者肝移植后血清中AFP含量和血液中CTC的数目，预测肝移植后是否发生转移，为后续治疗提供指导意见。
优选的，所述的检测血清中AFP含量的试剂为采用UniCel DxI 800自动微粒子发光免疫分析仪检测血清中AFP含量的试剂。
在本发明的一个优选实施例中，所述的检测血清中AFP含量的试剂包括：
1)R1:Access AFP试剂盒：6盒装，50个测试/盒。
2)R1a：包被有大鼠抗AFP单抗的磁性颗粒悬浮于TRIS缓冲盐中，含离子表面活性剂，小牛血清白蛋白(BSA)，＜0.1％的叠氮钠和0.1％ProClin300。
3)R1b：标记有碱性磷酸酶(小牛性)的大鼠抗AFP单抗酶结合物稀释于磷酸缓冲盐中，含离子表面活性剂，小牛血清白蛋白(BSA)，＜0.1％的叠氮钠和0.25％ProClin300。
4)S0～S6：Access AFP定标品：S0：以牛血清白蛋白(BSA)为基质的缓冲液，还含有离子表面活性剂，＜0.1％叠氮钠和0.1％ProClin300，含有的AFP浓度为0.0ng/ml。
S1，S2，S3，S4，S5，S6：含有的AFP浓度依次分别为2.5,5,25,100,500,3000ng/ml，保存在以牛血清白蛋白(BSA)为基质的缓冲液，还含有离子表面活性剂，＜0.1％叠氮钠和0.1％ProClin300。
所述的采用iFISH检测血液中CTC数目的试剂包括：
1)10X浓缩CRC缓冲液(10X Concentrated CRC Buffer)12.2ml
2)赛特CTC分离液(Cytelligen CTC Separation Matrix)6ml
3)hCTC处理缓冲液(hCTC Treatment Buffer)3ml
4)赛特固定剂(Cytelligen Fixative)100μL
5)赛特免疫磁珠(Cytelligen Immuno-magnetic Beads)200μL
6)10X浓缩FR3液(10X Concentrated FR3solution)4.1ml
7)抗体洗液(Ab Washing Solution)1.2ml
8)抗体准备液-1(Antibody Preparation Solution-1)200μL
9)FR2样品稀释液(FR2Sample Diluent)240μL
10)DAPI染色液(DAPI Mounting Media)5μL
11)FR1细胞固定液(FR1Cell Fixative)6μL
12)CEP-8探针(Containing CEP-8Probe)10μL
13)抗hCK 18抗体(Anti-hCK18(Alexa 488))1μL
14)抗hWBC抗体(Anti-hWBC(Alexa 594))1μL
15)75％乙醇 40ml
16)85％乙醇 40ml
17)100％乙醇 40ml
18)封片胶 250μL。
本发明的第三方面，提供AFP和iFISH-CTC检测联合检测评估肝癌肝移植术后转移复发的风险的方法。
本发明的第四方面，提供一种利用上述评估肝癌肝移植术后转移复发的试剂盒的检测方法，所述的检测方法为：
A)采用UniCel DxI 800自动微粒子发光免疫分析仪检测血清中AFP含量；
B)采用iFISH检测血液中CTC数目：运用梯度离心和免疫吸附方法进行阴性富集；使用iFISH CTC Identification Kit对已富集人外周血循环肿瘤细胞的载玻片进行免疫荧光染色；对已进行原位杂交免疫荧光染色后的iFISH CTC玻片使用荧光显微镜进行结果判读。符合DAPI+/CD45-/CK18+/CEP8+(单体、二倍体或多体)或者DAPI+/CD45-/CK18-/CEP8+(多体)标准的细胞均为CTC。
本发明通过检测AFP含量和CTC数目，评估肝癌肝移植术后转移复发的风险，为肝癌肝移植术后转移复发检测提供了新的手段，以便尽早进行临床干预，防止病情进展，改善患者预后。
附图说明
图1.肝癌肝移植患者术后血清AFP含量和外周血CTC数目进行的ROC结果分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等在《分子克隆：实验室指南》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：制备本发明的试剂盒
