CN104677810A - 嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒及其使用方法，本发明的检测试剂盒包括洗涤液、刺激物对照品、带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体、红细胞裂解液、抗体染色液；其中，所述带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体中，嗜碱性粒细胞识别抗体为Anti human CD11b、Anti human CD123、Anti human CD203c和Anti human CD63，且不同的嗜碱性粒细胞识别抗体带有不同的荧光标记。采用本发明的试剂盒检测嗜碱性粒细胞活化情况可规避目前已知的嗜碱性粒细胞活化及检测的影响因素，全面、准确的识别和检测嗜碱性粒细胞活化情况，能更好服务于临床或科研上嗜碱性粒细胞活化的检测。

Description

嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及一种嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒及其使用方法，具体涉及流式细胞术法检测嗜碱性粒细胞活化的试剂盒及其使用方法。
背景技术
目前，过敏性疾病的发病率在全球呈逐年升高的趋势，特别是在发展中国家，因环境污染、食品卫生等造成的过敏性疾病逐渐引起了大家的重视，该类疾病所占医疗资源比例环比上升，且显著影响患者的生活质量。
嗜碱性粒细胞(Basophil)已被认知130余年，是过敏性疾病的主要效应细胞(潘庆军等，中国免疫学杂志,2009,23(1):25-28)。研究发现，活化是嗜碱性粒细胞发挥其生物学功能的关键步骤，对其活化机制的研究，也已从经典的IgE介导的活化，发展到多途径的活化机制，包括细胞因子、抗体、蛋白酶、Toll样受体配体和补体介导的一系列信号所活化(中国免疫学杂志.2013,29(8):816-818)。嗜碱性粒细胞被活化后，可释放胞内众多效应分子，包括组胺、白三烯、抗微生物肽，以及IL-4、IL-5、IL-13和多种趋化因子等，上调其活化相关膜标记物如CD63和CD203c等(潘庆军等，现代免疫学,2014,34(3):246-249；Chirumbolo S,Blood Transfus,2012,10(2):148-164)。近年来，CD63和CD203c作为嗜碱性粒细胞活化标记蛋白已被广泛应用，嗜碱性粒细胞固有表达CD203c，当活化时CD203c的表达进一步上调，而仅有活化的嗜碱性粒细胞才表达CD63(潘庆军等，现代免疫学,2014,34(3):246-249)。但近年发现，不同处理因素如不同红细胞裂解液(潘庆军等，J Immunoassay Immunochem.2014,35(4):368-377)，某些信号分子特异的激动剂或阻断剂对膜上CD63和CD203c表达的影响并不同，且CD63和CD203c代表着嗜碱性粒细胞内两种不同的活化信号，并且都有优缺点(潘庆军等，现代免疫学,2014,34(3):246-249)。因此，基于近年研究新进展，CD63和CD203C联合检测，才能准确、全面的识别活化的外周血嗜碱性粒细胞。
检测人外周血嗜碱性粒细胞活化情况的方法，主要有嗜碱性粒细胞脱颗粒实验(Human basophil degranulation test,HBDT)和流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)定量检测嗜碱性粒细胞活化实验(Basophil activation test,BAT)等，但HBDT灵敏度和特性不如BAT，且重复性较差。因此，目前活化嗜碱性粒细胞检测常用BAT。FCM检测时，尽管嗜碱性粒细胞活化指标相对固定(CD63和CD203c等)，但其识别抗体(或免疫学指标)并不统一，如人嗜碱性粒细胞是否表达HLA-DR尚存争议(Sci Rep.2013；3:1188；Nat Med.2010,16(6):701-707)。因此，基于近年研究新进展，多参数联合检测，才能准确、全面的识别外周血嗜碱性粒细胞。
