CN102175877A - 一种微量,快速和精确检测人红细胞抗原和血清中抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微量，快速和精确检测人红细胞抗原和血清中抗体的方法。利用免疫血液学原理，在微量检测板上配备有微量已知的抗红细胞抗原抗体，加入微量未知待检的红细胞，检测红细胞膜表面抗原；或已知微量红细胞抗原的红细胞，加入微量未知待检的血清，检测人体血液中存在的抗红细胞膜表面抗原抗体。它的反应标识为红细胞聚集，有聚集的为阳性反应，无聚集的为阴性反应，结合着离心机，分光光度计，显微镜和电脑程序，可以快速，准确和自动化的检测红细胞的抗原以及在血清中的抗体。而利用这种方法制备的微量检测板试剂盒在医学方面的应用，可大大提高临床红细胞配型的安全性，高效率，准确度并降低了检测费用，促进了临床血液应用的发展。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用免疫血液学原理快速、准确地检测人红细胞血型抗原和血清中存在的抗体的方法，具体地说是一种微量，快速和精确检测人红细胞抗原和血清中抗体的方法。
背景技术
在1901年Kaul Landsteiner证明，当人群之间相互输血时，由于红细胞的血型不同可以引起被输血者有发烧，黄疸，他因此把血型分成A，B，和O型，而且在实际应用中也说明在血型之间相符的人群间输血是不会有输血反应的。1902年A.Decastrello和A.Sturli发现了AB血型。1940年由Levine和Stetson发现了Rh血型，这是根据红细胞膜是否存在这种抗原而把血型分为Rh阳性(也称为D+)为含有这种抗原，Rh阴性(也称为D-)为不含有这种抗原。现在已经清楚，98％以上的中国人为Rh阳性，而白种人仅有70％为Rh阳性。
检测红细胞膜表面的抗原和血清中的抗体来自于血液免疫学的发展，随着科学家可以分离这种抗体和抗原，并利用这些抗体和抗原去检测相应红细胞膜表面的抗原和血清中的抗体，从而现已明确在A型红细胞抗原的人都有B型抗体在血浆里，B型红细胞抗原的人都有A型抗体在血浆里，而O型红细胞抗原的人都有A，B型抗体在血浆里，AB型红细胞抗原的人都无A，B，抗体存在血浆里。
在1950年Watkins and Morgan(Nature 180：1038-1040，1957)首先分析了红细胞膜的抗原结构并纯化了许多抗原，发现了红细胞膜表面含有更多的抗原系统，同时，利用这些已知的抗原也检测出在血浆中存在着更多的抗体，而在1980年以后单克隆抗体的发明更进一步的加速了红细胞抗原的发现和发展。许多红细胞抗原的单克隆抗体的发现和生产，促进了更多抗原的发现也加速了这些抗原和抗体在临床上的应用。
市场上可利用的单克隆或多克隆抗体大都用来测定红细胞的表面抗原，像A，B和D，而常用的方法就是红细胞凝聚实验。即红细胞抗原和相应，已知的抗体结合后会产生红细胞聚集反应，这种方法称为正向红细胞配型，而采用相应，已知的红细胞抗原和未知的抗体结合后产生红细胞聚集反应，这种方法称为反向红细胞配型，为了更精确的配型，临床上都同时采用这二种方法去检测红细胞血型。
在常规的红细胞配型实验中，待检测红细胞和已知抗体，或待检测血清和已知红细胞抗原，分别在玻璃片，试管，凝胶，检查板混合，通常用于对A，B，O红细胞抗原的测定，而对D型抗原则采用oomb’s方法，即在待检测红细胞和抗D抗原抗体混合以后，还需加抗人免疫球蛋白抗体，然后才会出现凝结反应，这也称为间接红细胞凝结实验。
在1980年后兴起的单克隆抗体技术，加速了这些抗原的鉴定和发展，由于这些抗体的精确反应以及来源稳定，现在已经替代了大部分在临床上应用的多克隆抗体，但其价格上也比多克隆抗体为贵。应用玻璃片的方法简单，快速，但消耗试剂多而且不是很精确；消耗时间，效率低下；试管方法精确，但费时，费试剂，效率低，结果不能保存；凝胶方法精确，结果能保存，但费时，费试剂，效率低；检查板方法结果能保存，快速，可以方便自动化操作，效率高但费试剂，结果不能保存，操作麻烦，无直观性而且有时会出现误差，而需人工复查。
发明内容
本发明的目的及所要解决的技术问题是提供一种微量，快速和精确检测人红细胞抗原和血清中抗体的方法。该方法指明了检测人红细胞抗原和血清中抗体的保存反应结果及供以后复查的途径，并指出了在提高和保证了血液制品的安全应用的前提下制备成各种各样的红细胞配型微量板提供给临床应用的途径。
为此，本发明解决所述问题的技术方案是：一种微量，快速和精确检测人体红细胞抗原和血清中抗体的方法，包括如下步骤：选微型配型板步骤，其板型为30，60，72或其它孔微型配型板，用以测定红细胞抗原和血清抗体；