本发明的试剂盒组成如下：
A)AFP检测包含试剂
1)R1:Access AFP试剂盒：6盒装，50个测试/盒。
2)R1a：包被有大鼠抗AFP单抗的磁性颗粒悬浮于TRIS缓冲盐中，含离子表面活性剂，小牛血清白蛋白(BAS)，＜0.1％的叠氮钠和0.1％ProClin300。
3)R1b：标记有碱性磷酸酶(小牛性)的大鼠抗AFP单抗酶结合物稀释于磷酸缓冲盐中，含离子表面活性剂，小牛血清白蛋白(BSA)，蛋白(羊性、兔性、鼠性)，＜0.1％的叠氮钠和0.25％ProClin300。
4)S0～S6：Access AFP定标品：S0：以牛血清白蛋白(BSA)为基质的缓冲液，还含有离子表面活性剂，＜0.1％叠氮钠和0.1％ProClin300，含有的AFP浓度为0.0ng/ml。
S1，S2，S3，S4，S5，S6：含有的AFP浓度依次分别为2.5,5,25,100,500,3000ng/ml，保存在以牛血清白蛋白(BSA)为基质的缓冲液，还含有离子表面活性剂，＜0.1％叠氮钠和0.1％ProClin300。
B)CTC检测包含试剂：
1)10X浓缩CRC缓冲液(10X Concentrated CRC Buffer) 12.2ml
2)赛特CTC分离液(Cytelligen CTC Separation Matrix) 6ml
3)hCTC处理缓冲液(hCTC Treatment Buffer) 3ml
4)赛特固定剂(Cytelligen Fixative) 100μL
5)赛特免疫磁珠(Cytelligen Immuno-magnetic Beads) 200μL
6)10X浓缩FR3液(10X Concentrated FR3solution) 4.1ml
7)抗体洗液(Ab Washing Solution) 1.2ml
8)抗体准备液-1(Antibody Preparation Solution-1) 200μL
9)FR2样品稀释液(FR2Sample Diluent) 240μL
10)DAPI染色液(DAPI Mounting Media) 5μL
11)FR1细胞固定液(FR1Cell Fixative) 6μL
12)CEP-8探针(Containing CEP-8Probe) 10μL
13)抗hCK 18抗体(Anti-hCK18(Alexa 488)) 1μL
14)抗hWBC抗体(Anti-hWBC(Alexa 594)) 1μL
15)75％乙醇 40ml
16)85％乙醇 40ml
17)100％乙醇 40ml
18)封片胶 250μL。
实施例2：实施例1的试剂盒的检测方法
1、采集血液样本及样本准备：
由于外周血具有取材方便、无创伤性、连续检测的优点，从血清中检测肝癌转移的生物标志物可以及早检测发现肝癌的转移，将肝癌诊断提高到一个新的水平。
血液样本在上海交通大学医学院附属仁济医院采集:30例肝癌肝移植患者、18例非肝癌肝移植患者。样品收集：收集约3～6ml病人的外周血放入真空促凝管中，颠倒数次以便充分结合，静置约半小时，1600g离心10min，上清转移到新管。上清二次进行12000g离心10min，取上清，加入新离心管中得到血清。收集7.5ml外周血放于专用的BD抗凝管(管盖为黄色)内，轻轻颠倒8次，防止凝块，得到无凝块和无溶血的全血。
2、血清样本中AFP含量检测：
采用UniCel DxI 800自动微粒子发光免疫分析仪检测血清中AFP含量，具体步骤为：
1)从主菜单进入测试要求屏幕。
2)对每个样品，设置一个样品架上的位置，输入样品信息和需检测的测试名称。
3)将样品管(杯)放入样品架中已设定的位置。
4)按下运行键(Run)开始检测。
5)仪器会提醒操作者运行所需的定标。
6)系统会自动计算检测结果。
3、全血中CTC数目的检测
采用密度梯度离心的方法去除全血中的血浆和红细胞，利用Cytelligen免疫磁珠仅与血源性白细胞相结合而不与非血源性肿瘤上皮细胞结合的特征，达到高效、特异地去除白细胞并富集CTC。将富集得到的细胞涂片于载玻片标本框内，置室温(20-30℃)晾干过夜。然后将载玻片于干燥箱烘干，滴加探针进行DNA探针杂交。使用Antibody PreparationSolution-1、Anti-hCK18和1μL Anti-hWBC进行抗体染色，最后滴加DAPI Mounting Media。在荧光显微镜下读片和结果判读。定义DAPI+/CD45-/CK18+/CEP8+(单体、二倍体或多体)或者DAPI+/CD45-/CK18-/CEP8+(多体)标准的细胞为CTC。