另外，嗜碱性粒细胞活化及其检测过程受诸多因素的影响，如血清采集过程(抗凝剂的选择)、全血还是分离的白细胞、是否加入IL-3及其浓度、过敏原(浓度和时间)、红细胞裂解液(类型)(潘庆军等，J Immunoassay Immunochem.35:368-377,2014；Pichler WJ(ed):Drug Hypersensitivity.Basel,Karger,2007,391-402)、识别参数的选择、活化阈值的设定(活化指标的变化程度)等，这些因素可能影响活化结果的判断，进而临床疾病的诊断。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷而提供一种采用流式细胞术检测嗜碱性粒细胞活化的新试剂盒及其使用方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒，包括洗涤液、刺激物对照品、带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体、红细胞裂解液、抗体染色液；其中，所述带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体中，嗜碱性粒细胞识别抗体为Anti human CD11b、Anti human CD123、Anti human CD203c和Anti human CD63，且不同的嗜碱性粒细胞识别抗体带有不同的荧光标记。
作为本发明所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的优选实施方式，所述洗涤液为1×PBS，每1L洗涤液中含：8.5～42.5g NaCl、0.2～1.0g KCl、0.1～0.5g CaCl2、0.1～0.5g MgCl2.6H2O、1.42～7.1g Na2HPO4.2H2O、0.2～1.0g KH2PO4。
作为本发明所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的优选实施方式，所述带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体为FITC-anti human CD11b、PerCP-antihuman CD123、PE-anti human CD203c和APC-anti human CD63。当然，荧光标记除以上荧光素搭配外，也可为满足流式细胞仪检测通道要求的其他荧光素搭配。
作为本发明所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的优选实施方式，所述刺激物对照品包括阳性对照品Ⅰ、阳性对照品Ⅱ、过敏原和阴性对照品；所述阳性对照品Ⅰ为0.05～10ng/mL的anti-human FcεR Iα抗体；所述阳性对照品Ⅱ为1～100nmol/L的fMLP(N-甲酰-L-甲硫氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸三肽)。fMLP是一种可引起嗜碱性粒细胞以IgE方式活化的三肽。
作为本发明所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的优选实施方式，所述阴性对照品为1×PBS。
作为本发明所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的优选实施方式，所述红细胞裂解液的pH值为6.8～7.5，其含有以下浓度的组分：50～200mmol/LNH4Cl、5～20mmol/L NaHCO3和0.1～10mmol/L EDTA；所述抗体染色液为含有质量百分比浓度为0.1～0.8％的牛血清白蛋白(BSA)、并含有0.02～0.25％(w/v)的NaN3或0.01～0.05％(w/v)的ProClin300的1×PBS。更优选地，所述红细胞裂解液还含有5～20％(v/v)的甲醛和5～50％(v/v)的二甘醇(Diethylene glycol)。
本发明还提供了上述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的使用方法，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)标本采集：用含有EDTA-K2或肝素的抗凝真空采血管收集检测对象的静脉血液，得到全血标本，备用；
(2)刺激和抗体染色：取4支流式管，先向每管中均加入相同体积的洗涤液；然后于各管中分别加入相同体积的刺激物对照品，刺激物对照品为阴性对照品、阳性对照品Ⅰ、阳性对照品Ⅱ和过敏原；再向每支流式管中加入步骤(1)得到的全血标本，各管加入的全血标本的体积相同，混匀；最后向各管中加入带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体和抗体染色液，再次混匀，于35～37℃避光孵育10～30分钟；
(3)裂解红细胞：向步骤(2)孵育后的各流式管中加入红细胞裂解液，混匀，避光孵育(孵育的温度为室温)；孵育完后，离心，倒出上清液，用洗涤液重悬细胞并进行轻微涡旋，得到细胞悬液；
(4)流式细胞仪检测与数据分析：采用流式细胞仪检测步骤(3)得到的细胞悬液，识别Anti human CD11b+/Anti human CD123+/Anti human CD203c+的嗜碱性粒细胞，计算嗜碱性粒细胞活化百分比与活化程度。
