CN101649320B - 重组人源hgf激活因子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域。肝细胞生长因子激活因子是一种肝细胞分泌的血浆蛋白，活化的HGFA是一条33Kd多肽，仅分布于受损的组织器官，可以在受损局部将肝脏非实质细胞分泌的单体肝细胞生长因子活化为HGF，在受损组织器官局部发挥细胞保护和组织修复作用。急、慢性肝功能衰竭以大面积肝细胞凋亡坏死、肝细胞再生功能抑制为主要病理特征。临床表现凶险，由于缺乏有效的救治手段，患者死亡率高达70-90％。本发明提供了一种重组人源性HGF激活因子，其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，可用于制备治疗急性或亚急性重症肝炎肝细胞坏死的药物中的应用。

Description

重组人源HGF激活因子及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种重组人源性HGF激活因子(rhHGFA)，及其rhHGFA在制备治疗急性或亚急性重症肝炎肝细胞坏死的药物中的应用。

背景技术

肝细胞生长因子激活因子(HGFA)是一种肝细胞分泌的血浆蛋白，GeneID：3083，活化的HGFA是一条33Kd多肽，仅分布于受损的组织器官，可以在受损局部将肝脏非实质细胞分泌的单体肝细胞生长因子(pro-HGF)活化为HGF，在受损组织器官局部发挥细胞保护和组织修复作用(参见文献Shia S，Stamos J，Kirchhofer D，et al.Conformational lability in serineprotease active sites：structures of hepatocyte growth factor activator(HGFA)alone and with the inhibitorydomain from HGFA inhibitor-1B.J Mol Biol.2005Mar 11；346(5)：1335-49.；Miyazawa K，Shimomura T and Kitamura N.Activation of hepatocyte growth factor in the injured tissues ismediated byhepatocyte growth factor activator.J Biol Chem 1996；271：3615-8.)。动物研究发现，HGFA基因敲除小鼠的炎性肠病模型中，动物的死亡率高达72％，而同期野生对照组的死亡率仅为25％(参见文献Itoh H，Naganuma S，Takeda N et al.Regeneration of injured intestinal mucosa is impaired inhepatocytegrowth factor activator-deficient mice.Gastroenterology 2004；127：1423-35.)，提示HGFA在pro-HGF活化、组织器官修复保护中发挥了至关重要的作用。

急、慢性肝功能衰竭以大面积肝细胞凋亡坏死、肝细胞再生功能抑制为主要病理特征。临床表现为重度黄疸、腹水、凝血障碍、肝性脑病，病势凶险，但内科只能采用保肝、对症处理治疗，由于缺乏有效的救治手段，患者死亡率高达70-90％。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组人源性HGF激活因子(rhHGFA)，本发明的另一目的是提供该rhHGFA在制备治疗急性或亚急性重症肝炎肝细胞坏死的药物中的应用。

在急性、亚急性重症肝炎病程中，坏死的肝细胞可以刺激肝脏非实质细胞分泌大量的肝细胞生长因子前体(pro-HGF)，因此患者血清中往往含有高值pro-HGF，特别是急性肝衰时，其血中含量可以达到正常值的10倍。pro-HGF只有被激活为HGF才能发挥其抗细胞坏死、凋亡，促进肝细胞再生的功能，体内80％的pro-HGF被肝细胞合成的HGFA激活。但在急性肝衰大面积肝细胞坏死或由于肝硬化等因素抑制肝细胞合成HGFA情况下，机体产生的pro-HGF无法有效地转型为HGF发挥其肝细胞保护和修复功能。因此本发明人推断补充体内减少的HGFA促进pro-HGF转型为HGF，就可以使肝脏利用其自身产生的HGF进行抗凋亡及再生修复，预防和阻止大面积肝细胞坏死造成的急性肝功能衰竭的发生及进展，为肝脏修复及进一步治疗创造条件。