遴选抗体步骤，在所述微型版中的抗红细胞抗原抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，可以是液状抗体，也可以是干燥粉状抗体；遴选红细胞步骤，在所述微型版中的红细胞可以是新鲜红细胞，也可以是冰冻红细胞，也可以是冷冻干燥红细胞，也可以是红细胞膜；分别进行制备正向红细胞凝结及反向红细胞配型检测盒的步骤，其中，所述制备正向红细胞凝结检测盒的步骤包括用于检测每个人血清内的、包括A，B，O；Rh等抗原系统、P，MNS，Kell，Luthern，Kell，Duffy和Kidd等红细胞系统，以及任何其它有关的红细胞系统的检测方法，即在所述微型版中的每个孔内加入1微升或以上的已知单克隆或多克隆抗红细胞抗原的抗体，制备成用于检测每个人的红细胞表型抗原抗体检测盒；所述制备反向红细胞配型检测盒是指为用于测定红细胞抗原而在所述微型配型板预先放入孔内1微升或以上的已知单克隆或多克隆抗红细胞抗原的抗体用于检测红细胞抗原，制备成用于检测每个人的红细胞表型抗原抗体检测盒；
直接反应或间接反应检测人血清内的抗红细胞抗体或红细胞抗原系统的步骤，其中，直接反应是观察抗体和抗原直接的免疫反应引起的红细胞凝集现象；间接反应是将抗体和抗原在摄氏37度，四度孵育一定时间15、30分钟以后，洗去多余的抗体和抗原，加入第二抗体，像抗人体免疫球蛋白，从而产生的间接的免疫反应的红细胞凝集现象，用于鉴定相应的抗体或抗原；
检测人体血清内的抗红细胞抗体或红细胞抗原系统的免疫反应步骤，通过外加各种试剂去加强免疫反应，其中，可采用白蛋白，聚多糖等去增强免疫反应；
检测抗体和抗原免疫反应引起的红细胞凝集现象的步骤，可以通过放大镜或显微镜，判断分析红细胞凝集现象，判断血清抗体或抗原；
筛选血液中存在的抗红细胞抗原的抗体的步骤，即先用1微升红细胞和血清反应，如若有红细胞聚集反应，然后再进一步检测具体的抗红细胞抗体。
优选的，所述检测抗体和抗原免疫反应引起的红细胞凝集现象的步骤，包括采取所述微型血型检测板的数据且将所采集的数据与计算机实时连接的步骤，通过计算机分析红细胞凝集现象，判断血清抗体或抗原，也可把红细胞凝集现象保存在计算机内供以后分析或也可与分光光度计机相连接，结合着计算机，成为半自动化或自动化分析红细胞凝集现象，判断血清抗体或抗原。
优选的，所述的配型板可以供临床或血库应用，其中，所述正向红细胞配型板的应用方式是，在所述配型板中加入1微升单克隆或多克隆抗体和5微升矿物油放于深低温冰箱存放，并以干冰保存运输给临床或血库应用，而所述的反向红细胞配型板的应用方式是，在所述配型板中加入1微升新鲜红细胞或红细胞膜蛋白和5微升矿物油放于深低温冰箱存放，并以干冰保存运输给临床或血库应用。
优选的，所述方法还包括采用微量血量判断血型抗原或抗体的步骤，其步骤是，检测者可以通过静脉，也可以从末梢血管收集全血，经离心后分离出血清和红细胞，红细胞用正常生理盐水稀释到1％到3％，取出1微升稀释的红细胞加入到所述微型配型板的孔中，再离心30秒到1分钟，离心速度在300到1000rpm，然后用吹风或摇晃打散离心后的红细胞，由此可从所述微型配型板直接用显微镜观察结果，并根据红细胞凝聚的程度，将其凝聚结果打分，从0加号到4个加号；0加号为没有红细胞凝聚，为阴性反应，不存在相应的抗原，而4个加号为强阳性，存在相应的抗原。
优选的，所述方法还包括适用于需Coom’s反应的间接反应正向配型检测某些红细胞抗原的步骤，其步骤是，针对Rh系统，将抗原(红细胞)和抗体(微型孔中的抗体)混合后，在37度孵育15到30分钟，然后离心，离心后的红细胞加入正常生理盐水洗涤红细胞3次，然后加入1微升抗免疫球蛋白抗体，离心30秒到1分钟，离心速度在300到1000rpm，然后用吹风或摇晃打散离心后的红细胞，此后微型配型板可以直接用显微镜观察结果；根据红细胞凝聚的程度，可以把凝聚结果打分，从0加号到4个加号。0加号为没有红细胞凝聚，为阴性反应，不存在相应的抗原，而4个加号为强阳性，存在相应的抗原。
优选的，所述方法还包括利用所述的微型配型板进行交叉配型的步骤，即采用微型配型板，在每一个微型孔内加入1微升已知需输血病人的红细胞新鲜红细胞和需用血的血浆1微升混合，也可用在每一个微型孔内加入1微升已知需输血病人的血浆和需用血的红细胞1微升混合，从而发生免疫反应，最后筛选病人可用的输血来源。
优选的，所述微型血型检测板的数据且将所采集的数据与计算机实时连接的步骤还包括将所述的微型血型检测板与至少一台显微镜、低速离心机相连接或与带有光电比色机的自动化检测系统相连接，由所述光电比色机通过所述自动化检测系统自动报告微型血型检测板的微型孔中红细胞的凝集程度，并可将凝聚结果根据透光度记分，从0加号到4个加号，0加号为没有红细胞凝聚，为阴性反应，而4个加号为强阳性；或者通过所述配型板、显微镜、光电比色机、电脑与打印机的连接，完成血型配型的自动化过程步骤。
