CN111537735A - 抗体检测试剂盒以及在免疫分析方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗体检测试剂盒，包括程序性死亡受体1的抗体以及至少三种簇分化抗原的抗体。所述程序性死亡受体1的抗体以及每种簇分化抗原的抗体携带有不同的荧光素，所述至少三种簇分化抗原包括成熟T细胞表面标记物、辅助T细胞表面标记物和细胞毒T细胞表面标记物，能够用于快速考察PD‑1蛋白的表达情况，且所述程序性死亡受体1的抗体所携带的荧光素的染色指数高于所述每种簇分化抗原的抗体所携带的荧光素的染色指数，有利于准确考察PD‑1蛋白的表达情况。本发明还提供了所述抗体检测试剂盒在免疫分析方面的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及抗体检测试剂盒以及在免疫分析方面的应用。
背景技术
近年来，肿瘤免疫治疗取得了令人瞩目的成果，诸多临床研究已证实肿瘤免疫治疗可改善肿瘤患者的预后，显著延长患者的生存期。与此同时，肿瘤免疫治疗生物标志物的探索也成为了肿瘤免疫治疗研究的热点。
程序性死亡受体1(Programmed death-1，PD-1)是一种共刺激分子，呈诱导性表达于活化的T细胞、B细胞和NK细胞表面，PD-1与其配体PD-L1结合后，可以抑制TCR活化信号的转导，从而抑制T淋巴细胞的活化、生存以及效应功能，诱导肿瘤特异性T淋巴细胞凋亡，促进CD4+T淋巴细胞向Foxp3+Treg分化，同时抵御细胞毒性T淋巴细胞对肿瘤细胞的攻击。因此，考察PD-1蛋白的表达情况具有重要的临床意义。
公开号为CN109270265A的中国发明专利申请公开了一种人体外周血杀伤性免疫细胞功能评估试剂盒，该试剂盒包含带荧光素标记的抗人CD3抗体、抗人CD8抗体、抗人CD8抗体、抗人PD-1抗体等17种抗体。使用该试剂盒的全部17种抗体与人体外周血进行孵育后，再使用流式细胞仪对得到的检测样本进行分析，以通过获得的32项免疫功能指标评估人体外周血杀伤性免疫细胞的免疫功能。然而，该种试剂盒的抗体种类繁多，且无法直观清晰地考察PD-1蛋白的表达情况，且提高了检测成本。
因此，有必要开发一种新型的抗体检测试剂盒以及检测方法以解决现有技术中存在的上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗体检测试剂盒以及所述抗体检测试剂盒在免疫分析方面的应用，以准确快速考察PD-1蛋白的表达情况，同时降低检测成本。
为实现上述目的，本发明的所述抗体检测试剂盒包括程序性死亡受体1的抗体以及至少三种簇分化抗原的抗体，所述至少三种簇分化抗原包括成熟T细胞表面标记物、辅助T细胞表面标记物和细胞毒T细胞表面标记物；所述程序性死亡受体1的抗体以及每种簇分化抗原的抗体携带的荧光素各不相同。
本发明的所述抗体检测试剂盒的有益效果在于：所述抗体检测试剂盒包括的程序性死亡受体1的抗体以及每种簇分化抗原的抗体携带有不同的荧光素，所述至少三种簇分化抗原包括成熟T细胞表面标记物、辅助T细胞表面标记物和细胞毒T细胞表面标记物，能够用于快速考察PD-1蛋白的表达情况。
优选的，所述成熟T细胞表面标记物包括CD3，所述辅助T细胞表面标记物包括CD4，所述细胞毒T细胞表面标记物包括CD8。其有益效果在于：通过CD4和CD8考察PD-1蛋白的表达情况，提高结果的准确性。
进一步优选的，所述至少三种簇分化抗原还包括CD45。
优选的，所述程序性死亡受体1的抗体以及所述至少三种簇分化抗原的抗体均为单克隆抗体。其有益效果在于：有利于提高抗体检测试剂盒的灵敏度和特异性。
进一步优选的，所述程序性死亡受体1的抗体以及所述至少三种簇分化抗原的抗体均为鼠抗人抗体。
优选的，所述程序性死亡受体1的抗体所携带的荧光素的染色指数高于所述每种簇分化抗原的抗体所携带的荧光素的染色指数。其有益效果在于：有利于后续的流式细胞术分析中提高细胞阳性率的准确性。
