CN105891511A - 用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针及试剂盒。本发明用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针含有荧光染料A、CD45、细胞角蛋白和ANCA，所述细胞角蛋白与CD45、ANCA带有不同颜色的荧光染料B；本发明用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的试剂盒含有所述探针。本发明采用荧光染料A、CD45、细胞角蛋白和ANCA染CTC，可以区分循环肿瘤细胞和中性粒细胞，精确鉴定肺癌患者外周血中循环肿瘤细胞的数目，准确预测肺癌患者复发和转移的可能性。
Description
技术领域
本发明涉及一种探针及试剂盒，具体涉及一种用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针及试剂盒。
背景技术
肺癌已成为当前世界各国常见的恶性肿瘤，国内外公认肺癌的“两个第一”，即“发病率第一”、“死亡率第一”。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位，成为对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤。复发和远处转移已成为肺癌患者致死的主要原因，通过监测外周血CTC的变化可以早期评估肺癌患者远处转移或者复发的发生情况。
部分原发肿瘤细胞经历上皮间质转化等过程获得高侵袭性，从原发组织脱落，侵入周围基质并进入血液循环，成为CTCs。大多数CTCs被机体免疫系统杀死，只有极少数转移倾向极高的CTCs存活下来，并可相互聚集形成循环肿瘤微栓(circulating tumor microemboli,CTM)。幸存的CTCs或CTM离开血液循环，进入到继发脏器的局部微环境，进而逃避宿主的局部非特异免疫杀伤作用，在各类生长因子的作用下增殖生长并最终形成转移灶。这一转移过程多发生在肿瘤进展的晚期。肿瘤远处转移很可能在肿瘤发展早期就已经出现，因此CTCs检测具有重要的临床意义。
由于CTCs在外周血中每106～107个单核细胞中才发现1个CTC，因此对CTC检测技术的灵敏度和特异度均提出了极高要求。目前各种CTC的检测体系主要包括CTC分离和富集系统以及CTC检测和鉴定系统:1).免疫磁性分离法,免疫磁性分离技术是目前最常用的CTC分离和富集技术。其原理是基于CTC主要表达上皮源性表面标志，利用抗原抗体方法分离和富集CTC，具体分为阳性富集方法和阴性富集方法。前者通过磁珠偶联上皮细胞黏附分子EpCAM和细胞角蛋白CKs等标志直接富集外周血中上皮来源的稀有细胞。后者通过磁珠偶联CD45等白细胞标志，去除外周血白细胞而间接富集稀有上皮细胞。2).基于形态学的富集法，密度梯度离心法和膜滤过分离法(ISET)是目前常用的2种基于形态学富集CTC的方法。前者根据CTC密度低于其他血细胞，后者根据CTC直径大于其他血细胞，通过离心或滤膜过滤法将CTC分离开来。总体来说，基于形态学的富集方法操作简便，价格低廉，分离后CTC仍保留活力；缺点是缺乏特异性，与肿瘤细胞密度相当，或直径更小的一部分血细胞存在被漏检的可能。
CTC的检测和鉴定方法众多，根据原理可分为细胞计数法和核酸检测法。前者主要包括各种免疫细胞化学技术和流式细胞术等，后者主要包括聚合酶链反应和逆转录聚合酶链反应及其各种改进的技术等。免疫细胞化学技术(immunocytochemistry,ICC)是在细胞富集的基础上，针对肿瘤细胞特异的蛋白或基因进行原位检测，并对筛选后的细胞完成鉴定。ICC的优点是可进行细胞大小和形态学的分析，缺点是敏感性低，只能从(1～10)×105个细胞中发现1个CTC。现有技术采用免疫细胞化学技术检测CTC是利用Ep-CAM标记磁珠对上皮细胞进行富集，细胞经固定后用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染料标记细胞核，CD45荧光抗体和CK8、CK18、CK19或CKmix荧光抗体标记细胞，在四色荧光显微镜下进行结果分析，将DAPI、CD45-、CK+和Ep-CAM+的细胞定义为CTC。
但，现有的技术平台下鉴定CTC存在不足之处，主要是把血液中大量存在的中性粒细胞误认为是CTC，其原因为：1)中性粒细胞数量较多,其很容易被非特异性的捕获；2).中性粒细胞表达非常弱的CD45,同时与CK有非特异性的窜染现象；3).中性粒细胞的数量与肿瘤进展呈正相关，在有转移的肺癌患者中,外周血中性粒细胞显著增多，干扰CTC的捕获和染色。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能区分循环肿瘤细胞和中性粒细胞的探针及试剂盒。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针，其含有荧光染料A、CD45、细胞角蛋白和ANCA，所述细胞角蛋白与CD45、ANCA带有不同颜色的荧光染料B。
上述用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针中，CD45、细胞角蛋白和ANCA均标记有荧光染料(该荧光染料不同于荧光染料A)，标记细胞角蛋白的荧光染料与标记CD45的荧光染料发光颜色不同，且标记细胞角蛋白的荧光染料与标记ANCA的荧光染料发光颜色也不同。
