CN101221181B - 单克隆抗体spa红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的间接法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的间接法。该方法首先配制一抗、二抗致敏红细胞保存液，其次分离外周血淋巴细胞，再用含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液悬浮制得二抗致敏红细胞应用液和一抗致敏淋巴细胞悬液；然后将一抗致敏淋巴细胞悬液与二抗致敏红细胞应用液以1∶1的体积比混合成混合悬液，在18～28℃下静置后离心，再在4℃静置15～45min；最后用带吸头的移液器吹吸混合悬液8～15次后推制成细胞涂片，经自然干燥、染色后用高倍镜计数。本发明与原McAb-A-E间接法相比具有检验过程简化、周期短、可量化控制、满足临床检验要求的特点。
Description
技术领域
本发明涉及医学免疫学，尤其涉及一种单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的间接法。
背景技术
随着分子免疫学的发展，根据淋巴细胞膜表面分化抗原群(cluster ofdifferentiation，CD)的不同，可将T、B、NK淋巴细胞分成若干亚群，临床实验室通过抗分化抗原抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD19、抗CD20、抗CD16、抗CD56等的单克隆抗体(McAb)，对外周血淋巴细胞进行检验，依据其阳性率判定总T细胞、T辅助性细胞(Th)、细胞毒性T细胞(Tc)亚群、B淋巴细胞、NK细胞等的分布和变化，从而判断人体的免疫功能，达到预防保健和疾病的诊断、治疗、预后的目的。
目前，淋巴细胞亚群常用的检验方法有流式细胞仪法、免疫荧光法、AP-AAP桥联酶免疫法和SPA(金黄色葡萄球菌A蛋白)花环法。其中SPA花环法又分红细胞花环法和菌花环法，而红细胞花环法又分直接法和间接法。
SPA红细胞花环法的间接法因为应用单克隆抗体(McAb)，又叫单克隆抗体SPA红细胞花环法间接法，简称McAb-A-E间接法。该法在《全国临床检验操作规程》(中华人民共和国卫生部医政司编，第二版，东南大学出版社，1997：381～384和第一版1991：320～322)中仅有McAb-A-E法原理以及直接法的摘要性论述，但无详尽操作方法，实际工作中按“冻干抗体致敏红细胞花环试剂使用说明书”规定的方法进行具体操作：(1)将冻干二抗(羊或兔抗小鼠IgG)致敏红细胞花环试剂中加入pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液(简称无钙、镁Hank’S液)或磷酸盐缓冲液(PBS)溶解；(2)将一抗——冻干抗CD3、抗CD4、抗CD8单克隆抗体加入1.0mL pH值为7.0～7.4的无钙、镁Hank’S液或PBS溶解；(3)按常规法(分离细胞以2000～2500rpm离心20～30min，用无钙、镁Hank’S液洗涤2次，每次转速为1000～1500rpm，离心5～10min)用淋巴细胞分离液分离出外周血淋巴细胞，最后用含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液配成500万/mL；(4)将试管呈20度角斜放， 于37℃孵育45min，将细胞悬液取出置另一试管中，离心去上清并恢复原量备用；(5)根据待检样品数取一定量溶解后的一抗，用pH值为7.0～7.4的无钙、镁Hank’S液稀释；根据待检样品数取一定量二抗(羊或兔抗小鼠IgG)致敏红细胞花环试剂悬液，离心去上清，用含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮，恢复至原量；(6)将待测淋巴细胞悬液与一抗等量混合(各25～50μL)，在4℃作用30min，然后用pH值为7.0～7.4的无钙、镁Hank’S液洗3次；(7)一抗致敏淋巴细胞悬液与二抗致敏红细胞悬液等量混合(各25～50μL)，室温(22～25℃)下放置10min，500rpm离心10min，室温下继续放置1小时，并在4℃放置2小时或过夜；(8)轻轻悬浮后加入25μL梅-格氏染液(May～Gruenwaid)室温染色10min后，离心去上清，再加50μL的姬姆萨染液(Glemsa液)染色30min(或单用Glemsa液染色)，当天或第二天看结果均可；(9)结果检查及判定：用高倍镜检查，淋巴细胞周围黏附有三个以上红细胞即为花环阳性细胞，未黏附红细胞者为阴性细胞，黏附一、二个红细胞者即除掉不计数统计，计数100～200个淋巴细胞，算出花环形成细胞的百分率。