由于HGFA成熟肽段在体内消除较快，加之基因重组蛋白本身在体内的稳定性较差，故本发明是在人源成熟肽段HGFA的基础上，与人免疫球蛋白IgG Fc片断重组成为融合蛋白(rhHGFA-Fc)增加在动物/人体内的蛋白稳定性，并将该融合蛋白应用于制备治疗急性或亚急性重症肝炎肝细胞坏死的药物。

本发明的具体技术方案是将HGFA成熟肽段基因(858bp，见SEQ IDNO：1)以及人免疫球蛋白(IgG)的Fc片断基因(693bp，见SEQ ID NO：2)。采用重叠延伸剪切技术经两次PCR获得重组基因片段HGFA-Fc(1575bp，见SEQ ID NO：3)。

本发明提供的一种重组人源性肝细胞生长因子激活因子，其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。核苷酸序列具体为：

atg+HGFA成熟肽段基因(SEQ ID NO：1)+中间接头序列(ggatccgcaggagtcgcaacc)+Fc片断基因(SEQ ID NO：2)。

上述核苷酸序列编码的氨基酸共计525aa，具体序列如下：MLTRVQLSPDLLATLPEPASPGRQACGRRHKKRTFLRPRIIGGSSSLPGSHPWLAAIYIGDSFCAGSLVHTCWVVSAAHCFSHSPPRDSVSVVLGQHFFNRTTDVTQTFGIEKYIPYTLYSVFNPSDHDLVLIRLKKKGDRCATRSQFVQPICLPEPGSTFPAGHKCQIAGWGHLDENVSGYSSSLREALVPLVADHKCSSPEVYGADISPNMLCAGYFDCKSDACQGDSGGPLACEKNGVAYLYGIISWGDGCGRLHKPGVYTRVANYVDWINDRIRPPRRLVAPSGSAGVATPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

上述氨基酸序列中：划线部分为中间接头序列，划线之前部分为HGFA序列，划线之后部分为Fc序列，见SEQ ID NO：3或4。

本发明将HGFA-Fc基因片段连接到pMD19-T载体上，构建pMD18-HGFA-Fc载体。PCR法筛选阳性克隆，并进行阳性克隆的DNA测序。随后，将HGFA-Fc克隆到pcDNA3.1表达载体上，转化Eco.li Top 10菌株，进行重组质粒制备、纯化，并转染人肾细胞293株进行重组融合蛋白(rhHGFA-Fc)表达。重组蛋白经SDS-PAGE电泳确定其分子量为63Kd，分别采用抗HGFA和抗人IgG Fc抗体证实rhHGFA-Fc重组蛋白的特异性。

经体外试验发现，该重组蛋白可以激活人源pro-HGF单体成为具有生物学活性的HGF二聚体(HGF)，半数激活浓度(IC₅₀)为20nM。

本研究构建的真核细胞表达载体，将HGFA活性区域和人免疫球蛋白IgG铰链区融合表达，理论上HGFA-Fc既具有肝细胞生长因子激活因子的功能，又可以通过Fc片段增强融合蛋白的稳定性。将纯化的HGFA-Fc融合蛋白与pro-HGF温育反应，用HGF多克隆抗体Western blot检测显示pro-HGF被酶解为α链和β链，且随着HGFA-Fc浓度增加酶切活性增强，HGFA-Fc的酶切活性呈剂量依赖效应。显示重组表达的HGFA-Fc具有较强的激活pro-HGF功能。HAI-1是HGFA特异性抑制因子，因此将纯化的HGFA-Fc与pro-HGF、HAI-1共同温育反应，会抑制HGFA-Fc的酶切活性。HGF多克隆抗体Western blot检测表明当HAI-1反应浓度为2uM以上时，HGFA-Fc的酶切活性被很好的抑制，从另外一个侧面证实融合HGFA-Fc具有较强的生物学特异性。