进一步优选的，所述程序性死亡受体1的抗体所携带的荧光素为藻红蛋白。
进一步优选的，所述成熟T细胞表面标记物的抗体和所述辅助T细胞表面标记物的抗体中的任意一种所携带的荧光素为异硫氰酸，另一种所携带的荧光素为别藻蓝蛋白，所述细胞毒T细胞表面标记物的抗体所携带的荧光素为PerCP-Cy5.5和PE-Cy7中的任意一种，所述CD45的抗体所携带的荧光素为PerCP-Cy5.5和PE-Cy7中的任意一种。
优选的，所述程序性死亡受体1的抗体以及每种簇分化抗原的抗体分别容纳于不同的容器中，以形成不同的检测试剂。其有益效果在于：便于根据不同的检测需求任意组合使用。
进一步优选的，所述检测试剂为液态试剂或粉剂，所述液态试剂中，所述程序性死亡受体1的抗体的浓度为0.8微克/毫升-1.2微克/毫升，所述成熟T细胞表面标记物的抗体的浓度为2微克/毫升-3微克/毫升，所述辅助T细胞表面标记物的抗体的浓度为1.3微克/毫升-1.8微克/毫升，所述细胞毒T细胞表面标记物的抗体和所述CD45的抗体中的任意一种的浓度为4.8微克/毫升-7.2微克/毫升。
本发明的所述抗体检测试剂盒在免疫分析方面的应用包括：将待检测样本、所述程序性死亡受体1的抗体以及所述至少三种簇分化抗原的抗体相混合后进行孵育处理和重悬处理，然后通过流式细胞术进行所述免疫分析。其有益效果在于：使用流式细胞术进行所述免疫分析，以提高检测结果的准确性。
优选的，当所述至少三种簇分化抗原包括CD3、CD4和CD8，所述免疫分析包括统计CD3+CD4+PD-1+的细胞阳性率以及统计CD3+CD8+PD-1+的细胞阳性率。
进一步优选的，所述免疫分析包括统计CD3+CD4+的细胞阳性率以及统计CD3+CD8+的细胞阳性率，并根据所述CD3+CD4+的细胞阳性率和所述CD3+CD8+的细胞阳性率统计所述CD3+CD4+PD-1+的细胞阳性率以及所述CD3+CD8+PD-1+的细胞阳性率。
进一步优选的，当所述至少三种簇分化抗原还包括CD45，所述免疫分析还包括统计CD45+CD3+的细胞阳性率。
附图说明
图1为本发明实施例1的以携带有FITC的CD3细胞数目为X轴，侧向散射光强度为Y轴的细胞群散点图；
图2为本发明实施例1的以携带有FITC的CD3细胞数目为X轴，携带有APC的CD4细胞数目为Y轴的细胞群散点图；
图3为本发明实施例1的以携带有PE的PD-1细胞数目为X轴，侧向散射光强度为Y轴的细胞群散点图；
图4为本发明实施例1的以携带有FITC的CD3细胞数目为X轴，携带有PerCP-Cy5.5的CD8细胞数目为Y轴的细胞群散点图；
图5为本发明实施例1的以携带有PE的PD-1细胞数目为X轴，侧向散射光强度为Y轴的细胞群散点图；
图6为本发明实施例2的以携带PE-Cy7的CD45的细胞数目为X轴，侧向散射光强度为Y轴得到的细胞群散点图；
图7为本发明实施例2的以携带有FITC的CD3的细胞数目为X轴，侧向散射光强度为Y轴的细胞群散点图；
图8为本发明实施例2的以携带有FITC的CD3的细胞数目为X轴，携带APC的CD4的细胞数目为Y轴的细胞群散点图；
图9为本发明实施例2的以携带有PE的PD-1的细胞数目为X轴，侧向散射光强度为Y轴的细胞群散点图；
图10为本发明实施例2的以携带有FITC的CD3的细胞数目为X轴，携带PerCP-Cy5.5的CD8的细胞数目为Y轴的细胞群散点图；
图11为本发明实施例2的以携带有PE的PD-1的细胞数目为X轴，侧向散射光强度为Y轴的细胞群散点图；
图12为本发明实施例3的以携带APC的CD3细胞数目为X轴，侧向散射光强度为Y轴得到的细胞群散点图；
图13为本发明实施例3的以携带APC的CD3细胞数目为X轴，携带FITC的CD4的细胞数目为Y轴得到的细胞群散点图；
图14为本发明实施例3的以携带PE的PD-1细胞数目为X轴，侧向散射光强度为Y轴得到的细胞群散点图；
图15为本发明实施例3的以携带APC的CD3细胞数目为X轴，携带PerCP-Cy5.5的CD8的细胞数目为Y轴得到的细胞群散点图；