虽然McAb-A-E间接法所采用的冻干抗体致敏红细胞花环试剂本身具有特异性强、敏感、稳定性好、有效期长、使用方便、仅需普通光学显微镜即可进行检验的特点，且实验结果可保存两周左右，十几年来被临床实验室和相关研究单位广泛应用，但是McAb-A-E间接法作为一种临床检验方法却由于存在检验步骤多、所需标本量相对较多、周期长、易造成被测细胞损伤和丢失、个别重要步骤无量化控制指标、非特异花环鉴别困难而影响计数结果等缺陷，无法适应临床上快速、准确的要求，使很多实验室，特别是临床实验室接受困难，限制了该方法的推广应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题就是提供一种检验过程简化、检验周期短、能够进行量化控制、满足临床检验要求的单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的间接法。
为解决上述问题，本发明所述的一种单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的间接法，包括下述步骤：
(1)配制一抗保存液；
(2)配制二抗致敏红细胞保存液；
(3)分离外周血淋巴细胞后用pH值为7.0～7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液配成400～600万/mL淋巴细胞悬液；
(4)将一抗保存液用10倍的pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液稀释，形成一抗应用液。
(5)取二抗致敏红细胞保存液，以300～500rpm转速离心6～10min后去上清，用pH值为7.0～7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液悬浮，形成与所取二抗致敏红细胞保存液等量的二抗致敏红细胞应用液；
(6)将淋巴细胞悬液以1∶1的体积比与一抗应用液混合并在4℃下作用30min；经pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液洗涤弃上清后，按与淋巴细胞悬液1∶1的体积比加入pH值为7.0～7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液形成一抗致敏淋巴细胞悬液；
(7)将一抗致敏淋巴细胞悬液与二抗致敏红细胞应用液以1∶1的体积比混合，在18～28℃下放置10min；以300～500rpm转速离心5min后在4℃静置15～45min；
(8)用20或25μL容积的带吸头的移液器吹吸混合悬液8～15次；取混合悬液推制细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，然后用高倍镜计数：淋巴细胞周围黏附有三个以上红细胞即为花环阳性细胞，未黏附红细胞者为阴性细胞，黏附一、二个红细胞者除掉不计；计数时，选取细胞涂片从头至尾的2/6～4/6之间至少两处区域共计数200个细胞，算出花环形成细胞的百分率。
所述步骤(1)中的一抗保存液是通过将冻干一抗加入1.0mL pH值为7.0～7.4无钙、镁汉克氏平衡盐溶液或磷酸盐缓冲液溶解而成的，其中所述冻干一抗为冻干抗CD3、抗CD4、抗CD8单克隆抗体中的任意一种。
所述步骤(2)中的二抗致敏红细胞保存液是通过将冻干二抗致敏红细胞花环试剂加入0.5mL pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液或磷酸盐缓冲液溶解而成的，其中所述冻干二抗为羊或兔抗小鼠IgG。
所述步骤(3)中的分离外周血淋巴细胞是指将采用肝素或乙二胺四乙酸抗凝剂抽取的静脉血，以1∶1～3的体积比加入pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液，混匀后加在淋巴细胞分离液上，淋巴细胞分离液与稀释血液的体积比为1∶1～3，在18～28℃温度下，以800～1200rpm的转速离心 15～20min；再取出单个核细胞，并对单个核细胞用pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液洗涤，每次以300～500rpm的转速离心6～10min后弃上清制得。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明通过改变分离、处理细胞的相关参数、简化处理步骤，降低了细胞损伤，保证了处理后的细胞形态结构与自然形态结构基本一致；再通过改变细胞涂片和染色计数方法，在显微镜下可直接辨认细胞的形态结构，识别和鉴别细胞，不需要对淋巴细胞进行纯化处理，从而取消了原方法中纯化淋巴细胞的操作步骤，避免了原方法费时复杂的操作、被测细胞易损伤和丢失、标本量相对较多、非特异细胞花环难以鉴别的缺陷。
2、本发明在保证检验结果稳定不变的前提下，取消原方法中抗原-抗体反应的不必要条件和步骤，从而缩短了抗原-抗体反应的时间。免疫学抗原-抗体反应所需时间一般在一小时左右才可完成。