本发明采集到的全血标本，可直接用于嗜碱性粒细胞活化检测或将其于2～8℃冷藏存放(冷藏时间不超过24小时，不能离心或者冷冻)。另外，除全血标本外，分离的白细胞也可以用于嗜碱性粒细胞活化检测。使用本发明的试剂盒时，向流式管中加入全血标本过程中，应确保流式管的侧壁以及顶部不残留全血标本；裂解红细胞过程中，得到的细胞悬液如不能及时检测，需于2～8℃避光保存，24小时内检测。
采用流式细胞仪检测与数据分析过程中，按流式常规检测方法，在流式细胞仪上进行多参数识别嗜碱性粒细胞，并用流式分析软件如FlowJo、FloMax和CellQuest等进行数据分析。优选地，上述步骤(4)按下述两种方法计算嗜碱性粒细胞活化百分比与活化程度：①以高表达CD203c为活化标记：活化百分比＝(高表达CD203c的嗜碱性粒细胞/表达CD203c的嗜碱性粒细胞)×100％，活化程度＝高表达CD203c的嗜碱性粒细胞表达CD203c的平均荧光信号强度；②以表达CD63为活化标记：活化百分比＝(表达CD63的嗜碱性粒细胞/表达CD203c的嗜碱性粒细胞)×100％，活化程度＝表达CD63的嗜碱性粒细胞表达CD63的平均荧光信号强度。其中，表达CD203c包括高表达CD203c和低表达CD203c，高表达CD203c表示为CD203c+high，低表达CD203c表示为CD203c+，表达CD63表示为CD63+。
作为本发明所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的使用方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，每支流式管中所加入的洗涤液、刺激物对照品、全血标本、带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体、抗体染色液的体积比为：50:25:25:1:9。
作为本发明所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的使用方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体为FITC-anti humanCD11b、PerCP-anti human CD123、PE-anti human CD203c和APC-anti humanCD63。
作为本发明所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的使用方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，裂解红细胞时，向步骤(2)孵育后的各流式管中加入红细胞裂解液，混匀，室温避光孵育5～20分钟；孵育完后，以300～500×g的离心力离心5～20分钟，倒出上清液，用洗涤液重悬细胞并进行轻微涡旋，得到细胞悬液。
本发明的有益效果为：本发明建立了嗜碱性粒细胞活化检测的标准化试剂，开发了检测活化嗜碱性粒细胞的新试剂盒。本发明嗜碱性粒细胞活化检测的方法采用多参数(anti human CD11b、anti human CD123、anti human CD63和antihuman CD203c)联合识别嗜碱性粒细胞，可准确、全面的识别嗜碱性粒细胞，避免漏检和多检；该检测方法通过双指标(CD63和CD203C)联合检测嗜碱性粒细胞活化情况，可准确、全面的检测嗜碱性粒细胞的活化情况，避免漏检不同的活化途径；并且，本发明所用的试剂和操作过程(所用的试剂盒操作过程基于我们的大量前期研究工作和文献报道)可规避目前已知的影响嗜碱性粒细胞活化检测的因素，能更好地服务于临床或科研上活化嗜碱性粒细胞的检测。此外，本发明还提出检测相关的注意事项，以期改进嗜碱性粒细胞活化检测试验的不足之处。
附图说明
图1为本发明采用流式细胞术检测嗜碱性粒细胞活化的过程图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的解释。
PBS：phosphate buffer saline，磷酸盐缓冲液；
FITC：Fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素；
PerCP：Peridinin-Chlorophyll-Protein，多甲藻叶绿素蛋白
PE：P-phycoerythrin，藻红蛋白；
fMLP：N-formylmethionyl-leucyl-phenyl-alanine，N-甲酰-L-甲硫氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸三肽，fMLP是一种趋化性肽；
ProClin300：ProClin300是一种防腐剂；
BSA：牛血清白蛋白；
SLE：Systemic Lupus Erythematosus，系统性红斑狼疮；
RA：Rheumatoid Arthritis，类风湿关节炎。
