CN117165679A - 肝癌肝移植术后复发标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了肝癌复发风险标志物及其应用。具体地，本发明提供了肝癌复发风险标志物的基因或其检测试剂的用途，用于制备判断预后情况的诊断试剂或试剂盒。研究表明，肝癌复发风险标志物可作为判断肝癌复发风险情况的标记物，具有高灵敏度和特异性。

Description

肝癌肝移植术后复发标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地，涉及肝癌肝移植术后复发标志物及其应用。

背景技术

肝癌是最常见的肝脏原发恶性肿瘤，其发病率逐年增加，目前约为10/100,000，已成为引起肿瘤相关死亡的第三位恶性肿瘤。肝移植可以同时解除肝脏肿瘤病灶和肝硬化等肝脏基础病变(新肿瘤发生的主要危险因素)，因此接受移植的患者获得肿瘤治愈的机会也是最高的。在很多成熟的中心，肝移植已成为肝癌综合治疗中最有效的手段之一，并且近年来在肝移植候选者中，肝癌患者的数量也在稳步增长。根据文献报道，肝癌肝移植可以占到大多数中心肝移植总量的15-50％。

1996年，意大利Mazzaferro等率先提出选择合并肝硬化的小肝癌患者进行肝移植，建立了米兰标准。该标准要求单一癌灶直径不大于5cm或多发癌灶数目不多于3个，且最大直径不大于3cm；此外肿瘤无肝内大血管侵犯及远处转移。符合米兰标准的肝癌肝移植受者获得了长期存活。但米兰标准对肝癌大小和数目的限制过于严格，如果根据米兰标准，很多肝癌患者将失去肝移植机会。基于此，国际上出现了一些新的肝癌肝移植受者选择标准，如加州大学旧金山分校(University of California，San Francisco，UCSF)标准、Up-to-Seven标准等。

然而，随着指征的放宽，虽然短期内肿瘤相关死亡率下降明显，但中远期复发几率有所提高；不同指征肝癌肝移植术后的五年生存率可由Milan标准的85％降至Kyoto标准的65％。随着医学科技的不断进步，肝癌肝移植的治疗目标已经从单纯的肿瘤治愈性切除发展为肿瘤患者的长期生存与生活质量。因此，肝癌肝移植的术后复发的预防和监测是该领域研究的重点。而现有的肿瘤复发评估多局限于影像学、血清学指标等，个体化、精准化程度不高，存在着如下问题：

①对肝癌肝移植复发的分子演进机制尚不明确；

②对肝癌肝移植术后复发的肿瘤群体的“身份认知”尚不清晰；

③缺乏术后通过液体活检手段进行复发早期灵敏监测的标志物

因此，系统性的研究移植前后肝癌的分子标签差异，找到有效的复发监测标志物对阐明机制和转化治疗具有重要的指导意义。

发明内容

本发明的目的就是提供了有效的进行复发监测的肝癌肝移植术后复发标志物及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种肝癌复发风险标志物的基因、或其检测试剂的用途，用于制备一诊断试剂或试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒用于评估肝癌的复发风险；其中，所述的肝癌复发风险标志物包括(A1)ADGRF2。

在另一优选例中，所述肝癌复发风险标志物还包括选自下组B的一种或多种标志物的基因：(B1)MUC16；(B2)FAT1。

在另一优选例中，当风险标志物ADGRF2基因发生突变时，则提示检测对象肝癌复发风险高。

在另一优选例中，所述肝癌复发风险标志物包括A1和B1至B3中一个或多个标志物所构成的组合。

在另一优选例中，所述肝癌复发风险标志物组合为：(A1)ADGRF2；(B1)MUC16；和(B2)FAT1。

在另一优选例中，所述肝癌复发标志物还包括选自表C中的一种或多种标志物的基因：

表C

在另一优选例中，所述肝癌复发标志物包括选自C1-C27中的n种标志物，其中，n为2-27的任一正整数，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27。

在另一优选例中，所述肝癌复发标志物为：(C1)MYO18B；(C2)KDM4C；(C3)IGSF9；(C4)COL6A3；和(C5)DNAH6。

在另一优选例中，所述肝癌复发标志物为：(C1)MYO18B；(C2)KDM4C；(C3)IGSF9；(C4)COL6A3；(C5)DNAH6；(C6)KIAA1211L；(C7)TPP2；(C8)BTNL2；(C9)MSR1；和(C10)PRKD1。