图16为本发明实施例3的以携带PE的PD-1细胞数目为X轴，侧向散射光强度为Y轴得到的细胞群散点图；
图17为本发明实施例4的以携带PerCP-Cy5.5的CD45的细胞数目为X轴，SSC强度为Y轴的细胞群散点图；
图18为本发明实施例4的以携带有FITC的CD3的细胞数目为X轴，侧向散射光强度为Y轴的细胞群散点图；
图19为本发明实施例4的以携带有FITC的CD3的细胞数目为X轴，携带APC的CD4的细胞数目为Y轴的细胞群散点图；
图20为本发明实施例4的以携带有PE的PD-1的细胞数目为X轴，侧向散射光强度为Y轴的细胞群散点图；
图21为本发明实施例4的以携带有FITC的CD3的细胞数目为X轴，携带PE-Cy7的CD8的细胞数目为Y轴的细胞群散点图；
图22为本发明实施例4的以携带有PE的PD-1的细胞数目为X轴，侧向散射光强度为Y轴的细胞群散点图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
针对现有技术存在的问题，本发明实施例提供了一种抗体检测试剂盒，所述抗体检测试剂盒包括程序性死亡受体1(Programmed death-1，PD-1)的抗体以及至少三种簇分化抗原的抗体，所述程序性死亡受体1的抗体以及每种簇分化抗原的抗体携带有不同的荧光素。
本发明一些实施例中，所述程序性死亡受体1的抗体以及每种簇分化抗原的抗体分别容纳于不同的容器中，以形成不同的检测试剂。
本发明一些实施例中，所述检测试剂为液态试剂或粉剂。
所述液态试剂中，所述程序性死亡受体1的抗体的浓度为0.8微克/毫升-1.2微克/毫升。
当所述检测试剂为粉剂，所述抗体检测试剂盒还包括磷酸盐缓冲溶液，以用于稀释所述粉剂。
本发明实施例中，所述至少三种簇分化抗原包括成熟T细胞表面标记物、辅助T细胞表面标记物和细胞毒T细胞表面标记物。
本发明一些实施例中的所述液态试剂中，所述成熟T细胞表面标记物的抗体的浓度为2微克/毫升-3微克/毫升，所述辅助T细胞表面标记物的抗体的浓度为1.3微克/毫升-1.8微克/毫升，所述细胞毒T细胞表面标记物的抗体的浓度为4.8微克/毫升-7.2微克/毫升。
本发明一些实施例中，所述成熟T细胞表面标记物包括CD3，所述辅助T细胞表面标记物包括CD4，所述细胞毒T细胞表面标记物包括CD8，以通过CD4和CD8考察PD-1蛋白的表达情况，提高结果的准确性。
本发明一些实施例中，所述至少三种簇分化抗原还包括CD45，所述液态试剂中，所述CD45的抗体的浓度为4.8微克/毫升-7.2微克/毫升。
本发明一些实施例中，所述程序性死亡受体1的抗体以及所述至少三种簇分化抗原的抗体均为单克隆抗体。
本发明一些实施例中，所述程序性死亡受体1的抗体以及所述至少三种簇分化抗原的抗体均为鼠抗人单克隆抗体。
本发明一些实施例中，所述程序性死亡受体1的抗体所携带的荧光素为藻红蛋白。
本发明一些实施例中，所述成熟T细胞表面标记物的抗体和所述辅助T细胞表面标记物的抗体中的任意一种所携带的荧光素为异硫氰酸，另一种所携带的荧光素为别藻蓝蛋白。
本发明一些实施例中，所述细胞毒T细胞表面标记物的抗体所携带的荧光素为PerCP-Cy5.5和PE-Cy7中的任意一种。
本发明一些实施例中，所述CD45的抗体所携带的荧光素为PerCP-Cy5.5和PE-Cy7中的任意一种。
本发明实施例1的抗体检测试剂盒包括鼠抗人CD3单克隆抗体、鼠抗人CD4单克隆抗体、鼠抗人CD8单克隆抗体以及鼠抗人PD1单克隆抗体。所述鼠抗人CD3单克隆抗体用于特异性识别白细胞膜表面CD3抗原，从而检测出表达有CD3的白细胞；所述鼠抗人CD4单克隆抗体用于特异性识别白细胞膜表面CD4抗原，从而检测出表达有CD4的白细胞；所述鼠抗人CD8单克隆抗体用于特异性识别白细胞膜表面CD8抗原，从而检测出表达有CD8的白细胞；所述鼠抗人PD1单克隆抗体用于特异性识别白细胞膜表面PD1抗原，从而检测出表达有PD1的白细胞。