实施例中，洗涤液为1×PBS，且下述1×PBS均按以下方法配制，即每1L PBS种含8.5～42.5g NaCl、0.2～1.0g KCl、0.1～0.5g CaCl2、0.1～0.5g MgCl2.6H2O、1.42～7.1g Na2HPO4.2H2O、0.2～1.0g KH2PO4。
实施例中，采用流式细胞术检测嗜碱性粒细胞活化的过程如图1所示，具体方法为：在流式细胞仪上检测，根据散点图(图1①)，首先进行圈出Anti humanCD11b+/Anti human CD123+双阳性的细胞(图1②)，再圈出的细胞即为嗜碱性粒细胞(图1③)，根据表达CD203c强度不同分为低表达CD203c(即CD203c+)的嗜碱性粒细胞和高表达CD203c(即CD203c+high)的嗜碱性粒细胞(图1③)，分析高表达CD203c(即CD203c+high)的嗜碱性粒细胞表达CD203c的平均荧光强度(Median Fluorescence Intensity,MFI)(图1④)；同时，将嗜碱性粒细胞(图1③)根据是否表达CD63，分为不表达CD63的嗜碱性粒细胞和表达CD63的嗜碱性粒细胞(图1⑤)，最后分析表达CD63的嗜碱性粒细胞表达CD63的平均荧光强度(Median Fluorescence Intensity,MFI)(图1⑥)。
实施例中，CD203c+high表示高表达CD203c，CD203c+表示低表达CD203c，CD63+表示表达CD63。
实施例1：检测花粉过敏患者嗜碱性粒细胞活化情况
本发明嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的一种实施例，本实施例所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒包括洗涤液、刺激物对照品、带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体、红细胞裂解液、抗体染色液。其中，洗涤液为1×PBS，每1L洗涤液中含：42.5g NaCl、1.0g KCl、0.3g CaCl2、0.3g MgCl2.6H2O、1.42gNa2HPO4.2H2O、0.2g KH2PO4；
刺激物对照品包括阳性对照品Ⅰ、阳性对照品Ⅱ、过敏原和阴性对照品；阳性对照品Ⅰ为0.05ng/mL的anti-human FcεR Iα抗体，阳性对照品Ⅱ为1nmol/L的fMLP，过敏原为花粉过敏原原提取液(由华南地区常见的重阳木、椰子、刺苋、木麻黄、红花羊蹄甲和苦楝的花粉浸提物组成)，阴性对照品为1×PBS；
带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体为FITC-anti human CD11b、PerCP-anti human CD123、PE-anti human CD203c和APC-anti human CD63；
红细胞裂解液含有以下浓度的组分：50mmol/L NH4Cl、5mmol/L NaHCO3和10mmol/L EDTA；
抗体染色液为含有质量百分比浓度为0.1％的牛血清白蛋白(BSA)、并含有0.02％(w/v)NaN3的1×PBS。
本实施例的红细胞裂解液中还可含5％(v/v)的甲醛和50％(v/v)的二甘醇。
本实施例所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)标本采集：用含有EDTA的抗凝真空采血管收集检测对象的静脉血液，得到全血标本，备用；
(2)刺激和抗体染色：取4支流式管，先向每管中均加入100μL 1×PBS；然后于各管中分别加入阴性对照品(用作空白对照)、阳性对照品Ⅰ(用作刺激对照)、阳性对照品Ⅱ(用作刺激对照)和过敏原(检测管)各50μL；再向每支流式管中加入50μL步骤(1)得到的全血标本，轻轻混匀；最后，向各管中加入2μL带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体和18μL抗体染色液，再次轻轻混匀，盖好流式管盖，于37℃避光孵育15分钟；
(3)裂解红细胞：向步骤(2)孵育后的各流式管中加入2mL红细胞裂解液，轻轻混匀，室温避光孵育10分钟；孵育完后，以400×g的离心力离心8分钟，轻轻倒出上清液，用300μL 1×PBS重悬细胞并进行轻微涡旋，得到细胞悬液；
(4)流式细胞仪检测与数据分析：按流式常规检测方法，在流式细胞仪上进行多参数识别嗜碱性粒细胞，并用流式分析软件如FlowJo、FloMax和CellQuest等进行数据分析；采用流式细胞术检测嗜碱性粒细胞活化的过程如图1所示。
按下述两种方法计算嗜碱性粒细胞活化百分比与活化程度：①以高表达CD203c为活化标记：活化百分比＝(高表达CD203c的嗜碱性粒细胞/表达CD203c的嗜碱性粒细胞)×100％，活化程度＝高表达CD203c的嗜碱性粒细胞表达CD203c的平均荧光信号强度；②以表达CD63为活化标记：活化百分比＝(表达CD63的嗜碱性粒细胞/表达CD203c的嗜碱性粒细胞)×100％，活化程度＝表达CD63的嗜碱性粒细胞表达CD63的平均荧光信号强度。