3、由于原方法是利用黏附细胞在光滑玻璃、塑料表面具有运动黏附的特性，用培养贴壁法除去黏附细胞，从而达到不影响特异细胞花环的识别和计数的目的。而本发明则利用黏附细胞本身的形态结构特征，在改变分离处理细胞的离心速度参数后，在尽可能不影响黏附细胞原有的细胞形态的条件下，选用最佳的固定方法、染色液和染色方法，在显微镜下直接显示黏附细胞本身的形态结构特征，从而达到鉴别、区别细胞的目的。
4、由于原方法中对操作过程中的“轻轻悬浮”未进行量化控制：悬浮时用力过大，会使花环红细胞散落；用力不足，则花环细胞分散不均匀，出现团块，从而影响计数，加大检验误差；而本发明则通过对该步骤规定了普通实验室普遍能够应用的量化指标，使不同操作者和同一操作者在每一次试验中无论采用何种反应管都能按照量化后的控制标准进行操作，从而减小了系统误差和偶然误差，增加了检验的稳定性、准确性和可比性。
5、由于本发明通过改变细胞染色、计数方法，对计数时选取的区域和方法进行了规范，从而保证了计数的代表性，减少了人为因素所引起的检验结果差异；同时改用细胞涂片法后，可以发现本检验项目以外的某些异常情况：如外周血中出现原始、幼稚细胞等，可为被检者和临床医生提供诊疗建议。另外，染色的细胞涂片具有易于存放复查、携带交流、便于拍照存档等优点。
6、本发明增加了目前临床广泛应用的乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂， 扩展了原方法采集标本时所用抗凝剂的范围，更加适用于临床。
7、本发明通过减少检验步骤，将检验周期由原来的8～9小时减少到2.5～3小时，缩短时间达5～6小时，满足了临床快速检验的要求；同时由于简化了操作步骤，使标本、试剂、器材用量等相对减少，从而在降低成本的基础上提高了检验的稳定性，因而易于在各级、各类医院、研究单位的临床实验室推广应用。
具体实施方式
实施例1 在冻干抗CD3单克隆抗体(一抗)中加入1.0mL pH值为7.0的无钙、镁Hank’S液溶解，形成一抗保存液；溶解后的一抗保存液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封放4～8℃，可保存2～4周。
在冻干羊抗小鼠IgG(二抗)致敏红细胞花环试剂中加入0.5mL pH值为7.0的无钙、镁Hank’S液溶解，形成二抗致敏红细胞保存液；溶解后的细胞悬液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封，在4～8℃可保存2～4周。
用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂抽取患者空腹静脉血1.5mL，加入4.5mLpH值为7.0的无钙、镁Hank’S液，混匀后用滴管小心加在2mL淋巴细胞分离液上(10mL试管或离心管)，在18℃温度下，北京医用离心机厂LDZ5-2半径22cm的离心机以1200rpm转速离心20min。
用滴管轻轻吸出单个核细胞(BPMC)并加到盛有5～10mL pH值为7.0的无钙、镁Hank’S液的另一离心管中，尽量少吸淋巴细胞分离液；混匀后离心机以300rpm的转速离心10min，弃上清；用pH值为7.0含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液配成400万/mL淋巴细胞悬液备用。
将10μL一抗保存液，用10倍的pH值为7.0无钙、镁Hank’S液稀释形成一抗应用液。
取二抗致敏红细胞保存液25～50μL于0.2～0.5mL爱频道夫离心管中，以300 rpm转速离心10min后弃去上清，用pH值为7.0含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮并恢复至原量，形成二抗致敏红细胞应用液。
将淋巴细胞悬液25μL与一抗应用液等量混合，在4℃作用30min。然后用10～25倍量pH值为7.0无钙、镁Hank’S液洗1～2次，每次以300rpm，离心10min，弃去上清，以去除未结合的单抗。再加pH值为7.0含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液25μL形成一抗致敏淋巴细胞悬液。
在25μL一抗致敏淋巴细胞悬液中，加入等量的二抗致敏红细胞应用液，混匀，在室温18℃下放置10min；以300rpm转速离心5min后在4℃静置45min。
用20μL容积的带吸头的移液器以2次/秒的均匀速度轻轻吹吸混合悬液15次；取10～15μL混合悬液按血片法推制面积8～12cm2的细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，高倍镜计数。