具体步骤包括：
(1)去除血浆：将样本颠倒混匀，于常温离心机中,800g(或1956rpm)离心8分钟；用微型台式真空泵(0.06Mpa)吸弃上清，倒入50ml离心管A，1×Concentrated CRC Buffer1ml洗涤2次，洗涤液并入离心管A。
(2)去除红细胞：向离心管B加入3ml Cytelligen CTC Separation Matrix，将A管中的血液混悬液沿壁缓慢叠加入B管顶层，吸取1ml 1×Concentrated CRC Buffer 1ml洗涤A管，沿壁缓慢并入B管，450g(1467rpm)离心8分钟；将离心管B中白膜层液体吸取转移至50ml离心管C，把红细胞层之上所有清亮透明液体也转移至50ml离心管C，竖直摇匀液。
(3)制备Immune-magnetic beads：取200μL Cytelligen Immune-magnetic beads加入2ml平底离心管；再于每个平底离心管内加入1×Concentrated CRC Buffer 1ml，轻柔吹打混匀，置于磁力架(BEAVER)上放置1分钟后，弃上清。加1×Concentrated CRC Buffer200μL，即得Immune-magnetic beads。
(4)吸附白细胞：于步骤(2)的离心管C中，分别加入Immune-magnetic beads 200μL，放置于摇床上，以130rpm。摇动20分钟。
(5)去除白细胞：加入3ml Cytelligen CTC Separation Matrix于洁净的50ml离心管D，再将步骤(4)中的Immune-magnetic beads混悬液沿D管管壁液面处缓慢加到Cytelligen CTC Separation Matrix顶层，450g(1467rpm)将离心管D离心8分钟；将Immune-magnetic beads以上所有液体转移至50ml离心管E，保留至Immune-magneticbeads上方100μL处。再于离心管E加入1×Concentrated CRC Buffer至体积45ml，颠倒混匀，配平后700g(1830rpm)离心5分钟；用真空吸液泵吸弃上清至1ml，再加入1×Concentrated CRC Buffer0.5ml，后将液体转移至2ml平底离心管，保留加样枪头。
(6)去除残余Immune-magnetic beads(白细胞)：将步骤(5)中的2ml平底离心管置于磁力架上3分钟，在第2分钟时用步骤(5)中保留的枪头沿平底离心管内Immune-magneticbeads对侧壁轻轻吹打液体1～2次，并旋转离心管15°；1分钟后将2ml平底离心管内液体转移至50ml离心管F中。
(7)洗涤CTC细胞：往步骤(6)中的离心管F中加入1×Concentrated CRC Buffer至体积45ml，将步骤(5)中保存的加样枪头洗涤吹打3下，配平，轻柔颠倒混匀，650g(1763rpm)离心5分钟；离心后用真空吸液泵吸弃上清至1ml，轻柔晃动离心管F混匀细胞。
(8)去除残留红细胞(可选)：检查离心管F内是否有残留的红细胞，若没有，继续进行下一步。若有，于离心管F中用5ml移液枪加入27℃预热后的hCTC Treatment Buffer3ml，摇匀液体，静置3分钟，每隔1分钟摇匀一次液体。
(9)再次洗涤CTC细胞：于离心管F中加入1×Concentrated CRC Buffer至体积35ml，轻柔颠倒混匀，650g(1763rmp)离心5分钟；离心后用真空吸液泵吸弃离心管F中的上清至100μL，用移液枪轻打混匀。
(10)固定和涂片：按100μL/人的用量吸取Cytelligen Cytelligen Fixative至1.5ml离心管中，取100μL的Cytelligen Fixative于离心管F；将每管混合液分别均匀涂片于载玻片标本框内，用铅笔写明病人编号，日期，操作人。