以高表达CD203c为活化标记，计算活化百分比与活化程度的结果如表1所示；以表达CD63为活化标记计算活化百分比与活化程度的结果如表2所示。结果提示，对于两种计算嗜碱性粒细胞活化百分比与活化程度的方法，空白对照未诱导患者嗜碱性粒细胞活化，但阳性对照I和II可显著诱导患者嗜碱性粒细胞活化，且6例患者均对花粉过敏，以患者3和6最显著。
表1
表2
实施例2：检测β-内酰胺类抗生素过敏患者嗜碱性粒细胞活化情况
本发明嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的一种实施例，本实施例所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒包括洗涤液、刺激物对照品、带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体、红细胞裂解液、抗体染色液。其中，洗涤液为1×PBS，每1L洗涤液中含：8.5g NaCl、0.2g KCl、0.5g CaCl2、0.5g MgCl2.6H2O、7.1gNa2HPO4.2H2O、1.0g KH2PO4；
刺激物对照品包括阳性对照品Ⅰ、阳性对照品Ⅱ、过敏原和阴性对照品；阳性对照品Ⅰ为10ng/mL的anti-human FcεR Iα抗体，阳性对照品Ⅱ为50nmol/L的fMLP，过敏原为β-内酰胺类抗生素过敏原(由青霉素类、头孢菌素类、单环β-内酰胺类和碳青霉烯类组成)，阴性对照品为1×PBS；
带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体为FITC-anti human CD11b、PerCP-anti human CD123、PE-anti human CD203c和APC-anti human CD63；
红细胞裂解液的pH值为6.8～7.5，其含有以下浓度的组分：200mmol/LNH4Cl、20mmol/L NaHCO3和5mmol/L EDTA；
抗体染色液为含有质量百分比浓度为0.8％的牛血清白蛋白(BSA)、并含有0.25％(w/v)NaN3的1×PBS。
本实施例的红细胞裂解液中还可含20％(v/v)的甲醛和5％(v/v)的二甘醇。
本实施例所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)标本采集：用含有肝素的抗凝真空采血管收集检测对象的静脉血液，得到全血标本，备用；
(2)刺激和抗体染色：取4支流式管，先向每管中均加入100μL1×PBS；然后于各管中分别加入阴性对照品(用作空白对照)、阳性对照品Ⅰ(用作刺激对照)、阳性对照品Ⅱ(用作刺激对照)和过敏原(检测管)各50μL；再向每支流式管中加入50μL步骤(1)得到的全血标本，轻轻混匀；最后，向各管中加入2μL带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体和18μL抗体染色液，再次轻轻混匀，盖好流式管盖，于36℃避光孵育10分钟；
(3)裂解红细胞：向步骤(2)孵育后的各流式管中加入2mL红细胞裂解液，轻轻混匀，室温避光孵育20分钟；孵育完后，以500×g的离心力离心5分钟，轻轻倒出上清液，用300μL1×PBS重悬细胞并进行轻微涡旋，得到细胞悬液；
(4)流式细胞仪检测与数据分析：按流式常规检测方法，在流式细胞仪上进行多参数识别嗜碱性粒细胞，并用流式分析软件如FlowJo、FloMax和CellQuest等进行数据分析；采用流式细胞术检测嗜碱性粒细胞活化的过程如图1所示。
按下述两种方法计算嗜碱性粒细胞活化百分比与活化程度：①以高表达CD203c为活化标记：活化百分比＝(高表达CD203c的嗜碱性粒细胞/表达CD203c的嗜碱性粒细胞)×100％，活化程度＝高表达CD203c的嗜碱性粒细胞表达CD203c的平均荧光信号强度；②以表达CD63为活化标记：活化百分比＝(表达CD63的嗜碱性粒细胞/表达CD203c的嗜碱性粒细胞)×100％，活化程度＝表达CD63的嗜碱性粒细胞表达CD63的平均荧光信号强度。
以高表达CD203c为活化标记，计算活化百分比与活化程度的结果如表3所示；以表达CD63为活化标记计算活化百分比与活化程度的结果如表4所示。结果提示，对于两种计算嗜碱性粒细胞活化百分比与活化程度的方法，空白对照未诱导患者嗜碱性粒细胞活化，但阳性对照I和II可显著诱导患者嗜碱性粒细胞活化，且6例患者均对β-内酰胺类抗生素过敏，以患者2和5最显著。
表3
表4
实施例3：检测自身免疫性疾病患者(自身抗原过敏)嗜碱性粒细胞活化情况