优选的，所述完成血型配型的自动化过程步骤还包括利用电脑分析解决复杂的红细胞凝聚反应的分析、出具血型配型正向和反向配型的分析和报告、检测个体含有血型抗体的分析和判断、从所述配型板的配型孔的红细胞凝聚反应中找出特定存在个体血液中的抗红细胞抗体，并通过配型板的加样，由所述电脑输入待检人的名字和号码，并经电脑自动报告血型配型结果并储存待检人的血型信息以及所述配型板上各孔的反应结果及红细胞凝聚情况，或者通过有线、无线、网络的传输方式远程输送配型信息到其它需要此信息的单位。
相比现有技术，本发明具有的积极效果是：利用免疫血液学原理，在微量检测板上配备有微量(1微升)已知的抗红细胞抗原抗体，加入微量(1微升)未知待检的红细胞，检测红细胞膜表面抗原；或已知微量(1微升)红细胞抗原的红细胞，加入微量(1微升)未知待检的血清，检测人体血液中存在的抗红细胞膜表面抗原抗体。它的反应标识为红细胞聚集，有聚集的为阳性反应，无聚集的为阴性反应，结合着离心机，分光光度计，显微镜和电脑程序，可以快速，准确和自动化的检测红细胞的抗原以及在血清中的抗体。本方法不但可用于A，B，O血型系统，而且也可用于Rh，JK，MNs，Fy等系统的红细胞抗原检测，除了采用各种不同的单克隆抗体外，所采用的红细胞可以是新鲜采取的，也可是冰冻红细胞，也可以是红细胞膜，常检测的红细胞C，-c，-E，-e，-K，-k，-Lea，-Leb，-JKa，-JKb，-Fya，-Fyb，-P1，-M，-N，-S，and-s，并可制备成各种各样的相应的红细胞配型微量板提供给临床应用。而利用这种方法制备的微量检测板试剂盒在医学方面的应用，可大大提高临床红细胞配型的安全性，高效率，准确度并降低了检测费用，促进了临床血液应用的发展。同时，本发明涉及的方法还能保存反应结果供以后的复查，并可以用电脑程序分析检测结果，以联网的方式发送检测结果。
附图说明
图1是实施本发明检测方法的流程示意图。
具体实施方式
参见图1，本发明描述的是采用微量配型板去检测红细胞的抗原或血清中相应的抗体。本发明的目的就是用来检测每个人的红细胞抗原，像ABO；Rh，P，MNS，Kell，Luthern，Kell，Duffy和Kidd等红细胞系统，以及任何其它有关的红细胞系统中的抗原。
其中，红细胞抗原检测的正向配型：本发明的方法之一是直接测定红细胞的表面抗原。成熟的红细胞膜表面都含有大量的抗原，这些抗原分别分由不同的蛋白或糖原组成，形成各种抗原族。在人类目前至少已经发现23个抗原族。ABO抗原族是最重要的血型抗原族，是输血能否相合最重要的因素。Rh血型抗原族具有强烈的免疫抗原性，极易在Rh阴性的病人产生抗Rh抗体而引起输血的免疫反应。在正常人群中，血型为A的人，其红细胞含有A抗原，而其血液中含有B抗原抗体；血型为B的人，其红细胞含有B抗原，而其血液中含有A抗原抗体；血型为AB的人，其红细胞含有AB抗原，而其血液中不含有ABO抗原族抗体；血型为O的人，其红细胞不含ABO抗原族抗原，而其血液中含有抗A和抗B抗原抗体。
ABO和Rh抗原族是红细胞血型抗原中最重要的的血型抗原族，是能否用于输血的最重要的因素。来自于小鼠的单克隆抗体已经广泛应用于临床。在本发明中，我们既可采用来自于人体的多克隆抗体，但在大多数情况下，我们采用的是单克隆抗体，用于对ABO和Rh血型抗原族进行红细胞抗原检测的正向配型。像检测ABO和Rh抗原族一样，该发明采用来自于小鼠的单克隆抗体既可采用来自于人体的多克隆抗体也采用是单克隆抗体，对除了ABO和Rh血型抗原族以外的红细胞抗原进行正向配型检测，这些抗原有P，MNS，Kell，Luthern，Kell，Duffy和Kidd等红细胞系统，以及任何其它有关的红细胞系统中的抗原。这也称为红细胞血型抗原的抗原表型检测(Phonotype)。
本发明的检测方法就是，采用微型配型板，在每一个微型孔内加1微升抗红细胞抗体，像抗A，B，D，P，MNS，Kell，Luthern，Kell，Duffy和Kidd等红细胞系统的抗体，以及任何其它有关的红细胞系统中的抗原的抗体，并覆盖一定含量的矿物油，以避免抗体蒸发，未知的新鲜红细胞加入微量孔内，从而发生免疫反应，导致红细胞聚集，从已知加入的抗体可以决定相应的红细胞抗原。可以通过静脉，也可以从末梢血管，像手指，耳垂收集全血，离心后分离血清和红细胞，红细胞用正常生理盐水稀释到1％到3％。取出1微升稀释的红细胞加入到微型配型板的孔中，离心30秒到1分钟，离心速度在300到1000rpm，然后用吹风或摇晃打散离心后的红细胞，此后微型配型板可以直接用显微镜观察结果。根据红细胞凝聚的程度，可以把凝聚结果打分，从0加号到4个加号。0加号为没有红细胞凝聚，为阴性反应，不存在相应的抗原，而4个加号为强阳性，存在相应的抗原。