其中改良姬姆萨染色法是指将改良姬姆萨染色液原液，用无水甲醇作3倍稀释，用稀释染色液5～10滴完全覆盖细胞涂片，染色约1～2min，加pH值为6.4～6.8的PBS液5～10滴染色2～5min，用水冲洗即可。
判定方法：淋巴细胞周围黏附有三个以上红细胞即为花环阳性细胞，未黏附红细胞者为阴性细胞，黏附一、二个红细胞者除掉不计；计数(计数方法同手工血片白细胞分类法)时，选取细胞涂片从头至尾的2/6～4/6之间的至少两处区域共计数200个细胞，算出花环形成细胞的百分率。
检验结果：CD3+为56％、CD4+为38％、CD8+为27％、CD4+/CD8+ 为1.41。
实施例2 在冻干抗CD4单克隆抗体中加入1.0mL pH值为7.2的无钙、镁Hank’S液溶解，形成一抗保存液；溶解后的一抗保存液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封放4～8℃，可保存2～4周。
在冻干兔抗小鼠IgG致敏红细胞花环试剂中加入0.5mL pH值为7.2的无钙、镁Hank’S液溶解，形成二抗致敏红细胞保存液；溶解后的细胞悬液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封，在4～8℃可保存2～4周。
用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂抽取患者空腹静脉血2mL，加入4mLpH值为7.2的无钙、镁Hank’S液，混匀后用滴管小心加在2.5mL淋巴细胞分离液上(10mL试管或离心管)，在22℃温度下，半径22cm的离心机以1000rpm转速离心18min。
用滴管轻轻吸出单个核细胞(BPMC)并加到盛有5～10mL pH值为7.2的无钙、镁Hank’S液的另一离心管中，尽量少吸淋巴细胞分离液；混匀后离心机以400rpm的转速离心8min，弃上清；用pH值为7.2含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液配成500万/mL淋巴细胞悬液备用。
将10μL一抗保存液，用10倍的pH值为7.2无钙、镁Hank’S液稀释形成一抗应用液。
取二抗致敏红细胞保存液25～50μL于0.2～0.5mL爱频道夫离心管中，以400rpm转速离心8min后弃去上清，用pH值为7.2含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮并恢复至原量，形成二抗致敏红细胞应用液。
将淋巴细胞悬液25μL与一抗应用液等量混合，在4℃作用30min。然后用10～25倍量pH值为7.2无钙、镁Hank’S液洗1～2次，每次以400rpm，离心8min，弃去上清，以去除未结合的单抗。再加pH值为7.2含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液25μL形成一抗致敏淋巴细胞悬液。
在25μL一抗致敏淋巴细胞悬液中，加入等量的二抗致敏红细胞应用液，混匀，在室温22℃下放置10min；以400rpm转速离心5min后在4℃静置30min。
用25μL容积的带吸头的移液器以2次/秒的均匀速度轻轻吹吸混合悬液8次；取10～15μL混合悬液按血片法推制面积8～12cm2的细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，高倍镜计数。
改良姬姆萨染色法和判定方法同实施例1。
检验结果：CD3+为68％、CD4+为45％、CD8+为25％、CD4+/CD8+为1.80。
实施例3 在冻干抗CD8单克隆抗体中加入1.0mL pH值为7.4的无钙、镁Hank’S液溶解，形成一抗保存液；溶解后的一抗保存液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封放4～8℃，可保存2～4周。
在冻干羊抗小鼠IgG致敏红细胞花环试剂中加入0.5mL pH值为7.4的无钙、镁Hank’S液溶解，形成二抗致敏红细胞保存液；溶解后的细胞悬液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封，在4～8℃可保存2～4周。
用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂抽取患者空腹静脉血2.5mL，加入2.5mLpH值为7.4的无钙、镁Hank’S液，混匀后用滴管小心加在2.5mL淋巴细胞分离液上(10mL试管或离心管)，在28℃温度下，半径22cm的离心机以1200rpm转速离心15min。
用滴管轻轻吸出单个核细胞(BPMC)并加到盛有5～10mL pH值为7.4的无钙、镁Hank’S液的另一离心管中，尽量少吸淋巴细胞分离液；混匀后离心机以500rpm的转速离心6min，弃上清；用pH值为7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液配成600万/mL淋巴细胞悬液备用。