(11)玻片晾干：将步骤(10)中的标本放置室温(20-30℃)晾干过夜。
(12)染色体荧光原位杂交：富集人外周血循环肿瘤细胞的载玻片于干燥箱内32℃4小时烘干，之后留标本继续静置于干燥箱内30min凉至室温；室温瞬离FR1溶液管10秒。混合液配制好后立即加入标本上(等待时间不超过1分钟)：沿载玻片标本框内侧一角轻柔滴加240μL混合液覆盖标本框；将载玻片微斜，使用吸弃混合液。沿标本框内侧一角轻柔滴加200μL室温预热的1×FR3溶液后，立即吸弃溶液，共重复2次。沿标本框内侧一角轻柔滴加200μL27℃水浴锅预热的1×FR3溶液，室温静置2分钟，使用真空泵吸弃溶液；无水乙醇洗涤载玻片上的CTC细胞：沿标本框内侧边角轻柔滴加200μL无水乙醇后，立即吸弃，共重复2次；立刻将玻片插入缸Ⅱ中静置2分钟。取出玻片，竖立在无尘纸上，轻轻磕动，快速吸干玻片残留液至无液体流下，使用微型吹风机将玻片轻柔吹至完全干燥后立即滴加探针(本步和以下步骤均需避光操作)于标本框中央滴加10μL探针后，使用镊子将盖玻片平放在探针液上，使液体向四周蔓延至整个标本框；每张玻片使用250μL封片胶封住盖玻片四边边缘；将封好的玻片立刻放入杂交仪。运行变性76℃，5分钟；杂交37℃，1.5小时的程序进行DNA探针杂交。
(13)抗体染色：杂交结束前10分钟进行抗体配制。每张玻片200μL AntibodyPreparation Solution-1+1μL Anti-hCK18+1μL Anti-hWBC配制抗体混合液；轻柔吹打10次以充分混匀抗体置于冰箱4℃避光保存待用；杂交完毕后，使用镊子撕去封片胶，切勿移动盖玻片。将玻片置于无水乙醇缸I中，静置1分钟后轻柔晃动缸I，直至盖玻片脱落，中静置1分钟后取出，使用无尘纸吸干玻片流下的残留液，沿标本框滴加200μL 1×FR3溶液，静置1分钟，吸弃FR3溶液，共重复2次，沿载玻片标本框内侧一角轻柔滴加200μL Ab WashingSolution，将载玻片微斜，吸弃，共重复2次。沿载玻片标本框滴加200μL Ab WashingSolution，室温静置2分钟，吸弃。将玻片置于湿盒中，沿白色标本框内侧一角轻柔滴加200μL抗体混合液，30℃避光孵育2小时。沿载玻片标本框滴加200μL Ab Washing Solution,立刻吸弃，共重复2次。沿载玻片标本框滴加200μL Ab Washing Solution，室温静置2分钟，吸弃。取5μL DAPI Mounting Media滴加于标本框中央，置放盖玻片后，从盖玻片中央向四周轻轻滑动挤压并吸干溢出的多余液体。
(14)读片：对已进行原位杂交免疫荧光染色后的iFISH CTC玻片使用荧光显微镜进行结果判读，符DAPI+/CD45-/CK18+/CEP8+(单体、二倍体或多体)或者DAPI+/CD45-/CK18-/CEP8+(多体)标准的细胞为CTC。通过临床收集肝癌肝移植患者(30例)肝癌肝移植患者术后外周血，并随访观察术后状况。用上述检测方法检测血清中AFP含量和CTC数目。
实施例3：对原发性肝癌肝移植手术后AFP含量和CTC数目进行的ROC模型分析
本发明通过监测30例肝癌肝移植患者术前术后血清中AFP含量和CTC数目，通过ROC分析及秩和检验发现，AFP和iFISH联合诊断复发前3个月效果显著AUC联合复发前＝0.831，P＜0.01。预测效果好于AFP和iFISH单独诊断，AUCAFP＝0.643，P>0.05；AUCiFISH＝0.643，P>0.05(图1)。虽然AFP单纯检测特异度达到95.2％，但是其敏感度只有33.3％。iFISH单纯检测敏感度和特异度分别为66.7％和76.2％。AFP+iFISH联合检测则能够将敏感度提升到88.9％，特异度依然保持较高水平，联合诊断点P＝0.5224(表1)。本发明首次发现了AFP和iFISH联合诊断对肝癌肝移植术后复发转移的预测作用。
表1：肝癌肝移植患者术后血清AFP含量和外周血CTC数目进行的ROC结果
分析
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (7)