在另一优选例中，所述的肝癌复发为肝癌肝移植术后的肝癌复发。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于诊断肝癌的复发风险。

在另一优选例中，所述诊断试剂或试剂盒用于检测待测样品中所述肝癌复发风险标志物是否发生突变。

在另一优选例中，所述诊断试剂包括引物、探针、测序文库、或核酸芯片(如DNA芯片)。

在另一优选例中，所述的核酸芯片包括基片和点样在基片上的特异性寡核苷酸探针，所述的特异性寡核苷酸探针包括与任一所述的肺腺癌预后标志物的多核苷酸(mRNA或cDNA)特异性结合的探针。

在另一优选例中，所述诊断试剂或试剂盒包含与ADGRF2基因结合的基因探针。

在另一优选例中，所述的检测对象为：肝癌原发患者、肝癌复发患者、或其组合。

在另一优选例中，所述的检测对象为人。

在另一优选例中，所述检测是针对离体样本的检测。

在另一优选例中，所述的离体样本包括：血液样本、血浆样本。

在另一优选例中，所述的检测试剂偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述肝癌复发风险标志物的检测可通过如下的方法进行检测：测序。

在本发明的第二方面，提供了一种检测方法，包括步骤：

(a)提供一检测样本，所述检测样本选自血液样本；和

(b)检测所述检测样本中肝癌复发风险标志物基因的突变情况；

其中，所述的肝癌复发风险标志物基因为ADGRF2；

如果检测对象的肝癌复发风险检测结果满足以下条件时，则提示所述对象的肝癌复发风险高：

当所述标志物基因发生突变时，所述检测对象肝癌复发风险高。

在另一优选例中，所述肝癌复发风险标志物基因还包括选自组B的一种或多种标志物的基因：(B1)MUC16；(B2)FAT1。

在另一优选例中，所述肝癌复发风险标志物组合为：(A1)ADGRF2；(B1)MUC16；和(B2)FAT1。

在另一优选例中，所述的检测对象为人。

在另一优选例中，所述检测是针对离体样本的检测。

在另一优选例中，所述的检测方法是非诊断和非治疗性的。

在另一优选例中，所述的检测方法是体外方法。

在本发明的第三方面，提供了一种肝癌复发风险评估设备，所述设备包括：

(a)输入模块，所述输入模块用于输入某一检测对象血液中的肝癌复发风险标志物数据；

其中，所述的风险标志物包括ADGRF2基因；

(b)数据处理模块，所述数据处理模块用于处理肝癌复发风险标志物数据，并给出复发风险评估结果(或评估值)，其中，所述处理包括：对于输入的标志物，当标志物发生突变时，则提示该对象肝癌复发风险高；标志物未发生突变时，则提示该对象肝癌复发风险低；和

(c)输出模块，所述输出模块用于输出所述的评估结果。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明筛选出标志物基因的方法。

图2显示了肝癌肝移植术后监测验证组中突变较频繁的前23个基因。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次开发了一种高灵敏度和高特异性的移植术后肝癌复发监测的标志物组合。具体地，本发明人通过基因组和蛋白质组学研究，采用统计学方法，从中筛选出ADGRF2、MUC16和FAT1等3个特异性的基因标志物。经外周血水平检验证明，这3个基因标记物的突变与移植术后肝癌复发相关，可有效判肝癌肝移植术后肝癌复发情况，从而有助于对肝癌复发的患者尽早地进行对应的辅助治疗或干预治疗。在此基础上完成了本发明。

肝癌复发风险标志物

在本发明中，术语“本发明的肝癌复发风险标志物”、“本发明的复发风险标志物”、“本发明风险标志物”可互换使用，都指具有本发明的肝癌复发风险标志物ADGRF2。

此外，可与本发明的风险标志物ADGRF2联用的额外标志物包括(但并不限于)：MUC16、FAT1。

在本发明中，本发明的风险标志物包括基因(DNA)、cDNA、或其组合。

ADGRF2是黏附相关G蛋白偶联受体(Adhesion GPCRs)家族的成员，是细胞-细胞/细胞-基质间连接的重要组分，广泛参与胚胎发育，免疫反应，肿瘤发生等病理生理过程。其突变与纤毛活动障碍相关，但其突变体在HCC复发转移中的作用目前尚未被阐明。

MUC16是最大的跨膜粘蛋白，由于已知MUC16在卵巢癌细胞表面过表达并分裂/脱落到血液中，因此它是卵巢癌的一种公认的血清生物标记物。但其突变体在HCC复发转移中的作用目前尚未被阐明。