经rhHGFA-Fc激活的HGF在体外试验中显示出显著的肝细胞凋亡抑制作用(4.8％vs.25.1％)；在动物肝纤维化肝细胞损伤模型中，rhHGFA-Fc治疗组可以明显减少肝细胞凋亡。因此，rhHGFA-Fc重组蛋白可以作为急性、亚急性重症肝炎肝细胞凋亡坏死的治疗药物。

附图说明

图1是表达载体pcDNA3.1-HGFA-Fc的酶切鉴定结果

其中M为DL 2000DNA分子量标记；1为pcDNA3.1(+)用Xho I/HindIII双酶切；2、3为pcDNA3.1-HGFA-Fc用Xho I/Hind III双酶切。图2是10％SDS-PAGE鉴定rhHGFA-Fc重组蛋白的分子量结果

其中1为从转染pcDNA3.1-HGFA-Fc质粒的293细胞总蛋白中纯化的rHGFA-Fc重组融合蛋白；2为转染pcDNA3.1(+)空白质粒的293细胞蛋白纯化产物。

图3是rhHGFA-Fc重组蛋白western blot鉴定结果

其中M为预染蛋白质分子量标记；1、2为从转染pcDNA3.1-HGFA-Fc质粒的293细胞总蛋白中纯化的rHGFA-Fc重组融合蛋白；3为转染pcDNA3.1(+)空白质粒的293细胞蛋白纯化产物。

图4是Western Blot检测HGFA-Fc的酶切活性结果

其中0为零反应时间的样品；ctrl为未加入HGFA-Fc的样品；1～6为HGFA-Fc浓度梯度4.8ug/ml～0.15ug/ml。

图5是HAI-1抑制HGFA-Fc激活pro-HGF的试验结果。

其中0表示终浓度为50ug/ml的pro-HGF溶液；ctrl：50ug/ml的pro-HGF溶液中加入终浓度为2.4ug/ml的HGFA-Fc；1：在ctrl反应体系中加入0.5uMHAI-1；2：在ctrl反应体系中加入2uM HAI-1；3：在ctrl反应体系中加入8uM HAI-1。

图6是流式细胞术实验检测rhHGFA-Fc蛋白介导的肝细胞凋亡抑制作用结果

其中A为空白细胞对照组；B为单独加入pro-HGF组；C为加入HGFA-Fc和pro-HGF实验组。

图7是HGFA-Fc融合蛋白抗动物肝细胞凋亡的实验结果。

其中A为对照组，B为实验组凋亡细胞免疫组化结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细说明，但本发明的实施并不仅于此。

材料与主要试剂：

1.细胞株、菌种和质粒：293细胞购自上海麦沙生物科技有限公司、大肠杆菌DH5α购自北京天根生化科技公司，pMD18-T购自TakaRa公司，pcDNA3.1购自Invitrogen公司。

2.试剂：抗人HGFA单抗、抗人HGF单抗购自R&D公司；抗His单抗购自Chemicon公司；抗人Fc单抗购自Sigma公司；pro-HGF蛋白制品和Recombinant Human HAI-1购自R&D公司；Lipofectamine 2000、FB S和DMEM为Invitrogen公司产品；Ni²⁺层析树脂购自Qiagen公司；PVDF硝酸纤维素膜和Ap显色试剂盒购自Bio-Rad公司；丙烯酰胺、双丙烯酰胺和TEMED购自Sigma公司；9cm细胞培养皿购自Corning公司；Xho I和HindIII内切酶为TakaRa公司产品；细胞凋亡检测试剂盒购自Roche公司；其它试剂均为分析纯试剂。

实施例1：重组人源HGFA-Fc融合蛋白的制备

用RT-PCR从肝组织cDNA文库钓取HGFA活性区域DNA片段(GeneID：3083，1104bp～1962bp)大小为858bp，通过Overlap重叠PCR(参见曹阳等，《河北医药》2005第27卷第11期)与人免疫球蛋白Fc(GeneID：2209)693bp片段融合，获得1575bp HGFA-Fc片段，Xho I/Hind III双酶切克隆到pcDNA3.1(+)载体。酶切鉴定正确后大量抽提、纯化、测定浓度后备用。具体步骤如下：