1.AFP和CTC在制备评估肝癌肝移植术后转移复发的检测试剂或试剂盒中的应用；所述的检测试剂或试剂盒通过检测肝癌患者肝移植后血清中AFP含量和血液中CTC的数目，评估肝癌肝移植术后转移复发的风险；所述的血液中CTC的数目采用iFISH检测。
2.根据权利要求1所述的AFP和CTC在制备评估肝癌肝移植术后转移复发的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测试剂为检测血清中AFP含量的试剂，和采用iFISH检测血液中CTC数目的试剂的组合。
3.根据权利要求1所述的AFP和CTC在制备评估肝癌肝移植术后转移复发的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂盒包含检测血清中AFP含量的试剂，和采用iFISH检测血液中CTC数目的试剂。
4.根据权利要求2或3所述的AFP和CTC在制备评估肝癌肝移植术后转移复发的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测血清中AFP含量的试剂为采用UniCel DxI800自动微粒子发光免疫分析仪检测血清中AFP含量的试剂。
5.根据权利要求2或3所述的AFP和CTC在制备评估肝癌肝移植术后转移复发的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测血清中AFP含量的试剂包括：
A)R1：Access AFP试剂盒：6盒装，50个测试/盒；
B)R1a：包被有大鼠抗AFP单抗的磁性颗粒悬浮于TRIS缓冲盐中，含离子表面活性剂，小牛血清白蛋白，＜0.1％的叠氮钠和0.1％ProClin300；
C)R1b：标记有小牛性碱性磷酸酶的大鼠抗AFP单抗酶结合物稀释于磷酸缓冲盐中，含离子表面活性剂，小牛血清白蛋白，＜0.1％的叠氮钠和0.25％ProClin300；
D)S0～S6为Access AFP定标品：
S0：以牛血清白蛋白为基质的缓冲液，还含有离子表面活性剂，＜0.1％叠氮钠和0.1％ProClin300，含有的AFP浓度为0.0ng/ml；
S1，S2，S3，S4，S5，S6：含有的AFP浓度依次分别为2.5,5,25,100,500,3000ng/ml，保存在以牛血清白蛋白为基质的缓冲液，还含有离子表面活性剂，＜0.1％叠氮钠和0.1％ProClin300。
6.根据权利要求2或3所述的AFP和CTC在制备评估肝癌肝移植术后转移复发的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的采用iFISH检测血液中CTC数目的试剂包括：
a)10X浓缩CRC缓冲液 12.2ml
b)赛特CTC分离液 6ml
c)hCTC处理缓冲液 3ml
d)赛特固定剂 100μL
e)赛特免疫磁珠 200μL
f)10X浓缩FR3液 4.1ml
g)抗体洗液 1.2ml
h)抗体准备液-1 200μL
i)FR2样品稀释液 240μL
j)DAPI染色液 5μL
k)FR1细胞固定液 6μL
l)CEP-8探针 10μL
m)抗hCK 18抗体 1μL
n)抗hWBC抗体 1μL
o)75％乙醇 40ml
p)85％乙醇 40ml
q)100％乙醇 40ml
r)封片胶 250μL。
7.根据权利要求4所述的AFP和CTC在制备评估肝癌肝移植术后转移复发的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的应用具体为：
A)采用UniCel DxI 800自动微粒子发光免疫分析仪检测血清中AFP含量；
B)采用iFISH检测血液中CTC数目：运用梯度离心和免疫吸附方法进行阴性富集；使用iFISH CTC Identification Kit对已富集人外周血循环肿瘤细胞的载玻片进行免疫荧光染色；对已进行原位杂交免疫荧光染色后的iFISH CTC玻片使用荧光显微镜进行结果判读：单体、二倍体或多体符合DAPI+/CD45-/CK18+/CEP8+标准，或者多体符合DAPI+/CD45-/CK18-/CEP8+标准的细胞均为CTC。
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