FAT1编码一种原钙粘附蛋白(protocadherin)，在许多人类癌症中非常频繁地发生突变，先前研究表明，FAT1突变与不良的临床抗肿瘤治疗结局相关，且在化学致癌物DMBA/TPA联合诱导的动物模型皮肤SCCs中，Fat1在大约20％的情况下发生突变。其中，无义突变非常常见，这提示了这些突变导致功能丧失(loss of function,LOF)。Blanpain等人在Nature发表的工作提示FAT1缺失会促进鳞状细胞癌EMT状态产生，表现出肿瘤干性及转移能力的增加，但同时，FAT1缺陷的肿瘤细胞对SRC抑制剂达沙替尼和塞卡替尼以及CAMK2抑制剂KN93更为敏感。但FAT1突变体在HCC复发转移中的作用目前尚未被阐明。

检测方法

基于肝癌复发风险标志物ADGRF2主要在血液、血浆中，本发明还提供了相应的诊断肝癌复发的方法。

本发明涉及定量和定位检测人肝癌复发风险标志物ADGRF2基因水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人肝癌复发风险标志物ADGRF2基因水平，可以用于诊断(包括辅助诊断)肝癌复发的风险。

本发明还提供基于ADGRF2与一种多种其他标志物(如MUC16和FAT1)进行联用，对肝癌复发进行诊断的方法。

肝癌复发风险标志物的多核苷酸可用于肝癌复发的诊断。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析单个核细胞中基因的差异表达分析和基因诊断。抗肝癌复发风险标志物的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样本中的肝癌复发风险标志物蛋白。

检测试剂盒

基于肝癌复发风险标志物与肝癌复发风险的相关性，因此肝癌复发风险标志物ADGRF2可以作为肝癌复发风险的诊断标志物。

本发明还提供基于ADGRF2与一种多种其他标志物(如MUC16和FAT1)进行联用，对肝癌复发进行诊断的检测试剂盒。

本发明还提供了一种诊断肝癌复发风险的试剂盒，所述的试剂盒含有一检测试剂，所述检测试剂用于检测肝癌复发风险标志物ADGRF2基因。优选地，所述试剂盒含有特异性扩增肝癌复发风险标志物ADGRF2的cfDNA/ctDNA的引物或引物对、探针或芯片。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于诊断肝癌复发风险。

评估设备

本发明提供了一种肝癌复发风险评估设备。代表性的设备包括：

(a)输入模块，所述输入模块用于输入某一检测对象血液中的肝癌复发风险标志物数据；

其中，所述的风险标志物包括ADGRF2基因；

(b)数据处理模块，所述数据处理模块用于处理肝癌复发风险标志物数据，并给出复发风险评估结果，其中，所述处理包括：对于输入的标志物，当标志物发生突变时，则提示该对象肝癌复发风险高；标志物未发生突变时，则提示该对象肝癌复发风险低；和

(c)输出模块，所述输出模块用于输出所述的评估结果。

当然，所述的肝癌复发风险评估设备还可以进一步评估一种多种其他标志物(如MUC16和FAT1)的数据，从而给出综合评估结果。

本发明的主要优点：

1.能够通过液体活检手段(即外周血cfDNA)无创检测是否存在微小残留病灶。

2.确定了肝移植术后复发肿瘤特异性的基因标志物，减少了cfDNA检测的范围，在不降低灵敏度的同时降低了检测成本。

3.本发明的捕获是针对特定位点的捕获，可以增加测序深度，提高该突变的检测敏感性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1

1.1实验对象

实验对象筛选自同时符合以下标准的患者：

(a)因肝细胞肝癌行肝移植术；

(b)初次肝移植术后因肝内复发肝细胞肝癌，行肝肿瘤切除术或肝段/肝叶切除术或二次肝移植术者；

(c)两次手术的肝癌组织样本均可获得者(组织保存生物样本库或蜡块保存于某院病理科)。

经筛选后得到共计44例原发肿瘤患者和47例移植后复发肿瘤患者。

1.2实验方法

如图1所示，将筛选得到的44例原发肿瘤新鲜组织和47例移植后复发肿瘤组织进行全外显子测序。

结果如表1所示，按照原发肿瘤和复发肿瘤中突变频率FDR(false discoveryrate)<0.1原则筛选出肝移植复发监测基因162个。合并肝癌常见驱动基因48个，共同构成最终复发监测panel(总计210基因)。