同理，本发明的检测方法也适用于需Coom’s反应的间接反应正向配型检测莫些红细胞抗原，像Rh系统，就是在抗原(红细胞)和抗体(微型孔中的抗体)混合后，在37度孵育15到30分钟，然后离心，离心后的红细胞加入正常生理盐水洗涤红细胞3次，然后加入1微升抗免疫球蛋白抗体，离心30秒到1分钟，离心速度在300到1000rpm，然后用吹风或摇晃打散离心后的红细胞，此后微型配型板可以直接用显微镜观察结果。根据红细胞凝聚的程度，可以把凝聚结果打分，从0加号到4个加号。0加号为没有红细胞凝聚，为阴性反应，不存在相应的抗原，而4个加号为强阳性，存在相应的抗原。所采用的微型板是30，60或72孔板，每个孔含有1到2微升抗已知红细胞抗原的单克隆或多克隆抗体，覆盖有5微升矿物油，储存在负20到负70度冰箱保存，采用干冰运输给临床应用。
血清抗体检测的反向配型，本发明的方法也可用于直接测定血清中抗红细胞表面抗原的抗体。成熟的红细胞膜表面都含有大量的抗原，这些抗原分别分由为不同的蛋白或糖原组成，形成各种抗原族。在人类目前至少已经发现23个抗原族。ABO抗原族是最重要的血型抗原族，是输血能否相合最重要的因素。Rh血型抗原族具有强烈的免疫抗原性，极易在Rh阴性的病人产生抗Rh抗体而引起输血的免疫反应。所采用的微型板是30，60或72孔板，每个孔含有1到2微升已知红细胞抗原的新鲜红细胞或冰冻红细胞，也可为提纯的红细胞膜，覆盖有5微升矿物油，储存在负20到负70度冰箱保存，采用干冰运输给临床应用。在正常人群中，血型为A的人，其红细胞含有A抗原，而其血液中含有B抗原抗体；血型为B的人，其红细胞含有B抗原，而其血液中含有A抗原抗体；血型为AB的人，其红细胞含有AB抗原，而其血液中不含有ABO抗原族抗体；血型为O的人，其红细胞不含ABO抗原族抗原，而其血液中含有抗A和抗B抗原抗体。通过检测血清中存在的抗体也可反向鉴定个人的ABO系统血型。像检测ABO系统抗体一样，该发明采用来自于含有各种红细胞表型(Phenotype)的已知红细胞抗原的新鲜红细胞或冰冻红细胞检测Rh，P，MNS，Kell，Luthern，Kell，Duffy和Kidd等红细胞系统的血清内存在的抗体，常用来对出现输血反应的多次输血病人抗体的筛选。其中，本发明的检测方法就采用微型配型板，在每一个微型孔内加1微升已知红细胞抗原的新鲜红细胞或冰冻红细胞，每孔中所含抗原的表型是不同的，并覆盖一定含量的矿物油，以避免液体蒸发，待测未知的血清加入微量孔内，从而发生免疫反应，导致红细胞聚集，从聚集的已知红细胞抗原不同微型孔中用计算机排比组合计算出血清中存在的抗红细胞抗体。
本方法可以通过静脉，也可以从末梢血管，像手指，耳垂收集全血，离心后分离血清和红细胞，取出血清，每孔加入1微升血清到微型配型板，离心30秒到1分钟，离心速度在300到1000rpm，然后用吹风或摇晃打散离心后的红细胞，此后微型配型板可以直接用显微镜观察结果。根据红细胞凝聚的程度，可以把凝聚结果打分，从0加号到4个加号。0加号为没有红细胞凝聚，为阴性反应，不存在相应的抗体，而4个加号为强阳性，存在相应的抗体。
本发明的检测方法也适用于需Coom’s反应的间接反应反向配型检测血清中莫些抗红细胞抗原的抗体，像Rh，P，MNS，Kell，Luthern，Kell，Duffy和Kidd系统，就是在抗原(血清)和抗体(微型孔中的红细胞)混合后，在37度孵育15到30分钟，然后离心，离心后的红细胞加入正常生理盐水洗涤红细胞3次，然后加入1微升抗免疫球蛋白抗体，离心30秒到1分钟，离心速度在300到1000rpm，然后用吹风或摇晃打散离心后的红细胞，此后微型配型板可以直接用显微镜观察结果。根据红细胞凝聚的程度，可以把凝聚结果打分，从0加号到4个加号。0加号为没有红细胞凝聚，为阴性反应，不存在相应的抗体，而4个加号为强阳性，存在相应的抗体。在这个微型版内都含有阴性和阳性对照以保证检测的可靠性。所采用的微型板是30，60或72孔板，每个孔含有1到2微升已知红细胞抗原的新鲜或冰冻红细胞，覆盖有5微升矿物油，储存在负20到负70度冰箱保存，采用干冰运输给临床应用。
与此同时本发明设计了电脑软件和相应的自动化检测方法，微型血型检测吧板可根据临床的不同需要，配备有不同的设备和软件。对一个小型医院或血库，每天的用血量不大，仅仅配备一台显微镜和低速离心机就能完成血型配型任务。对一个中性型以上医院或血库，每天的用血量较大，不仅仅需配备显微镜和低速离心机，而且应该形成自动化检测，这包括微型配型板和光电比色机相连，机器能够通过比色原理，自动报告微型孔中红细胞的凝集程度，可以把凝聚结果根据透光度记分，从0加号到4个加号。0加号为没有红细胞凝聚，为阴性反应，而4个加号为强阳性。电脑的发展加速了血型配型的自动化发展，配型板，显微镜，光电比色机，电脑和打印机的联合，完成了血型配型的自动化过程，通过配型板的加样，电脑输入待检人的名字和号码，，电脑可以自动报告血型配型结果，储存待检人的血型信息，储存微型版上各孔反应结果，红细胞凝聚情况，而且还可远程输送配型信息到其它需要此信息的单位。电脑的发展不但加速了血型配型的自动化发展而且可以利用电脑分析解决复杂的红细胞凝聚反应的分析，小到血型配型正向和反向配型的分析和报告，大到检测个体含有血型抗体的分析和判断，从几十种，甚至上百种配型孔中的红细胞凝聚反应中找出特定存在个体血液中的抗红细胞抗体，大大的节省了配型时间，增强了配型的准确性。