一、重组质粒pcDNA3.1-HGFA-Fc的构建：

1.扩增HGFA-Fc嵌合基因的引物合成

根据基因文库确定人源HGFA基因(ID：3083)，设计引物扩增其中人源HGFA基因1102bp～1965bp范围，相应的氨基酸起止序列为：368-655。

Up5’：GCAGCTTCTCACCAGAGTCCAACTGT3’

中间引物

Mup：ggagggagccacaagaaaactcacacatgc

Mdown：cctccctcggtgttcttttgagtgtgtacg

Down 5’-ATCTCGAGTATTATCATTTACCCGGA-3’

2.RNA提取和检测

取人的新鲜肝组织(可以是血管瘤的肝切标本)50-100mg，采用Invitrogen Fast Track Kit(Invitrogen公司)提取RNA，采用1.0％-1.5％甲醛变性Agarose胶电泳，检测RNA质量。

3.RT-PCR扩增目的基因

3.1采用TaKaRa RT-PCR试剂盒合成cDNA文库，反应结束后于95℃加热5min使逆转录酶失活。

3.2PCR扩增靶基因片断

采用重叠延伸剪切技术经两次PCR获得嵌合基因片段HGFA-Fc。

(1)第一次PCR扩增：用引物Up与中间引物Mup，以cDNA为摸板扩增HGFA成熟肽858bp，以Mdown、Down为引物，以含有人Fc片段基因的pCMVsFc质粒(pCMVsFc质粒由休斯顿Baylor大学医学院细胞和基因治疗中心副教授陈思毅博士惠赠)为摸板扩增。

(2)第二次PCR扩增：分别以第一次PCR产物为摸板，以引物Up，Mdown为引物扩增嵌合基因片段HGFA-Fc片段。

4.pMD18-HGFA-Fc载体的构建及测序

4.1采用Takara T4DNA ligase于16度连接过夜，将HGFA-Fc嵌合片段连接到pMD19-T载体上，构建pMD18-HGFA-Fc载体。

4.2将连接液涂布于氨苄抗性LB固体培养基平板，置于37度培养12-16h。

4.3挑取转化子用PCR法鉴定，阳性克隆会有1576bp大小片断扩增出；鉴定后再挑取同一菌斑置于液体LB培养基过夜，收集菌液并抽取质粒，即为pMD18-HGFA-Fc。

4.4重组质粒酶切鉴定：用Takara Xho I/Hind III双酶切，阳性克隆会有1576bp大小片断被切下；阴性克隆无此片断放出。

4.5将阳性克隆进行DNA测序(上海生工生物工程技术公司测序)，确定其没有碱基突变或者碱基缺失。测序结果，如SEQ ID NO：3所示。

5.真核表达载体pcDNA3.1-HGFA-Fc的构建及鉴定

将HGFA-Fc克隆到pcDNA3.1表达载体上：采用Takara Xho I/Hind III双酶切，Qiagen Gel Extraction kit(Qiagen公司)割胶回收，Takara T4DNAligase连接，连接液涂布于氨苄抗性LB固体培养基平板，PCR法筛选阳性重组子并酶切鉴定。

构建的表达载体pcDNA3.1-HGFA-Fc酶切鉴定结果见图1。Xho I/HindIII双酶切可获得1.6kb DNA片段，表明1575bp HGFA-Fc片段已经克隆进入pcDNA3.1(+)载体。

6.真核表达载体pcDNA3.1-HGFA-Fc制备

将pcDNA3.1-HGFA-Fc质粒转化Eco.li Top 10，接种于10ml试管培养过夜，再转接于500ml三角摇瓶中，37度培养8h，收集菌液。采用QiagenEndoFree Plasmid Maxi Kit(Qiagen公司)纯化pcDNA3.1-HGFA-Fc，去除内毒素等杂质，用于下步细胞转染实验。