将10μL一抗保存液，用10倍的pH值为7.4无钙、镁Hank’S液稀释形 成一抗应用液。
取二抗致敏红细胞保存液25～50μL于0.2～0.5mL爱频道夫离心管中，以500rpm转速离心6min后弃去上清，用pH值为7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮并恢复至原量，形成二抗致敏红细胞应用液。
将淋巴细胞悬液50L与一抗应用液等量混合，在4℃作用30min。然后用10～25倍量pH值为7.4无钙、镁Hank’S液洗1～2次，每次以500rpm，离心6min，弃去上清，以去除未结合的单抗。再加pH值为7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液50μL形成一抗致敏淋巴细胞悬液。
在50L一抗致敏淋巴细胞悬液中，加入等量的二抗致敏红细胞应用液，混匀，在室温28℃下放置10min；以500rpm转速离心5min后在4℃静置15min。
用20μL容积的带吸头的移液器以2次/秒的均匀速度轻轻吹吸混合悬液10次；取10～15μL混合悬液按血片法推制面积8～12cm2的细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，高倍镜计数。
改良姬姆萨染色法和判定方法同实施例1。
检验结果：CD3+为66％、CD4+为34％、CD8+为34％、CD4+/CD8+为1.00。
实施例4 在冻干抗CD3单克隆抗体中加入1.0mL pH值为7.0的PBS液溶解，形成一抗保存液；溶解后的一抗保存液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封放4～8℃，可保存2～4周。
在冻干兔抗小鼠IgG致敏红细胞花环试剂中加入0.5mL pH值为7.0的PBS液溶解，形成二抗致敏红细胞保存液；溶解后的细胞悬液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封，在4～8℃可保存2～4周。
用肝素抗凝剂抽取患者空腹静脉血2mL，加入2mLpH值为7.0的无钙、镁Hank’S液，混匀后用滴管小心加在2mL淋巴细胞分离液上(10mL试管或离心管)，在18℃温度下，半径22cm的离心机以1000rpm转速离心20min。
用滴管轻轻吸出单个核细胞(BPMC)并加到盛有5～10mLpH值为7.0的无钙、镁Hank’S液的另一离心管中，尽量少吸淋巴细胞分离液；混匀后离心机以300rpm的转速离心10min，弃上清；用pH值为7.0含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液配成400万/mL淋巴细胞悬液备用。
将10μL一抗保存液，用10倍的pH值为7.0无钙、镁Hank’S液稀释形 成一抗应用液。
取二抗致敏红细胞保存液25～50μL于0.2～0.5mL爱频道夫离心管中，以300rpm转速离心10min后弃去上清，用pH值为7.0含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮并恢复至原量，形成二抗致敏红细胞应用液。
将淋巴细胞悬液30μL与一抗应用液等量混合，在4℃作用30min。然后用10～25倍量pH值为7.0无钙、镁Hank’S液洗1～2次，每次以300rpm，离心10min，弃去上清，以去除未结合的单抗。再加pH值为7.0含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液30μL形成一抗致敏淋巴细胞悬液。
在30μL一抗致敏淋巴细胞悬液中，加入等量的二抗致敏红细胞应用液，混匀，在室温18℃下放置10min；以300rpm转速离心5min后在4℃静置45min。
用20L容积的带吸头的移液器以2次/秒的均匀速度轻轻吹吸混合悬液10次；取10～15μL混合悬液按血片法推制面积8～12cm2的细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，高倍镜计数。
改良姬姆萨染色法和判定方法同实施例1。
检验结果：CD3+为45％、CD4+为30％、CD8+为34％、CD4+/CD8+为0.88。
实施例5 在冻干抗CD4单克隆抗体中加入1.0mL pH值为7.2的PBS液溶解，形成一抗保存液；溶解后的一抗保存液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封放4～8℃，可保存2～4周。
在冻干羊抗小鼠IgG致敏红细胞花环试剂中加入0.5mL pH值为7.2的PBS液溶解，形成二抗致敏红细胞保存液；溶解后的细胞悬液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封，在4～8℃可保存2～4周。