其中，所述鼠抗人CD3单克隆抗体携带有FITC，所述鼠抗人CD4单克隆抗体携带有APC，所述鼠抗人CD8单克隆抗体携带有PerCP-Cy5.5，所述鼠抗人PD1单克隆抗体携带有PE。
实施例1的鼠抗人CD3单克隆抗体、鼠抗人CD4单克隆抗体、鼠抗人CD8单克隆抗体以及鼠抗人PD1单克隆抗体分别容纳于不同的容器中，以分别形成检测试剂。
具体的，实施例1的鼠抗人CD3单克隆抗体、鼠抗人CD4单克隆抗体、鼠抗人CD8单克隆抗体以及鼠抗人PD1单克隆抗体分别使用磷酸盐缓冲溶液溶解，以分别形成所述四种液态试剂。
更具体的，每种所述液态试剂中，所述鼠抗人CD3单克隆抗体浓度为2.5微克/毫升，所述鼠抗人CD4单克隆抗体浓度为1.5微克/毫升，所述鼠抗人CD8单克隆抗体浓度为6微克/毫升，所述鼠抗人PD1单克隆抗体浓度为1微克/毫升。
本发明实施例2的抗体检测试剂盒与实施例1的抗体检测试剂盒的区别在于：实施例2的抗体检测试剂盒还包括携带有PE-Cy7的鼠抗人CD45单克隆抗体；所述鼠抗人CD45单克隆抗体使用磷酸盐缓冲溶液溶解形成的液态试剂中，所述鼠抗人CD45单克隆抗体的浓度为6微克/毫升。
本发明实施例3的抗体检测试剂盒与实施例1的抗体检测试剂盒的区别在于：实施例3的抗体检测试剂盒中，所述鼠抗人CD3单克隆抗体携带有APC，所述鼠抗人CD4单克隆抗体携带有FITC；实施例3的每种液态试剂中，所述鼠抗人CD3单克隆抗体浓度为2微克/毫升，所述鼠抗人CD4单克隆抗体浓度为1.3微克/毫升，所述鼠抗人CD8单克隆抗体浓度为4.8微克/毫升，所述鼠抗人PD1单克隆抗体浓度为0.8微克/毫升。
本发明实施例4的抗体检测试剂盒与实施例2的抗体检测试剂盒的区别在于：实施例4的抗体检测试剂盒中，鼠抗人CD45单克隆抗体携带有PerCP-Cy5.5，鼠抗人CD8单克隆抗体携带有PE-Cy7；实施例4的每种液态试剂中，所述鼠抗人CD3单克隆抗体浓度为3微克/毫升，所述鼠抗人CD4单克隆抗体浓度为1.8微克/毫升，所述鼠抗人CD8单克隆抗体浓度为7.2微克/毫升，所述鼠抗人PD1单克隆抗体浓度为1.2微克/毫升，所述鼠抗人CD45单克隆抗体的浓度为7.2微克/毫升。
本发明实施例1-4中的抗体检测试剂盒还包括溶血素，以用于后续进行孵育处理。
本发明实施例1-4中的抗体检测试剂盒还包括磷酸盐缓冲液。
本发明实施例还提供了所述抗体检测试剂盒在免疫分析方面的应用，所述应用包括：将待检测样本、所述程序性死亡受体1的抗体以及所述至少三种簇分化抗原的抗体相混合后进行孵育处理和重悬处理，然后通过流式细胞术进行所述免疫分析，以提高检测结果的准确性。
本发明一些实施例中，当所述至少三种簇分化抗原包括CD3、CD4和CD8，所述免疫分析包括统计CD3+CD4+PD-1+的细胞阳性率以及统计CD3+CD8+PD-1+的细胞阳性率。
具体的，所述免疫分析包括统计CD3+CD4+的细胞阳性率以及统计CD3+CD8+的细胞阳性率，并根据所述CD3+CD4+的细胞阳性率和所述CD3+CD8+的细胞阳性率统计所述CD3+CD4+PD-1+的细胞阳性率以及所述CD3+CD8+PD-1+的细胞阳性率。
更具体的，本发明实施例1的抗体检测试剂盒在免疫分析方面的应用包括样本染色过程和免疫分析过程，所述待检测样本为含有抗凝剂的人全血样本，所述抗凝剂为EDTA。
所述样本染色过程包括：将携带有FITC的鼠抗人CD3单克隆抗体、携带有APC的鼠抗人CD4单克隆抗体、携带有PerCP-Cy5.5的鼠抗人CD8单克隆抗体以及携带有PE的鼠抗人PD1单克隆抗体的四种液态试剂各20微升以及50微升的含有EDTA的人全血样本加入流式管后通过涡旋混合器进行涡旋混匀，形成混合物，然后对所述混合物顺次进行孵育处理和重悬处理。
所述孵育处理具体包括：对所述混合物在室温下避光孵育15分钟后加入2毫升溶血素，然后继续在室温下避光孵育15分钟，以裂解红细胞。