二、细胞转染：

人肾293细胞培养于含10％FBS胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养液中，置于37℃、5％CO₂，饱和湿度的培养箱中培养。将上述构建好的pcDNA3.1-HGFA-Fc和pcDNA3.1(+)空载体按照Lipofectamine 2000试剂说明转染293细胞。

三、HGFA-Fc表达产物的纯化：

转染后细胞培养36h，待细胞密度为80％～90％时用预冷的PBS洗两次，细胞刮刀收集细胞，4℃离心5min，冰浴下于RIPA缓冲液(50mMTris.HCl，pH7.4，1％NP-40，0.25％脱氧胆酸钠，150mM NaCl，1mM EDTA，0.5％蛋白酶抑制剂Cocktail)中裂解，4℃12000g离心15min，收集上清液。上清液上样于平衡好的Ni²⁺柱，用含有100mM咪唑的缓冲液洗脱收集目的蛋白质，将纯化好的HGFA-Fc融合蛋白在20mM Hepes pH7.5、150mMNaCl、5mM CaCl₂中4℃透析过夜，分装成小份用于Western blot检测、酶活性以及抗肝细胞凋亡测定。

四、HGFA-Fc表达产物免疫学活性的鉴定：

BCA蛋白定量试剂盒(购自上海业力生物科技公司)进行蛋白浓度测定，取20ug总蛋白上样于10％SDS-PAGE，湿法在110mA恒流条件将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜。将膜在PBST(含0.1％Tween 20的PBS)5％脱脂奶粉中4℃封闭过夜，室温一抗结合1.5h，用PBST洗膜三次，每次10min，室温二抗结合1h，再用PBST洗膜三次，每次10min，加入Ap显色试剂盒反应1～3min。

将pcDNA3.1-HGFA-Fc转染人的293细胞，继续培养36h，收集细胞提取总蛋白。经Ni²⁺柱层析法纯化重组HGFA-Fc片段，纯化蛋白产物经10％SDS-PAGE电泳鉴定，主要在62kD处显单一蛋白条带，见图2。

上述纯化蛋白用Western blot法(WB)鉴定HGFA-Fc的特异表达。结果显示，从转染了pcDNA3.1-HGFA-Fc质粒的293细胞中提取的蛋白，经蛋白纯化后，其62kD的重组蛋白可以与抗人HGFA抗体及抗人IgG抗体发生特异性反应，而转染pcDNA3.1(+)空白载体的细胞中无rhHGFA-Fc重组蛋白表达，见图3。

实施例2：rhHGFA-Fc重组融合蛋白的酶切活性及抗肝细胞凋亡作用

一、HGFA-Fc激活pro-HGF酶活性的检测：

在终浓度为50ug/ml的pro-HGF反应缓冲液中，分别加入HGFA-Fc浓度梯度为0.15ug/ml，0.3ug/ml，0.6ug/ml，0.12ug/ml，0.24ug/ml，4.8ug/ml，反应1h后Western blot检测各反应体系中proHGF(92kD)和HGF(62kD)表达情况。结果显示，rhHGFA-Fc重组蛋白可以将pro-HGF酶切为α链和β链，且酶活性随rhHGFA-Fc浓度增加而增强，结果见图4。经计算，该重组蛋白的IC50酶活性值为20nM。

在浓度为50ug/ml的pro-HGF溶液中，加入终浓度为2.4ug/ml的HGFA-Fc融合蛋白，和终浓度分别为0.5uM、2uM和8uM的HAI-1共同孵育1h。Western blot检测显示2uM以上的HAI-1可以完全抑制HGFA-Fc的酶切活性，进一步证实融合HGFA-Fc具有较强的生物学特异性。见图5。