用肝素抗凝剂抽取患者空腹静脉血1.5mL，加入1.5mL pH值为7.2的无钙、镁Hank’S液，混匀后用滴管小心加在3mL淋巴细胞分离液上(10mL试管或离心管)，在22℃温度下，半径22cm的离心机以1100rpm转速离心18min。
用滴管轻轻吸出单个核细胞(BPMC)并加到盛有5～10mL pH值为7.2的无钙、镁Hank’S液的另一离心管中，尽量少吸淋巴细胞分离液；混匀后离心机以400rpm的转速离心8min，弃上清；用pH值为7.2含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液配成500万/mL淋巴细胞悬液备用。
将10μL一抗保存液，用10倍的pH值为7.2无钙、镁Hank’S液稀释形成一抗应用液。
取二抗致敏红细胞保存液25～50μL于0.2～0.5mL爱频道夫离心管中，以400rpm转速离心8min后弃去上清，用pH值为7.2含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮并恢复至原量，形成二抗致敏红细胞应用液。
将淋巴细胞悬液40μL与一抗应用液等量混合，在4℃作用30min。然后用10～25倍量pH值为7.2无钙、镁Hank’S液洗1～2次，每次以400rpm，离心8min，弃去上清，以去除未结合的单抗。再加pH值为7.2含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液40μL形成一抗致敏淋巴细胞悬液。
在40μL一抗致敏淋巴细胞悬液中，加入等量的二抗致敏红细胞应用液，混匀，在室温22℃下放置10min；以400rpm转速离心5min后在4℃静置30min。
用20μL容积的带吸头的移液器以2次/秒的均匀速度轻轻吹吸混合悬液10次；取10～15μL混合悬液按血片法推制面积8～12cm2的细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，高倍镜计数。
改良姬姆萨染色法和判定方法同实施例1。
检验结果：CD3+为71％、CD4+为25％、CD8+为45％、CD4+/CD8+为0.56。
实施例6 在冻干抗CD8单克隆抗体中加入1.0mL pH值为7.4的PBS液溶解，形成一抗保存液；溶解后的一抗保存液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封放4～8℃，可保存2～4周。
在冻干兔抗小鼠IgG致敏红细胞花环试剂中加入0.5mL pH值为7.4的PBS液溶解，形成二抗致敏红细胞保存液；溶解后的细胞悬液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封，在4～8℃可保存2～4周。
用肝素抗凝剂抽取患者空腹静脉血2.5mL，加入2.5mL pH值为7.4的无钙、镁Hank’S液，混匀后用滴管小心加在2.5mL淋巴细胞分离液上(10mL试管或离心管)，在28℃温度下，半径22cm的离心机以800rpm转速离心20min。
用滴管轻轻吸出单个核细胞(BPMC)并加到盛有5～10mLpH值为7.4的无钙、镁Hank’S液的另一离心管中，尽量少吸淋巴细胞分离液；混匀后离心机以500rpm的转速离心6min，弃上清；用pH值为7.4含20％新生小牛 血清的无钙、镁Hank’S液配成600万/mL淋巴细胞悬液备用。
将10μL一抗保存液，用10倍的pH值为7.4无钙、镁Hank’S液稀释形成一抗应用液。
取二抗致敏红细胞保存液25～50μL于0.2～0.5mL爱频道夫离心管中，以500 rpm转速离心6min后弃去上清，用pH值为7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮并恢复至原量，形成二抗致敏红细胞应用液。
将淋巴细胞悬液25μL与一抗应用液等量混合，在4℃作用30min。然后用10～25倍量pH值为7.4无钙、镁Hank’S液洗1～2次，每次以500rpm，离心6min，弃去上清，以去除未结合的单抗。再加pH值为7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液25μL形成一抗致敏淋巴细胞悬液。
在25μL一抗致敏淋巴细胞悬液中，加入等量的二抗致敏红细胞应用液，混匀，在室温28℃下放置10min；以500rpm转速离心5min后在4℃静置15min。
用20μL容积的带吸头的移液器以2次/秒的均匀速度轻轻吹吸混合悬液10次；取10～15μL混合悬液按血片法推制面积8～12cm2的细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，高倍镜计数。
改良姬姆萨染色法和判定方法同实施例1。
检验结果：CD3+为75％、CD4+为48％、CD8+为36％、CD4+/CD8+为1.33。