所述重悬处理具体包括：对所述孵育处理得到的混合物在300g的离心力下离心5分钟，去除上清液，以得到第一沉淀物；将所述第一沉淀物与2-3毫升磷酸盐缓冲溶液通过涡旋混合器进行涡旋混匀，在300g的离心力下离心5分钟，去除上清液，得到第二沉淀物；向所述第二沉淀物中加入0.5毫升磷酸盐缓冲溶液，以得到待分析样本。
所述免疫分析过程包括：使用来源于美国BD公司的型号为FACS Calibur的流式细胞仪对所述待分析样本进行数据采集和免疫分析。具体的数据采集过程为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。
所述免疫分析还包括：
S11：以携带有FITC的CD3细胞数目为X轴，侧向散射光(SSC)强度为Y轴，以峰面积A作为信号表现方式，获得如图1所示的细胞群散点图，在图1中圈定T细胞，由图1所示的门框统计T细胞的细胞百分率为0.54％；
S12：以图1的CD3+阳性细胞群设门，建立图2所示的以携带有FITC的CD3细胞数目为X轴，携带有APC的CD4细胞数目为Y轴的细胞群散点图，由图2所示的门框R1统计CD3+CD4+的细胞阳性率为47.35％；
S13：基于图2的CD3+CD4+设门，建立图3所示的以携带有PE的PD-1细胞数目为X轴，SSC强度为Y轴的细胞群散点图，由图3所示的门框R2统计CD3+CD4+PD-1+的细胞阳性率为5.28％；
S14：以图1的CD3+阳性细胞群设门，显示为图4所示的R3，建立图4所示的以携带有FITC的CD3细胞数目为X轴，携带有PerCP-Cy5.5的CD8细胞数目为Y轴的细胞群散点图，由图4所示的门框R3统计CD3+CD8+的细胞阳性率为30.30％；
S15：以图4的CD3+CD8+细胞群设门，建立图5所示的以携带有PE的PD-1细胞数目为X轴，SSC强度为Y轴的细胞群散点图，由图5所示的门框R4统计CD3+CD8+PD-1+的细胞阳性率为20.63％。
现有的研究表明，在多种感染性疾病，如病毒、细菌、真菌及寄生虫感染过程中，均观察到PD-1表达增加。例如对脓毒症患者的外周血检测具体表现为CD4+T细胞表面PD-1上调，因此检测CD3+CD4+PD-1+的表达水平对多种感染性疾病的预防和治疗均有重要意义。
另外，现有研究也表明，由于自身免疫疫病的病人的免疫细胞上的PD-1及其配体PD-L1的表达跟正常人相比会呈现出异常的上升或降低，且表达水平的上升或下降都会加速自身免疫疾病的发展。例如类风湿关节炎患者的CD4+和CD8+T细胞表面表达的PD-1水平均显著降低；结核病患者的PD-1表达在CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞表面都增加，且PD-1的表达于γ干扰素的分泌有相关性；结核分枝杆菌感染的小鼠的CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达均明显上调，脾脏CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞PD-1绝对计数也提示PD-1表达增加。
由此可见，检测特异性免疫细胞上的CD3+CD4+PD-1+和CD3+CD8+PD-1+的表达水平有助于临床上准确判断患者的相关疾病发展情况，对相关疫病的预防和治疗均有重要意义。
本发明实施例2的抗体检测试剂盒在免疫分析方面的应用中，使用来源于美国BD公司的型号为FACS Canto的流式细胞仪对所述待分析样本进行数据采集和免疫分析。
本发明实施例2的样本染色过程参照实施例1进行，在此不做赘述。
本发明实施例2的免疫分析过程包括：
S21：以携带PE-Cy7的CD45的细胞数目为X轴，SSC强度为Y轴得到图6所示的细胞群散点图，并在其中圈出淋巴细胞群CD45+，由图6所示的门框P1统计CD45+的细胞阳性率为35.88％；
S22：基于图6的CD45+细胞群设门，得到图7所示的以携带有FITC的CD3的细胞数目为X轴，SSC强度为Y轴的细胞群散点图，在图7中圈定CD3+细胞群以确定总CD3+T淋巴细胞群，即图7所示的T细胞，由图7所示的门框统计CD3+的细胞阳性率为75.00％；