本发明采用荧光染料A、CD45、细胞角蛋白和ANCA染CTC(循环肿瘤细胞)，以此鉴定循环肿瘤细胞和中性粒细胞。DAPI+/CD45-/CK+/ANCA-的细胞为CTC，而DAPI+/CD45+/CK-/ANCA+、DAPI+/CD45-/CK+/ANCA+、DAPI+/CD45+/CK+/ANCA+或DAPI+/CD45-/CK-/ANCA+的细胞为非CTC(其中，“+”表示阳性，“-”表示阴性)。
采用本发明的探针可以区分循环肿瘤细胞和中性粒细胞，精确鉴定肺癌患者外周血中循环肿瘤细胞的数目，准确预测肺癌患者复发和转移的可能性。
作为本发明所述用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针的优选实施方式，所述荧光染料A为DAPI。
作为本发明所述用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针的优选实施方式，所述细胞角蛋白为CK8、CK18、CK19或CKmix。作为本发明所述用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针的更优选实施方式，所述CKmix包含Pan-CK、CK5/6、CK7和CK20。
作为本发明所述用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针的优选实施方式，所述CD45和ANCA带有红色荧光标记，所述细胞角蛋白带有绿色荧光标记。
作为本发明所述用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针的优选实施方式，所述CD45和ANCA标记有罗丹明，所述细胞角蛋白标记有异硫氰酸荧光素。
另外，本发明还提供了一种含有如上所述探针的用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的试剂盒。
作为本发明所述用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还含有细胞洗涤液、PBS和密度梯度分离液。更优选地，所述细胞洗涤液为含有5％FBS的RPMI培养基。
作为本发明所述用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还含有固定液、Triton X-100和羊血清。
本发明试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)采取血液样本，用PBS进行稀释；
(2)将密度梯度分离液加至分离管中，离心，再向分离管中加入经稀释的血液样本，离心，得到的离心液中第二层即为PBMC/CTC层；
(3)用细胞洗涤液洗涤PBMC/CTC层，离心，除去上清，得到细胞悬液；
(4)采用免疫荧光染色检测步骤(3)所得的细胞悬液。
本发明的有益效果为：本发明采用荧光染料A、CD45、细胞角蛋白和ANCA染CTC，可以区分循环肿瘤细胞和中性粒细胞，精确鉴定肺癌患者外周血中循环肿瘤细胞的数目，准确预测肺癌患者复发和转移的可能性。
附图说明
图1为本发明所述循环肿瘤细胞的富集流程图；
图2为本发明采用免疫荧光染色鉴定循环肿瘤细胞和中性粒细胞的结果图；
图3为对比例1采用免疫荧光染色鉴定循环肿瘤细胞和中性粒细胞的结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
循环肿瘤细胞：(Circulation Tumor Cell,CTC))来源于原发肿瘤或转移肿瘤，获得脱离基底膜的能力并入侵通过组织基质进入血管的肿瘤细胞。目前CTC是指存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。
中性粒细胞:是在瑞氏(Wright)染色血涂片中，胞质呈无色或极浅的淡红色，有许多弥散分布的细小的(0.2～0.4微米)浅红或浅紫色的特有颗粒。细胞核呈杆状或2～5分叶状，叶与叶间有细丝相连。中性粒细胞具趋化作用、吞噬作用和杀菌作用。中性粒细胞来源于骨髓，具有分叶形或杆状的核，胞浆内含有大量既不嗜碱也不嗜酸的中性细颗粒。这些颗粒多是溶酶体，内含髓过氧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶和酸性水解酶等丰富的酶类，与细胞的吞噬和消化功能有关。
ANCA:抗中性粒细胞胞浆抗体；
DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚；
FITC：异硫氰酸荧光素；
PE：藻红蛋白；
PBS：磷酸缓冲盐溶液；
FBS：胎牛血清；
EpCAM：上皮细胞黏附分子；
PBMC:外周血单个核细胞；
GSS：密度梯度分离液；
WM：细胞洗涤液；
FM：细胞冻存液用培养基。
实施例中所有试剂与材料必须是分子级别并经过严格无菌过滤，具体的试剂与材料如下：
1)一次性使用人体静脉血样采集容器，品牌：BD VacutainerTM(BD Medical,Fisher CAT#02-684-26)；
2)PBS(Sigma#P-5368)，其不含钙离子和镁离子，PBS的成分应是分子生物学级别的并经过严格无菌过滤，室温保存；
3)Washing Medium(WM)(RPMI-5％FBS)，必须分装冻存在-20℃，一旦解冻,4℃保存不超过3周。
4)FM(细胞冻存液用培养基)(92％Medium+8DMSO)，必须分装冻存在-20℃，一旦解冻，4℃保存不超过3周；
5)GSS：密度梯度分离液，4℃保存；
6)LeucoSepTMTubes，12mL，Greiner Bio One，CAT No.163290，室温保存。
实施例1