二、HGFA-Fc蛋白介导的抗肝细胞凋亡：

人源肝细胞株HL-7702(来源于美国ATCC，购自上海中科院细胞所)培养至对数生长期，按照5×10⁵个/孔接种6孔细胞培养板。37℃、5％CO₂，恒温培养箱中培养24h后，实验组加入终浓度2.4ug/ml的HGFA-Fc、50ug/ml的pro-HGF；阴性对照组只加入50ug/ml的pro-HGF；空白对照组不加入任何蛋白制品。继续培养12h，实验组和阴性对照组分别加入终浓度60uM的顺铂，培养24h收集细胞，固定并进行Annexin V/PI双染色，进行流式细胞术检测细胞凋亡情况。

流式细胞术实验显示，实验组的细胞早期凋亡率4.8％(Annexin V+/PI-)，阴性对照组细胞早期凋亡率为25.1％，空白对照组细胞早期凋亡率3.3％。表明rhHGFA-Fc通过激活pro-HGF为HGF，发挥其抗肝细胞凋亡作用见图6。

四氯化碳诱导小鼠肝纤维化肝损模型(5％四氯化碳/橄榄油(v/v)，3次/周灌胃，共8周，剂量为20ml/kg体重)，模型鼠随机分为对照组(尾静脉注射0.5ml生理盐水，1次/天，共7天)和实验组(尾静脉注射0.2ug/0.5mlHGFA-Fc蛋白，1次/天，共7天)，一周后处死小鼠取全血和肝脏。肝组织浸泡于福尔马林液中，制备石蜡切片进行细胞凋亡的免疫组化检测(TUNEL试剂盒购于美国Chemicon公司)DAB显色。结果显示rhHGFA-Fc治疗组肝细胞凋亡明显少于对照组，表明rhHGFA-Fc可以介导抗肝细胞凋亡作用见图7。

SEQUENCE LISTING

<110>上海交通大学医学院附属仁济医院

<120>重组人源HGF激活因子及其应用

<130>说明书，权利要求书

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>858

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ctcaccagag tccaactgtc accggatctc ctggcgaccc tgcctgagcc agcctccccg    60

gggcgccagg cctgcggcag gaggcacaag aagaggacgt tcctgcggcc acgtatcatc    120

ggcggctcct cctcgctgcc cggctcgcac ccctggctgg ccgccatcta catcggggac    180

agcttctgcg ccgggagcct ggtccacacc tgctgggtgg tgtcggccgc ccactgcttc    240

tcccacagcc cccccaggga cagcgtctcc gtggtgctgg gccagcactt cttcaaccgc    300

acgacggacg tgacgcagac cttcggcatc gagaagtaca tcccgtacac cctgtactcg    360

gtgttcaacc ccagcgacca cgacctcgtc ctgatccggc tgaagaagaa aggggaccgc    420

tgtgccacac gctcgcagtt cgtgcagccc atctgcctgc ccgagcccgg cagcaccttc    480

cccgcaggac acaagtgcca gattgcgggc tggggccact tggatgagaa cgtgagcggc    540

tactccagct ccctgcggga ggccctggtc cccctggtcg ccgaccacaa gtgcagcagc    600

cctgaggtct acggcgccga catcagcccc aacatgctct gtgccggcta cttcgactgc    660

aagtccgacg cctgccaggg ggactcaggg gggcccctgg cctgcgagaa gaacggcgtg    720

gcttacctct acggcatcat cagctggggt gacggctgcg ggcggctcca caagccgggg    780

gtctacaccc gcgtggccaa ctatgtggac tggatcaacg accggatacg gcctcccagg    840

cggcttgtgg  ctccctcc                                                 858

<210>2

<211>693

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg    60

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc    120

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac    180

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac    240

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc    300

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc    360

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat    420

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac    480

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc    540

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg    600

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac    660

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa                                 693

<210>3

<211>1575

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1575)