本发明嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的一种实施例，本实施例所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒包括洗涤液、刺激物对照品、带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体、红细胞裂解液、抗体染色液。其中，洗涤液为1×PBS，每1L洗涤液中含：25.5g NaCl、0.6g KCl、0.1g CaCl2、0.1g MgCl2.6H2O、4.2gNa2HPO4.2H2O、0.6g KH2PO4；
刺激物对照品包括阳性对照品Ⅰ、阳性对照品Ⅱ、过敏原和阴性对照品；阳性对照品Ⅰ为5ng/mL的anti-human FcεR Iα抗体，阳性对照品Ⅱ为100nmol/L的fMLP，过敏原为自身抗原(用Thermo Scientific NEPER核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒抽提出SLE患者白细胞的核蛋白组分)、阴性对照品为1×PBS；
带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体为FITC-anti human CD11b、PerCP-anti human CD123、PE-anti human CD203c和APC-anti human CD63；
红细胞裂解液的pH值为6.8～7.5，其含有以下浓度的组分：120mmol/LNH4Cl、10mmol/L NaHCO3和0.1mmol/L EDTA；
抗体染色液为含有质量百分比浓度为0.4％的牛血清白蛋白(BSA)、并含有0.01～0.05％(w/v)ProClin300的1×PBS。
本实施例的红细胞裂解液中还可含12％(v/v)的甲醛和25％(v/v)的二甘醇。
本实施例所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)标本采集：用含有EDTA-K2的抗凝真空采血管收集检测对象的静脉血液，得到全血标本，备用；
(2)刺激和抗体染色：取4支流式管，先向每管中均加入100μL 1×PBS；然后于各管中分别加入阴性对照品(用作空白对照)、阳性对照品Ⅰ(用作刺激对照)、阳性对照品Ⅱ(用作刺激对照)和过敏原(检测管)各50μL；再向每支流式管中加入50μL步骤(1)得到的全血标本，轻轻混匀；最后，向各管中加入2μL带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体和18μL抗体染色液，再次轻轻混匀，盖好流式管盖，于35℃避光孵育30分钟；
(3)裂解红细胞：向步骤(2)孵育后的各流式管中加入2mL已加热的红细胞裂解液，轻轻混匀，室温避光孵育5分钟；孵育完后，以300×g的离心力离心20分钟，轻轻倒出上清液，用300μL1×PBS重悬细胞并进行轻微涡旋，得到细胞悬液；
(4)流式细胞仪检测与数据分析：按流式常规检测方法，在流式细胞仪上进行多参数识别嗜碱性粒细胞，并用流式分析软件如FlowJo、FloMax和CellQuest等进行数据分析；采用流式细胞术检测嗜碱性粒细胞活化的过程如图1所示。
按下述两种方法计算嗜碱性粒细胞活化百分比与活化程度：①以高表达CD203c为活化标记：活化百分比＝(高表达CD203c的嗜碱性粒细胞/表达CD203c的嗜碱性粒细胞)×100％，活化程度＝高表达CD203c的嗜碱性粒细胞表达CD203c的平均荧光信号强度；②以表达CD63为活化标记：活化百分比＝(表达CD63的嗜碱性粒细胞/表达CD203c的嗜碱性粒细胞)×100％，活化程度＝表达CD63的嗜碱性粒细胞表达CD63的平均荧光信号强度。
以高表达CD203c为活化标记，计算活化百分比与活化程度的结果如表5所示；以表达CD63为活化标记计算活化百分比与活化程度的结果如表6所示。结果提示，对于两种计算嗜碱性粒细胞活化百分比与活化程度的方法，空白对照未诱导患者嗜碱性粒细胞活化，但阳性对照I和II可显著诱导患者嗜碱性粒细胞活化，且6例患者均对自身抗原过敏，以患者5最显著。
表5
表6
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒，其特征在于：所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒包括洗涤液、刺激物对照品、带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体、红细胞裂解液、抗体染色液；其中，所述带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体中，嗜碱性粒细胞识别抗体为Anti human CD11b、Anti humanCD123、Anti human CD203c和Anti human CD63，且不同的嗜碱性粒细胞识别抗体带有不同的荧光标记。