实施例7 取30例标本，分别采用本发明的方法和原McAb-A-E间接法进行对比试验，检验结果如下：
用SPSS10.0版统计软件经配对t检验法统计学分析，其结果如下：
两组CD3比较：t＝-0.916，P＝0.367
两组CD4比较：t＝1.229，P＝0.229
两组CD8比较：t＝-0.847，P＝0.404
两组CD4/CD8比较：t＝1.401，P＝0.172
四组结果的P值均大于0.05(P＞0.05)，差异无显著性，即本发明的方法与原McAb-A-E间接法检验结果差异无显著性。
Claims (4)
1.单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的间接法，包括下述步骤：
(1)配制一抗保存液；
(2)配制二抗致敏红细胞保存液；
(3)分离外周血淋巴细胞后用pH值为7.0～7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液配成400～600万/mL淋巴细胞悬液；
(4)将一抗保存液用10倍的pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液稀释，形成一抗应用液。
(5)取二抗致敏红细胞保存液，以300～500rpm转速离心6～10min后去上清，用pH值为7.0～7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液悬浮，形成与所取二抗致敏红细胞保存液等量的二抗致敏红细胞应用液；
(6)将淋巴细胞悬液以1∶1的体积比与一抗应用液混合并在4℃下作用30min；经pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液洗涤弃上清后，按与淋巴细胞悬液1∶1的体积比加入pH值为7.0～7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液形成一抗致敏淋巴细胞悬液；
(7)将一抗致敏淋巴细胞悬液与二抗致敏红细胞应用液以1∶1的体积比混合，在18～28℃下放置10min；以300～500rpm转速离心5min后在4℃静置15～45min；
(8)用20或25μL容积的带吸头的移液器吹吸混合悬液8～15次；取10～15μL混合悬液按血片法推制面积8～12cm2的细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，其中改良姬姆萨染色法是指将改良姬姆萨染色液原液，用无水甲醇作3倍稀释，用稀释染色液5～10滴完全覆盖细胞涂片，染色约1～2min，加pH值为6.4～6.8的PBS液5～10滴染色2～5min，用水冲洗即可；然后用高倍镜计数：淋巴细胞周围黏附有三个以上红细胞即为花环阳性细胞，未黏附红细胞者为阴性细胞，黏附一、二个红细胞者除掉不计；计数时，选取细胞涂片从头至尾的2/6～4/6之间至少两处区域共计数200个细胞，算出花环形成细胞的百分率。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的间接法，其特征在于：所述步骤(1)中的一抗保存液是通过将冻干一抗加入1.0mL pH值为7.0～7.4无钙、镁汉克氏平衡盐溶液或磷酸盐缓冲液溶解而成的，其中所述冻干一抗为冻干抗CD3、抗CD4、抗CD8单克隆抗体中的任意一种。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的间接法，其特征在于：所述步骤(2)中的二抗致敏红细胞保存液是通过将冻干二抗致敏红细胞花环试剂加入0.5mL pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液或磷酸盐缓冲液溶解而成的，其中所述冻干二抗为羊或兔抗小鼠IgG。
4.如权利要求1所述的单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的间接法，其特征在于：所述步骤(3)中的分离外周血淋巴细胞是指将采用肝素或乙二胺四乙酸抗凝剂抽取的静脉血，以1∶1～3的体积比加入pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液，混匀后加在淋巴细胞分离液上，淋巴细胞分离液与稀释血液的体积比为1∶1～3，在18～28℃温度下，以800～1200rpm的转速离心15～20min；再取出单个核细胞，并对单个核细胞用pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液洗涤，每次以300～500rpm的转速离心6～10min后弃上清制得。
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