根据以上说明还有如下实施例：
例一，微型板检测红细胞A，B，O和Rh抗原。
在本例中，30，60，或72孔的微型板检测里含抗A，抗B和抗D抗体，或A，B，O红细胞，加入待检人的红细胞和血清，检测红细胞A，B和D抗原和抗体，表一是配型板各孔包括的抗体和红细胞。
表一：红细胞I-A，-B，-D抗原，抗体检测板
所采用的微型板是30，60或72孔板，每个孔含有1到2微升抗已知红细胞抗原的单克隆或多克隆抗体，覆盖有5微升矿物油。每一个配型板内都具有阳性和阴性对照，第一行为质量控制检测微型版的配型可靠性。余下部分的孔分别加入Anti-A；Anti-B；和Anti-D抗体，这些孔是用于红细胞的正向配型。余下的另部分的孔分别加入A1 Cel；I B Cell；和A，B Cell，这些孔是用于红细胞的反向配型。
待测人可以通过静脉，也可以从末梢血管，像手指，耳垂收集全血，离心后分离血清和红细胞，红细胞用正常生理盐水稀释到1％到3％。取出1微升稀释的红细胞加入到微型配型板的正向孔中，而血清1微升加入反向孔中，离心30秒到1分钟，离心速度在300到1000rpm，然后用吹风或摇晃打散离心后的红细胞，此后微型配型板可以直接用显微镜观察结果。根据红细胞凝聚的程度，可以把凝聚结果打分，从0加号到4个加号。0加号为没有红细胞凝聚，为阴性反应，不存在相应的抗原或抗体，而4个加号为强阳性，存在相应的抗原或抗体。
例二，微型板检测红细胞表型抗原(Phenotype)。
在本例子中，30，60，或72孔的微型板检测里含除了抗AB O系统以外的抗体，加入待检人的红细胞，检测红细胞AB O系统以外的抗原，表二是配型板各孔包括的抗体。
Table 二：红细胞表型检测板
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| A | Anti-E | Anti-e | Anti-C | Anti-c | Anti-K | Anti-k |
| B | Anti-E | Anti-e | Anti-C | Anti-c | Anti-K | Anti-k |
| C | Anti-Fya | Anti-Fyb | Anti-JKa | Anti-JKb | Anti-Lea | Anti-Leb |
| D | Anti-Fya | Anti-Fyb | Anti-JKa | Anti-JKb | Anti-Lea | Anti-Leb |
| E | Anti-M | Anti-N | Anti-S | Anti-s | Anti-P | |
| F | Anti-M | Anti-N | Anti-S | Anti-s | Anti-P |
应用的微型配型板，在每一个微型孔内加1微升抗红细胞抗体，像抗Rh，P，MNS，Kell，Luthern，Kell，Duffy和Kidd等红细胞系统的抗体，以及任何其它有关的红细胞系统中的抗原的抗体，并覆盖一定含量的矿物油，以避免抗体蒸发，未知的新鲜红细胞加入微量孔内，从而发生免疫反应，导致红细胞聚集，从已知加入的抗体可以决定相应的红细胞抗原。
待测人可以通过静脉，也可以从末梢血管，像手指，耳垂收集全血，离心后分离血清和红细胞，红细胞用正常生理盐水稀释到1％到3％。取出1微升稀释的红细胞加入到微型配型板的正向孔中，而血清1微升加入孔中，离心30秒到1分钟，离心速度在300到1000rpm，然后用吹风或摇晃打散离心后的红细胞，此后微型配型板可以直接用显微镜观察结果。根据红细胞凝聚的程度，可以把凝聚结果打分，从0加号到4个加号。0加号为没有红细胞凝聚，为阴性反应，不存在相应的抗原，而4个加号为强阳性，存在相应的抗原。
本发明的检测方法也适用于需Coom’s反应的正向配型检测红细胞抗原，像Rh系统，就是在抗原(红细胞)和抗体(微型孔中的抗体)混合后，在37度孵育15到30分钟，然后离心，离心后的红细胞加入正常生理盐2水洗涤红细胞3次，然后加入1微升抗免疫球蛋白抗体，离心30秒到1分钟，离心速度在300到1000rpm，然后用吹风或摇晃打散离心后的红细胞，此后微型配型板可以直接用显微镜观察结果。根据红细胞凝聚的程度，可以把凝聚结果打分，从0加号到4个加号。0加号为没有红细胞凝聚，为阴性反应，不存在相应的抗原，而4个加号为强阳性，存在相应的抗原。
例三，微型板筛选抗红细胞表型抗原抗体。