S23：基于图7的CD3+细胞群设门，得到图8所示的以携带有FITC的CD3的细胞数目为X轴，携带APC的CD4的细胞数目为Y轴的细胞群散点图，由图8所示的门框R1统计CD3+CD4+的细胞阳性率为45.40％；
S24：基于图8的CD3+CD4+细胞群设门，得到图9所示的以携带有PE的PD-1的细胞数目为X轴，SSC强度为Y轴的细胞群散点图，由图9所示的门框R2统计CD3+CD4+PD-1+的细胞阳性率为4.19％；
S25：基于图7的CD3+细胞群设门，得到图10所示的以携带有FITC的CD3的细胞数目为X轴，携带PerCP-Cy5.5的CD8的细胞数目为Y轴的细胞群散点图，由图10所述的门框R3统计CD3+CD8+的细胞阳性率为30.60％；
S26：基于图10的CD3+CD8+细胞群设门，得到图11所示的以携带有PE的PD-1的细胞数目为X轴，SSC强度为Y轴的细胞群散点图，由图11所示的门框R4统计CD3+CD8+PD-1+的细胞阳性率为18.95％。
本发明实施例3的样本染色过程和免疫分析过程请参见实施例1，在此不做赘述。
本发明实施例3的免疫分析结果分别通过图12-图16来详细阐述。
具体的，图12为以携带APC的CD3细胞数目为X轴，SSC强度为Y轴得到的细胞群散点图，在图12中圈定T淋巴细胞，即图12所示的T细胞并统计得到其细胞百分率为0.38％。
图13为以携带APC的CD3细胞数目为X轴，携带FITC的CD4的细胞数目为Y轴得到的细胞群散点图，由图13所示的门框R1统计得到CD3+CD4+的细胞阳性率为41.40％。
图14为以携带PE的PD-1细胞数目为X轴，SSC强度为Y轴得到的细胞群散点图，由图14所示的门框R2统计得到CD3+CD4+PD-1+的细胞阳性率为4.35％。
图15为以携带APC的CD3细胞数目为X轴，携带PerCP-Cy5.5的CD8的细胞数目为Y轴得到的细胞群散点图，由图15所示的门框R3统计得到CD3+CD8+的细胞阳性率为33.80％。
图16为以携带PE的PD-1细胞数目为X轴，SSC强度为Y轴得到的细胞群散点图，由图16所示的门框R4统计得到CD3+CD8+PD-1+的细胞阳性率为21.01％。
本发明实施例4的样本染色过程和免疫分析过程请参见实施例2，在此不做赘述。
本发明实施例4的免疫分析结果分别通过图17-图22来详细阐述。
具体的，图17为以携带PerCP-Cy5.5的CD45的细胞数目为X轴，SSC强度为Y轴得到的细胞群散点图，在其中圈出淋巴细胞群CD45+，由图17所示的门框P1统计CD45+的细胞阳性率为35.56％；
图18为以携带有FITC的CD3的细胞数目为X轴，SSC强度为Y轴的细胞群散点图，由图18所示的门框统计T细胞，即CD3+的细胞阳性率为75.00％；
图19为以携带有FITC的CD3的细胞数目为X轴，携带APC的CD4的细胞数目为Y轴的细胞群散点图，由图19所示的门框R1统计CD3+CD4+的细胞阳性率为38.80％；
图20为以携带有PE的PD-1的细胞数目为X轴，SSC强度为Y轴的细胞群散点图，由图20所示的门框R2统计CD3+CD4+PD-1+的细胞阳性率为4.19％；
图21为以携带有FITC的CD3的细胞数目为X轴，携带PE-Cy7的CD8的细胞数目为Y轴的细胞群散点图，由图21所示的门框R3统计CD3+CD8+的细胞阳性率为33.70％；
图22为以携带有PE的PD-1的细胞数目为X轴，SSC强度为Y轴的细胞群散点图，由图22所示的门框R4统计CD3+CD8+PD-1+的细胞阳性率为21.07％。
虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。
Claims (14)
1.一种抗体检测试剂盒，其特征在于，包括程序性死亡受体1的抗体以及至少三种簇分化抗原的抗体，所述至少三种簇分化抗原包括成熟T细胞表面标记物、辅助T细胞表面标记物和细胞毒T细胞表面标记物；