表1

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实施例2

肝癌肝移植复发检测

2.1待测样本血浆游离DNA的提取

通过以下步骤提取待测样本血浆游离DNA：

(1)用游离DNA保存管采集待测患者外周血10mL，4℃、1600g离心15min，收集上清1(置于低吸附离心管)。

(2)完成步骤1后，取所述上清1，12000rpm离心5min，收集上清2(置于低吸附离心管)。上清2即为血浆。

(3)完成步骤2后，将所有血浆用大体积游离核酸提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司的产品，货号为DP710)提取血浆游离DNA(cfDNA)。

2.2待测样本cfDNA文库的制备

获得步骤2.1的cfDNA，使用KAPA Hyper文库构建试剂盒，制备待测样本cfDNA文库。制备待测基因组DNA文库的接头为UMI接头。

取待测样本cfDNA基因组文库，进行Qubit定量和2％琼脂糖凝胶电泳检测。

2.3靶序列捕获文库的构建

(1)配制富集体系。富集体系为50μL，由16μL待测样本cfDNA文库、10μL富集缓冲液、5μL探针组和19μL杂交缓冲液(65℃预热)组成。

(2)完成步骤1后，取所述富集体系，置于PCR仪进行过夜杂交富集(杂交时间至少16h)，得到富集产物。

反应程序：95℃7min，65℃16h以上。

(3)链霉亲和素包被磁珠的溶液的获得(链霉亲和素包被磁珠在保存液中保存，进行这一步的目的为去除保存液)

1)取低吸附离心管，加入50μL M-280链霉亲和素磁珠，然后置于磁力架1min。

2)完成步骤1)后，弃上清，加入50μL文库结合缓冲液，重悬磁珠，然后短暂离心。

3)完成步骤2)后，取所述低吸附离心管，置于磁力架1min，弃上清，然后加入50μL文库结合缓冲液，重悬磁珠。

4)完成步骤3)后，取所述低吸附离心管，置于磁力架1min，弃上清，然后加入50μL文库结合缓冲液，重悬磁珠，得到链霉亲和素包被磁珠的溶液。

(4)共孵育捕获

1)完成步骤3后，取所述低吸附离心管，加入步骤2获得的全部的富集产物，涡旋震荡5sec，然后置于室温的旋转混匀仪上1h。

2)完成步骤1)后，取所述低吸附离心管，置于磁力架1min，弃上清。

(5)洗涤和PCR扩增

1)完成步骤4后，取所述低吸附离心管，加入500μL漂洗缓冲液1，混匀，置于旋转混匀仪旋转15min。

2)完成步骤1)后，取所述低吸附离心管，置于磁力架上静置2min，弃上清。

3)完成步骤2)后，取所述低吸附离心管，加入500μL漂洗缓冲液2(已65℃预热)，65℃孵育10min。

4)完成步骤3)后，取所述低吸附离心管，置于磁力架上静置2min，弃上清。

5)重复步骤4)两次。

进行上述步骤的目的为将没有与M-280链霉亲和素磁珠结合的探针洗掉。

6)完成步骤5)后，取所述低吸附离心管，加入30μL文库富集洗脱液，重悬磁珠，置于室温旋转混匀仪10-20min。

7)完成步骤6)后，取所述低吸附离心管，置于磁力架上静置1min。

8)完成步骤7)后，将上清转移至离心管，然后加入40μL中和缓冲液和30μLPCR反应液，移液器吸打混匀后置于PCR仪进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR程序：98℃30sec；98℃30sec，65℃30sec，72℃30sec，15个循环；72℃5min，4℃∞。

(6)纯化

完成步骤5后，取所述PCR扩增产物，利用AgencourtAMPure XP核酸纯化试剂盒(Beckman Coulter公司的产品，货号为A63881)纯化，得到文库扩增纯化产物。

2.4高通量测序及数据分析

(1)将步骤2.3得到的靶序列捕获文库通过Nextseq500、X Ten、NovaSeq等二代测序平台进行高通量测序，得到测序原始数据。

(2)数据质控

使用fastp(version：0.20.1)的-U参数去除特定长度和位置的UMI接头，使用--adapter_sequence参数去除防污染接头，删除低质量碱基和N碱基，生成clean reads。