在下中例中，30，60，或72孔的微型板检测里含已知红细胞抗原的新鲜或冰冻红细胞，加入待检人的血清，筛选血清内含有的抗红细胞抗体，表三是配型板各孔包括的红细胞。
表三：血清抗体筛选板
所采用的微型板是30，60或72孔板，每个孔含有1到2微升已知红细胞抗原的新鲜红细胞或冰冻红细胞，覆盖有5微升矿物油。像检测ABO系统抗体一样，该发明采用来自于含有各种红细胞表型(Phenotype)的已知红细胞抗原的新鲜红细胞或冰冻红细胞检测Rh，P，MNS，Kell，Luthern，Kell，Duffy和Kidd等红细胞系统的血清内存在的抗体。待测人可以通过静脉，也可以从末梢血管，像手指，耳垂收集全血，离心后分离血清和红细胞，血清1微升加入反向孔中，离心30秒到1分钟，离心速度在300到1000rpm，然后用吹风或摇晃打散离心后的红细胞，此后微型配型板可以直接用显微镜观察结果。根据红细胞凝聚的程度，可以把凝聚结果打分，从0加号到4个加号。0加号为没有红细胞凝聚，为阴性反应，不存在相应的抗体，而4个加号为强阳性，存在相应的抗体。本发明的检测方法就是，采用微型配型板，在每一个微型孔内加1微升已知红细胞抗原的新鲜红细胞或冰冻红细胞，每孔中所含抗原的表型是不同的，并覆盖一定含量的矿物油，以避免液体蒸发，待测未知的血清加入微量孔内，从而发生免疫反应，导致红细胞聚集，从聚集的已知红细胞抗原不同微型孔中用计算机排比组合计算出血清中存在的抗红细胞抗体。
本发明的检测方法也适用于需Coom’s反应的间接反应反向配型检测血清中莫些抗红细胞抗原的抗体，像Rh，P，MNS，Kell，Luthern，Kell，Duffy和Kidd系统，就是在抗原(血清)和抗体(微型孔中的红细胞)混合后，在37度孵育15到30分钟，然后离心，离心后的红细胞加入正常生理盐水洗涤红细胞3次，然后加入1微升抗免疫球蛋白抗体，离心30秒到1分钟，离心速度在300到1000rpm，然后用吹风或摇晃打散离心后的红细胞，此后微型配型板可以直接用显微镜观察结果。根据红细胞凝聚的程度，可以把凝聚结果打分，从0加号到4个加号。0加号为没有红细胞凝聚，为阴性反应，不存在相应的抗体，而4个加号为强阳性，存在相应的抗体。在这个微型版内都含有阴性和阳性对照以保证检测的可靠性。
例四，微型板鉴定抗红细胞表型抗原抗体。
在本例子中，30，60，或72孔的微型板检测里含已知红细胞抗原的新鲜或冰冻红细胞，加入待检人的血清，鉴定血清内含有的抗红细胞抗体，表四是配型板各孔包括的红细胞。
本例中所采用的微型板是30，60或72孔板，每个孔含有1到2微升已知红细胞抗原的新鲜红细胞或冰冻红细胞，覆盖有5微升矿物油。像检测ABO系统抗体一样，该发明采用来自于含有各种红细胞表型(Phenotype)的已知红细胞抗原的新鲜红细胞或冰冻红细胞检测Rh，P，MNS，Kell，Luthern，Kell，Duffy和Kidd等红细胞系统的血清内存在的抗体。待测人可以通过静脉，也可以从末梢血管，像手指，耳垂收集全血，离心后分离血清和红细胞，血清1微升加入反向孔中，离心30秒到1分钟，离心速度在300到1000rpm，然后用吹风或摇晃打散离心后的红细胞，此后微型配型板可以直接用显微镜观察结果。根据红细胞凝聚的程度，可以把凝聚结果打分，从0加号到4个加号。0加号为没有红细胞凝聚，为阴性反应，不存在相应的抗体，而4个加号为强阳性，存在相应的抗体。
本发明的检测方法就是，采用微型配型板，在每一个微型孔内加1微升已知红细胞抗原的新鲜红细胞或冰冻红细胞，每孔中所含抗原的表型是不同的，并覆盖一定含量的矿物油，以避免液体蒸发，待测未知的血清加入微量孔内，从而发生免疫反应，导致红细胞聚集，从聚集的已知红细胞抗原不同微型孔中用计算机排比组合计算出血清中存在的抗红细胞抗体。
本发明的检测方法也适用于需Coom’s反应的间接反应反向配型检测血清中莫些抗红细胞抗原的抗体，像Rh，P，MNS，Kell，Luthern，Kell，Duffy和Kidd系统，就是在抗原(血清)和抗体(微型孔中的红细胞)混合后，在37度孵育15到30分钟，然后离心，离心后的红细胞加入正常生理盐水洗涤红细胞3次，然后加入1微升抗免疫球蛋白抗体，离心30秒到1分钟，离心速度在300到1000rpm，然后用吹风或摇晃打散离心后的红细胞，此后微型配型板可以直接用显微镜观察结果。根据红细胞凝聚的程度，可以把凝聚结果打分，从0加号到4个加号。0加号为没有红细胞凝聚，为阴性反应，不存在相应的抗体，而4个加号为强阳性，存在相应的抗体。在这个微型版内都含有阴性和阳性对照以保证检测的可靠性。
本发明的检测方法也可应用于交叉配型，即采用微型配型板，在每一个微型孔内加入1微升已知需输血病人的红细胞新鲜红细胞和需用血的血浆1微升混合，也可用在每一个微型孔内加入1微升已知需输血病人的血浆和需用血的红细胞1微升混合，从而发生免疫反应，如果有红细胞聚集，则该血不能用，需换用其它的用血。