2.如权利要求1所述的嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为1×PBS，每1L洗涤液中含：8.5～42.5g NaCl、0.2～1.0g KCl、0.1～0.5gCaCl2、0.1～0.5g MgCl2.6H2O、1.42～7.1g Na2HPO4.2H2O、0.2～1.0g KH2PO4。
3.如权利要求1所述的嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒，其特征在于：所述带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体为FITC-anti human CD11b、PerCP-antihuman CD123、PE-anti human CD203c和APC-anti human CD63。
4.如权利要求1所述的嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒，其特征在于：所述刺激物对照品包括阳性对照品Ⅰ、阳性对照品Ⅱ、过敏原和阴性对照品；所述阳性对照品Ⅰ为0.05～10ng/mL的anti-human FcεR Iα抗体；所述阳性对照品Ⅱ为1～100nmol/L的fMLP。
5.如权利要求4所述的嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照品为1×PBS。
6.如权利要求1或4所述的嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒，其特征在于：所述红细胞裂解液的pH值为6.8～7.5，其含有以下浓度的组分：50～200mmol/LNH4Cl、5～20mmol/L NaHCO3和0.1～10mmol/L EDTA；
所述抗体染色液为含有质量百分比浓度为0.1～0.8％的牛血清白蛋白、并含有0.02～0.25％(w/v)NaN3或0.01～0.05％(w/v)ProClin300的1×PBS。
7.如权利要求6所述的嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒，其特征在于：所述红细胞裂解液还含有5～20％(v/v)的甲醛和5～50％(v/v)的二甘醇。
8.一种如权利要求4所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)标本采集：用含有EDTA-K2或肝素的抗凝真空采血管收集检测对象的静脉血液，得到全血标本，备用；
(2)刺激和抗体染色：取4支流式管，先向每管中均加入相同体积的洗涤液；然后于各管中分别加入相同体积的刺激物对照品，刺激物对照品为阴性对照品、阳性对照品Ⅰ、阳性对照品Ⅱ和过敏原；再向每支流式管中加入步骤(1)得到的全血标本，各管加入的全血标本的体积相同，混匀；最后向各管中加入带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体和抗体染色液，再次混匀，于35～37℃下避光孵育10～30分钟；
(3)裂解红细胞：向步骤(2)孵育后的各流式管中加入红细胞裂解液，混匀，避光孵育；孵育完后，离心，倒出上清液，用洗涤液重悬细胞并进行涡旋，得到细胞悬液；
(4)流式细胞仪检测与数据分析：采用流式细胞仪检测步骤(3)得到的细胞悬液，识别Anti human CD11b+/Anti human CD123+/Anti human CD203c+的嗜碱性粒细胞，计算嗜碱性粒细胞活化百分比与活化程度。
9.如权利要求8所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤(2)中，带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体为FITC-antihuman CD11b、PerCP-anti human CD123、PE-anti human CD203c和APC-antihuman CD63。
10.如权利要求8所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤(4)中，按下述两种方法计算嗜碱性粒细胞活化百分比与活化程度：①以高表达CD203c为活化标记：活化百分比＝(高表达CD203c的嗜碱性粒细胞/表达CD203c的嗜碱性粒细胞)×100％，活化程度＝高表达CD203c的嗜碱性粒细胞表达CD203c的平均荧光信号强度；②以表达CD63为活化标记：活化百分比＝(表达CD63的嗜碱性粒细胞/表达CD203c的嗜碱性粒细胞)×100％，活化程度＝表达CD63的嗜碱性粒细胞表达CD63的平均荧光信号强度。
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