<223>

<400>3

atg ctc acc aga gtc caa ctg tca ccg gat ctc ctg gcg acc ctg cct    48

Met Leu Thr Arg Val Gln Leu Ser Pro Asp Leu Leu Ala Thr Leu Pro

1               5                   10                  15

gag cca gcc tcc ccg ggg cgc cag gcc tgc ggc agg agg cac aag aag    96

Glu Pro Ala Ser Pro Gly Arg Gln Ala Cys Gly Arg Arg His Lys Lys

            20                  25                  30

agg acg ttc ctg cgg cca cgt atc atc ggc ggc tcc tcc tcg ctg ccc    144

Arg Thr Phe Leu Arg Pro Arg Ile Ile Gly Gly Ser Ser Ser Leu Pro

        35                  40                  45

ggc tcg cac ccc tgg ctg gcc gcc atc tac atc ggg gac agc ttc tgc    192

Gly Ser His Pro Trp Leu Ala Ala Ile Tyr Ile Gly Asp Ser Phe Cys

    50                  55                  60

gcc ggg agc ctg gtc cac acc tgc tgg gtg gtg tcg gcc gcc cac tgc    240

Ala Gly Ser Leu Val His Thr Cys Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys

65                  70                  75                  80

ttc tcc cac agc ccc ccc agg gac agc gtc tcc gtg gtg ctg ggc cag    288

Phe Ser His Ser Pro Pro Arg Asp Ser Val Ser Val Val Leu Gly Gln

                85                  90                  95

cac ttc ttc aac cgc acg acg gac gtg acg cag acc ttc ggc atc gag    336

His Phe Phe Asn Arg Thr Thr Asp Val Thr Gln Thr Phe Gly Ile Glu

            100                 105                 110

aag tac atc ccg tac acc ctg tac tcg gtg ttc aac ccc agc gac cac    384

Lys Tyr Ile Pro Tyr Thr Leu Tyr Ser Val Phe Asn Pro Ser Asp His

        115                 120                 125

gac ctc gtc ctg atc cgg ctg aag aag aaa ggg gac cgc tgt gcc aca    432

Asp Leu Val Leu Ile Arg Leu Lys Lys Lys Gly Asp Arg Cys Ala Thr

    130                 135                 140

cgc tcg cag ttc gtg cag ccc atc tgc ctg ccc gag ccc ggc agc acc    480

Arg Ser Gln Phe Val Gln Pro Ile Cys Leu Pro Glu Pro Gly Ser Thr

145                 150                 155                 160

ttc ccc gca gga cac aag tgc cag att gcg ggc tgg ggc cac ttg gat    528

Phe Pro Ala Gly His Lys Cys Gln Ile Ala Gly Trp Gly His Leu Asp

                165                 170                 175

gag aac gtg agc ggc tac tcc agc tcc ctg cgg gag gcc ctg gtc ccc    576

Glu Asn Val Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Leu Arg Glu Ala Leu Val Pro

            180                 185                 190

ctg gtc gcc gac cac aag tgc agc agc cct gag gtc tac ggc gcc gac    624

Leu Val Ala Asp His Lys Cys Ser Ser Pro Glu Val Tyr Gly Ala Asp

        195                 200                 205

atc agc ccc aac atg ctc tgt gcc ggc tac ttc gac tgc aag tcc gac    672

Ile Ser Pro Asn Met Leu Cys Ala Gly Tyr Phe Asp Cys Lys Ser Asp

    210                 215                 220

gcc tgc cag ggg gac tca ggg ggg ccc ctg gcc tgc gag aag aac ggc    720

Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Glu Lys Asn Gly

225                 230                 235                 240

gtg gct tac ctc tac ggc atc atc agc tgg ggt gac ggc tgc ggg cgg    768

Val Ala Tyr Leu Tyr Gly Ile Ile Ser Trp Gly Asp Gly Cys Gly Arg

                245                 250                 255

ctc cac aag ccg ggg gtc tac acc cgc gtg gcc aac tat gtg gac tgg    816

Leu His Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ala Asn Tyr Val Asp Trp

            260                 265                 270

atc aac gac cgg ata cgg cct ccc agg cgg ctt gtg gct ccc tcc gga    864

Ile Asn Asp Arg Ile Arg Pro Pro Arg Arg Leu Val Ala Pro Ser Gly

        275                 280                 285

tcc gca gga gtc gca acc ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc    912