本发明实施例的一种用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针，其含有荧光染料A、CD45、细胞角蛋白和ANCA；
其中，荧光染料A为DAPI，细胞角蛋白由Pan-CK、CK5/6、CK7和CK20组成；CD45和ANCA均标记有罗丹明(TRITC)，细胞角蛋白标记有异硫氰酸荧光素(FITC)。
实施例2
本发明实施例的一种用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的试剂盒，其含有实施例1所述的探针，还含有细胞洗涤液、PBS和密度梯度分离液；其中，细胞洗涤液为含有5％FBS的RPMI培养基。
进一步地，所述试剂盒还含有固定液、Triton X-100和羊血清。
实施例3：免疫荧光染色鉴定循环肿瘤细胞和中性粒细胞
本实施例采用免疫荧光染色鉴定循环肿瘤细胞和中性粒细胞(循环肿瘤细胞的富集流程如图1所示)，其具体步骤如下：
一、外周血单个核白细胞/循环肿瘤细胞分离
1)采集血液样本:将8mL外周静脉血注入到一次性使用人体静脉血样采集容器BD vacutainer中，得到血液样本；
2)先让GSS回温至室温，加3mL GSS进管，1000×g室温离心30秒，GSS被甩至有孔滤膜的下面；用PBS按1：1稀释血液样本(8mL血+8mLPBS)；
3)转移8mL经稀释的血液样本进一只管中，转移16mL稀释的血液样本进两只管，400×g室温离心30min；
4)吸走顶层2mL血浆层，留下3-5mm的血浆层，PBMC/CTC层；
5)吸走上层3-5mm的血浆层及有孔滤膜以上的全部细胞转移PBMC/CTC进15mL离心管(有孔滤膜可以有效的阻止红细胞和白细胞的污染)，用2WM冲洗管.
6)用120mL WM(细胞洗涤液)漂洗PBMC/CTC,并轻轻混匀，然后300×g 4℃离心10min，吸走上清，得到细胞悬液。
二、将上述步骤6)中所得的细胞悬液过Nano Velcro系统并进行免疫荧光染色，具体步骤如下：
(a)将上述步骤6)所得细胞悬液注入Nano Velcro系统，流速控制为1.0mL/h，待所有样本通过后，采用500μL RPMI洗涤；
(b)首先于-20度温度下、以甲醇(甲醇用作固定液)固定20分钟，自然干燥10分钟；然后采用PBS洗涤3次，每次洗涤3分钟，再用1％Triton X-100漂洗25-30min，接着用PBS洗涤2次，每次洗涤5分钟；最后采用羊血清于37度封闭20分钟，加入细胞角蛋白4度过夜；
(c)于4度温度下，采用PBS洗涤5次，每次洗涤3分钟；；加入二抗(针对CK,CD45，ANCA不同种属来源的二抗)，37度孵育一小时；37度PBS洗涤3次，每次洗涤5分钟，晾干，用DAPI复染，封片；
(d)在荧光显微镜下进行结果分析，所得结果如图2所示。其中理想的CTC表达CK阳性，淋巴细胞表达CD45阳性,中性粒细胞表达ANCA或CD45阳性。
对比例1
我们以细胞角蛋白、CD45和DAPI为探针，按照实施例3所述方法采用免疫荧光染色鉴定循环肿瘤细胞和中性粒细胞，所得结果如图3所示。由图3可见，以细胞角蛋白、CD45和DAPI为探针时，易导致将血液中大量存在的中性粒细胞误认为是CTC。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针，其特征在于：所述探针含有荧光染料A、CD45、细胞角蛋白和ANCA，所述细胞角蛋白与CD45、ANCA带有不同颜色的荧光染料B。
2.如权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针，其特征在于：所述荧光染料A为DAPI。
3.如权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针，其特征在于：所述细胞角蛋白为CK8、CK18、CK19或CKmix。
4.如权利要求3所述的用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针，其特征在于：所述CKmix包含Pan-CK、CK5/6、CK7和CK20。
5.如权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针，其特征在于：所述CD45和ANCA带有红色荧光标记，所述细胞角蛋白带有绿色荧光标记。
6.如权利要求5所述的用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针，其特征在于：所述CD45和ANCA标记有罗丹明，所述细胞角蛋白标记有异硫氰酸荧光素。
7.一种含有如权利要求1～6任一项所述探针的用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的试剂盒。
8.如权利要求7所述的用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有细胞洗涤液、PBS和密度梯度分离液。
9.如权利要求8所述的用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的试剂盒，其特征在于：所述细胞洗涤液为含有5％FBS的RPMI培养基。
10.如权利要求7～9任一项所述的用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有固定液、Triton X-100和羊血清。
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