综上所述，本发明是用来检测红细胞膜表面抗原。该发明是采用30，60或72孔微型配型板，在每个板内加人1微升已知单克隆或多克隆抗红细胞抗原的抗体，用于检测每个人的红细胞抗原，像A，B，O；Rh等抗原系统，这种方法也称为正向红细胞凝结实验。
本发明采用已知单克隆或多克隆抗红细胞抗原的抗体的好处是明显的因为所需血量小，提供制备好的抗体检测板可以大大缩短配型时间，而且更适用于儿童，老人，急诊和重病人。
本发明是用来检测人血清内的抗红细胞抗体。该发明是采用30，60或72孔微型配型板，在每个板内加入1微升已知红细胞抗原的红细胞，用于检测每个人血清中所含的抗红细胞抗体，像抗A抗，B，抗AB等抗体。已知红细胞抗原的红细胞可以是新鲜红细胞，也可以是冰冻保存红细胞或者是红细胞膜蛋白，结合着这些已知抗原的红细胞可以筛选血清中含有的抗红细胞抗体，这种方法也称为反向红细胞凝聚实验。
本发明采用已知红细胞抗原的红细胞的配型板的好处是因节省了配型时间，而且由于配型板有阴性和阳性对照，并通过电脑分析，从而增强了配型的准确性。
本发明是采用30，60或72孔微型配型板检测红细胞膜表面抗原，用于检测每个人的红细胞抗原，不止是像A，B，O；Rh等抗原系统，而且还有P，MNS，Kell，Luthern，Kell，Duffy和Kidd等红细胞系统，以及任何其它有关的红细胞系统。
本发明是用来检测人血清内的抗红细胞抗体，这种抗红细胞抗原抗体，不止是像A，B，O；Rh等抗体系统，而且还有P，MNS，Kell，Luthern，Kell，Duffy，Fisher和Kidd等红细胞抗体系统，以及任何其它有关的红细胞抗体系统。
本发明用来检测人血清内的抗红细胞抗体或红细胞抗原系统，所采用的方法可以是直接反应，即抗体和抗原直接的免疫反应引起的红细胞凝集现象，也可以是间接反应，即抗体和抗原在37度，4度孵育一定时间(像15，30分钟)以后，洗去多余的抗体和抗原，加入第二抗体，像抗人免疫球蛋白从而产生的间接的免疫反应的红细胞凝集现象，用于鉴定相应的抗体或抗原。
本发明用来检测人血清内的抗红细胞抗体或红细胞抗原系统的免疫反应，可以外加各种试剂去加强免疫反应，像白蛋白，聚多糖(Polyethyleneglycol)等去增强免疫反应。
本发明用于抗体和抗原免疫反应引起的红细胞凝集现象可以通过放大镜，显微镜观察，也可和计算机相连接，通过计算机分析红细胞凝集现象，判断血清抗体或抗原，也可把红细胞凝集现象保存在计算机内共以后分析。
根据上述的方法，相应的配型板可以供临床或血库应用，像正向红细胞配型板，就是加入1微升单克隆或多克隆抗体和5微升矿物油放于深低温冰箱存放，并以干冰保存运输给临床或血库应用。
根据上述的方法，相应的配型板可以供临床或血库应用，像反向红细胞配型板，就是加入1微升新鲜红细胞，冰冻或红细胞或膜蛋白和5微升矿物油放于深低温冰箱存放，并以干冰保存运输给临床或血库应用。
Claims (8)
1.一种微量，快速和精确检测人体红细胞抗原和血清中抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：选微型配型板步骤，其板型为30，60，72或其它孔微型配型板，用以测定红细胞抗原和血清抗体；
遴选抗体步骤，在所述微型版中的抗红细胞抗原抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，可以是液状抗体，也可以是干燥粉状抗体；遴选红细胞步骤，在所述微型版中的红细胞可以是新鲜红细胞，也可以是冰冻红细胞，也可以是冷冻干燥红细胞，也可以是红细胞膜；
分别进行制备正向红细胞凝结及反向红细胞配型检测盒的步骤，其中，所述制备正向红细胞凝结检测盒的步骤包括用于检测每个人血清内的、包括A，B，O；Rh等抗原系统、P，MNS，Kell，Luthern，Kell，Duffy和Kidd等红细胞系统，以及任何其它有关的红细胞系统的检测方法，即在所述微型版中的每个孔内加入1微升或以上的已知单克隆或多克隆抗红细胞抗原的抗体，制备成用于检测每个人的红细胞表型抗原抗体检测盒；所述制备反向红细胞配型检测盒是指为用于测定红细胞抗原而在所述微型配型板预先放入孔内1微升或以上的已知单克隆或多克隆抗红细胞抗原的抗体用于检测红细胞抗原，制备成用于检测每个人的红细胞表型抗原抗体检测盒；
直接反应或间接反应检测人血清内的抗红细胞抗体或红细胞抗原系统的步骤，其中，直接反应是观察抗体和抗原直接的免疫反应引起的红细胞凝集现象；间接反应是将抗体和抗原在摄氏37度，四度孵育一定时间15、30分钟以后，洗去多余的抗体和抗原，加入第二抗体，像抗人体免疫球蛋白，从而产生的间接的免疫反应的红细胞凝集现象，用于鉴定相应的抗体或抗原；