Ser Ala Gly Val Ala Thr Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

    290                 295                 300

cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc    960

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

305                 310                 315                 320

ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag    1008

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

                325                 330                 335

gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag    1056

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

            340                 345                 350

ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag    1104

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

        355                 360                 365

ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc    1152

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

    370                 375                 380

acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag    1200

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

385                 390                 395                 400

gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa    1248

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

                405                 410                 415

gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc    1296

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

            420                 425                 430

cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa    1344

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

        435                 440                 445

ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag    1392

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

    450                 455                 460

ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc    1440

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

465                 470                 475                 480

tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag    1488

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

                485                 490                 495

cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac    1536

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

            500                 505                 510

cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa                1575

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

        515                 520                 525

<210>4

<211>525

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Met Leu Thr Arg Val Gln Leu Ser Pro Asp Leu Leu Ala Thr Leu Pro

1               5                   10                  15

Glu Pro Ala Ser Pro Gly Arg Gln Ala Cys Gly Arg Arg His Lys Lys

            20                  25                  30

Arg Thr Phe Leu Arg Pro Arg Ile Ile Gly Gly Ser Ser Ser Leu Pro

        35                  40                  45

Gly Ser His Pro Trp Leu Ala Ala Ile Tyr Ile Gly Asp Ser Phe Cys

    50                  55                  60

Ala Gly Ser Leu Val His Thr Cys Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys

65                  70                  75                  80

Phe Ser His Ser Pro Pro Arg Asp Ser Val Ser Val Val Leu Gly Gln

                85                  90                  95

His Phe Phe Asn Arg Thr Thr Asp Val Thr Gln Thr Phe Gly Ile Glu

            100                 105                 110

Lys Tyr Ile Pro Tyr Thr Leu Tyr Ser Val Phe Asn Pro Ser Asp His

        115                 120                 125

Asp Leu Val Leu Ile Arg Leu Lys Lys Lys Gly Asp Arg Cys Ala Thr

    130                 135                 140

Arg Ser Gln Phe Val Gln Pro Ile Cys Leu Pro Glu Pro Gly Ser Thr

145                 150                 155                 160

Phe Pro Ala Gly His Lys Cys Gln Ile Ala Gly Trp Gly His Leu Asp

               165                 170                 175

Glu Asn Val Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Leu Arg Glu Ala Leu Val Pro

           180                 185                 190

Leu Val Ala Asp His Lys Cys Ser Ser Pro Glu Val Tyr Gly Ala Asp

        195                 200                 205

Ile Ser Pro Asn Met Leu Cys Ala Gly Tyr Phe Asp Cys Lys Ser Asp

    210                 215                 220

Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Glu Lys Asn Gly

225                 230                 235                 240

Val Ala Tyr Leu Tyr Gly Ile Ile Ser Trp Gly Asp Gly Cys Gly Arg

                245                 250                 255

Leu His Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ala Asn Tyr Val Asp Trp

            260                 265                 270

Ile Asn Asp Arg Ile Arg Pro Pro Arg Arg Leu Val Ala Pro Ser Gly

        275                 280                 285

Ser Ala Gly Val Ala Thr Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

    290                 295                 300

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

305                 310                 315                 320

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

                325                 330                 335

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

            340                 345                 350

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

        355                 360                 365

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

    370                 375                 380

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

385                 390                 395                 400

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

                405                 410                 415

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val  Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

            420                 425                 430

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

        435                 440                 445

Gly Phe Tyr Pro Ser AspIle Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

    450                 455                 460

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

465                 470                 475                 480

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

                485                 490                 495

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

            500                 505                 510

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

        515                 520                 525

Claims (2)

1.一种重组人源性肝细胞生长因子激活因子，其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.一种如权利要求1所述的重组人源性肝细胞生长因子激活因子在制备抗肝细胞凋亡药物中的应用。

Images