(3)数据比对

使用BWA(version：0.7.17-r1188)mem模块将clean reads比对到人基因组hg19，生成bam文件。

使用samtools(version：0.1.19-44428cd)sort模块将比对结果以序列比对位置进行排序，构建索引，去除重复。

使用genecore(version：0.13.0)将sorted.bam中umi序列出现两次及以上的reads进行筛选，生成clone.bam并构建索引。参数为(-r<参考基因组序列>-b<目标区域bed文件>--umi_prefix UMI--supporting_reads 2)

使用bamdst(version：1.0.9)对得到的bam文件的深度、覆盖度、靶向捕获等质控指标进行统计。参数为(-p<目标区域bed文件>)

(4)变异检测及注释

使用GATK(version：4.0.11.0)的RealignerTargetCreator和IndelRealigner方法进行局部重比对，以减少全局比对算法对碱基错配和开gap的偏向性带来的误差。

使用GATK中的Mutect2模块进行变异检测，获取SNVs/Indels变异信息，将Mutect2的结果，利用软件ANNOVAR同时关联多个数据库(如dbSNP，1000g，ESP6500，HGMD，OMIM等)进行注释。

实施例3

肝癌肝移植复发检测的验证

为验证上述实施例1得到的基因panel在移植术后复发检测中的可行性和有效性，对肝癌肝移植术后明确诊断肿瘤复发的患者外周血cfDNA进行检测(液体活检)。

因此，本发明人通过盲法纳入16例复发患者作为验证组。检测验证组中各样本中的基因突变情况。

结果如图2所示和表2所示。图2显示了16例样本中各基因的变异情况，表2显示了本发明三个标志基因发生变异时的各变异位点。

结果表明本发明的三个标志物基因(ADGRF2、MUC16、FAT1)在验证组的突变率分别为50％、56.3％、31.3％。

表2

实施例4

肝癌肝移植复发监测探针设计

从UCSC数据库获取210个突变基因的外显子序列，并前后延伸50bp，延伸后不足50bp的扩展至50bp，提取每个区域的参考序列(参考基因组版本hg38)，去掉重复区域的序列，重复序列采用RepeatMask软件分析得到。

从第一个碱基开始截取78bp的序列做探针，再一次往后移动n个碱基，截取78bp的序列做探针，直到最后一个78bp。每个区域根据外显子的GC含量不同，n会有变化，GC含量太高或太低、n越小，探针设计越密集以达到捕获的均一性提高。

根据GC含量调整探针密度公式：

D_gc＝a+a*10*|gc-0.5|

其中：D_gc代表某GC含量的探针密度；

a代表GC含量为50％时候的探针密度，为20；

gc代表GC含量。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种肝癌复发风险标志物的基因、或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备一诊断试剂或试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒用于评估肝癌的复发风险；其中，所述的肝癌复发风险标志物包括(A1)ADGRF2。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肝癌复发风险标志物还包括选自下组B的一种或多种标志物的基因：(B1)MUC16；(B2)FAT1。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，当风险标志物ADGRF2基因发生突变时，则提示检测对象肝癌复发风险高。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肝癌复发风险标志物包括A1和B1至B3中一个或多个标志物所构成的组合。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肝癌复发风险标志物组合为：(A1)ADGRF2；(B1)MUC16；和(B2)FAT1。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒还包括标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于诊断肝癌的复发风险。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂或试剂盒包含与ADGRF2基因结合的基因探针。

8.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的检测对象选自下组：肝癌原发患者、肝癌复发患者。

9.一种检测方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供一检测样本，所述检测样本选自血液样本；和

(b)检测所述检测样本中肝癌复发风险标志物基因的突变情况；

其中，所述的肝癌复发风险标志物基因为ADGRF2；

如果检测对象的肝癌复发风险检测结果满足以下条件时，则提示所述对象的肝癌复发风险高：

当所述标志物基因发生突变时，所述检测对象肝癌复发风险高。

10.一种肝癌复发风险评估设备，其特征在于，所述设备包括：

(a)输入模块，所述输入模块用于输入某一检测对象血液中的肝癌复发风险标志物数据；

其中，所述的风险标志物包括ADGRF2基因；

(b)数据处理模块，所述数据处理模块用于处理肝癌复发风险标志物数据，并给出复发风险评估结果，其中，所述处理包括：对于输入的标志物，当标志物发生突变时，则提示该对象肝癌复发风险高；标志物未发生突变时，则提示该对象肝癌复发风险低；和

(c)输出模块，所述输出模块用于输出所述的评估结果。