检测人体血清内的抗红细胞抗体或红细胞抗原系统的免疫反应步骤，通过外加各种试剂去加强免疫反应，其中，可采用白蛋白，聚多糖等去增强免疫反应；
检测抗体和抗原免疫反应引起的红细胞凝集现象的步骤，可以通过放大镜或显微镜，判断分析红细胞凝集现象，判断血清抗体或抗原；
筛选血液中存在的抗红细胞抗原的抗体的步骤，即先用1微升红细胞和血清反应，如若有红细胞聚集反应，然后再进一步检测具体的抗红细胞抗体。
2.根据权利要求1所述的一种微量，快速和精确检测人体红细胞抗原和血清中抗体的方法，其特征在于，所述检测抗体和抗原免疫反应引起的红细胞凝集现象的步骤，包括采取所述微型血型检测板的数据且将所采集的数据与计算机实时连接的步骤，通过计算机分析红细胞凝集现象，判断血清抗体或抗原，也可把红细胞凝集现象保存在计算机内供以后分析或也可与分光光度计机相连接，结合着计算机，成为半自动化或自动化分析红细胞凝集现象，判断血清抗体或抗原。
3.根据权利要求1所述的一种微量，快速和精确检测人体红细胞抗原和血清中抗体的方法，其特征在于，所述的配型板可以供临床或血库应用，其中，所述正向红细胞配型板的应用方式是，在所述配型板中加入1微升单克隆或多克隆抗体和5微升矿物油放于深低温冰箱存放，并以干冰保存运输给临床或血库应用，而所述的反向红细胞配型板的应用方式是，在所述配型板中加入1微升新鲜红细胞或红细胞膜蛋白和5微升矿物油放于深低温冰箱存放，并以干冰保存运输给临床或血库应用。
4.根据权利要求1所述的一种微量，快速和精确检测人体红细胞抗原和血清中抗体的方法，其特征在于，所述方法还包括采用微量血量判断血型抗原或抗体的步骤，其步骤是，检测者可以通过静脉，也可以从末梢血管收集全血，经离心后分离出血清和红细胞，红细胞用正常生理盐水稀释到1％到3％，取出1微升稀释的红细胞加入到所述微型配型板的孔中，再离心30秒到1分钟，离心速度在300到1000rpm，然后用吹风或摇晃打散离心后的红细胞，由此可从所述微型配型板直接用显微镜观察结果，并根据红细胞凝聚的程度，将其凝聚结果打分，从0加号到4个加号；0加号为没有红细胞凝聚，为阴性反应，不存在相应的抗原，而4个加号为强阳性，存在相应的抗原。
5.根据权利要求1所述的一种微量，快速和精确检测人体红细胞抗原和血清中抗体的方法，其特征在于，所述方法还包括适用于需Coom’s反应的间接反应正向配型检测某些红细胞抗原的步骤，其步骤是，针对Rh系统，将抗原(红细胞)和抗体(微型孔中的抗体)混合后，在37度孵育15到30分钟，然后离心，离心后的红细胞加入正常生理盐水洗涤红细胞3次，然后加入1微升抗免疫球蛋白抗体，离心30秒到1分钟，离心速度在300到1000rpm，然后用吹风或摇晃打散离心后的红细胞，此后微型配型板可以直接用显微镜观察结果；根据红细胞凝聚的程度，可以把凝聚结果打分，从0加号到4个加号。0加号为没有红细胞凝聚，为阴性反应，不存在相应的抗原，而4个加号为强阳性，存在相应的抗原。
6.根据权利要求1所述的一种微量，快速和精确检测人体红细胞抗原和血清中抗体的方法，其特征在于，所述方法还包括利用所述的微型配型板进行交叉配型的步骤，即采用微型配型板，在每一个微型孔内加入1微升已知需输血病人的红细胞新鲜红细胞和需用血的血浆1微升混合，也可用在每一个微型孔内加入1微升已知需输血病人的血浆和需用血的红细胞1微升混合，从而发生免疫反应，最后筛选病人可用的输血来源。
7.根据权利要求2所述的一种微量，快速和精确检测人体红细胞抗原和血清中抗体的方法，其特征在于，所述微型血型检测板的数据且将所采集的数据与计算机实时连接的步骤还包括将所述的微型血型检测板与至少一台显微镜、低速离心机相连接或与带有光电比色机的自动化检测系统相连接，由所述光电比色机通过所述自动化检测系统自动报告微型血型检测板的微型孔中红细胞的凝集程度，并可将凝聚结果根据透光度记分，从0加号到4个加号，0加号为没有红细胞凝聚，为阴性反应，而4个加号为强阳性；或者通过所述配型板、显微镜、光电比色机、电脑与打印机的连接，完成血型配型的自动化过程步骤。
8.根据权利要求7所述的一种微量，快速和精确检测人体红细胞抗原和血清中抗体的方法，其特征在于，所述完成血型配型的自动化过程步骤还包括利用电脑分析解决复杂的红细胞凝聚反应的分析、出具血型配型正向和反向配型的分析和报告、检测个体含有血型抗体的分析和判断、从所述配型板的配型孔的红细胞凝聚反应中找出特定存在个体血液中的抗红细胞抗体，并通过配型板的加样，由所述电脑输入待检人的名字和号码，并经电脑自动报告血型配型结果并储存待检人的血型信息以及所述配型板上各孔的反应结果及红细胞凝聚情况，或者通过有线、无线、网络的传输方式远程输送配型信息到其它需要此信息的单位。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110907 |