所述程序性死亡受体1的抗体以及每种簇分化抗原的抗体携带的荧光素各不相同。
2.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述成熟T细胞表面标记物包括CD3，所述辅助T细胞表面标记物包括CD4，所述细胞毒T细胞表面标记物包括CD8。
3.根据权利要求2所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述至少三种簇分化抗原还包括CD45。
4.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述程序性死亡受体1的抗体以及所述至少三种簇分化抗原的抗体均为单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述程序性死亡受体1的抗体以及所述至少三种簇分化抗原的抗体均为鼠抗人抗体。
6.根据权利要求3所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述程序性死亡受体1的抗体所携带的荧光素的染色指数高于所述每种簇分化抗原的抗体所携带的荧光素的染色指数。
7.根据权利要求6所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述程序性死亡受体1的抗体所携带的荧光素为藻红蛋白。
8.根据权利要求6所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述成熟T细胞表面标记物的抗体和所述辅助T细胞表面标记物的抗体中的任意一种所携带的荧光素为异硫氰酸，另一种所携带的荧光素为别藻蓝蛋白，所述细胞毒T细胞表面标记物的抗体所携带的荧光素为PerCP-Cy5.5和PE-Cy7中的任意一种，所述CD45的抗体所携带的荧光素为PerCP-Cy5.5和PE-Cy7中的任意一种。
9.根据权利要求3所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述程序性死亡受体1的抗体以及每种簇分化抗原的抗体分别容纳于不同的容器中，以形成不同的检测试剂。
10.根据权利要求9所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂为液态试剂或粉剂，所述液态试剂中，所述程序性死亡受体1的抗体的浓度为0.8微克/毫升-1.2微克/毫升，所述成熟T细胞表面标记物的抗体的浓度为2微克/毫升-3微克/毫升，所述辅助T细胞表面标记物的抗体的浓度为1.3微克/毫升-1.8微克/毫升，所述细胞毒T细胞表面标记物的抗体和所述CD45的抗体中的任意一种的浓度为4.8微克/毫升-7.2微克/毫升。
11.一种如权利要求1-10中任一项所述的抗体检测试剂盒在免疫分析方面的应用，其特征在于，包括：
将待检测样本、所述程序性死亡受体1的抗体以及所述至少三种簇分化抗原的抗体相混合后进行孵育处理和重悬处理，然后通过流式细胞术进行所述免疫分析。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，当所述至少三种簇分化抗原包括CD3、CD4和CD8，所述免疫分析包括统计CD3+CD4+PD-1+的细胞阳性率以及统计CD3+CD8+PD-1+的细胞阳性率。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述免疫分析包括统计CD3+CD4+的细胞阳性率以及统计CD3+CD8+的细胞阳性率，并根据所述CD3+CD4+的细胞阳性率和所述CD3+CD8+的细胞阳性率统计所述CD3+CD4+PD-1+的细胞阳性率以及所述CD3+CD8+PD-1+的细胞阳性率。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，当所述至少三种簇分化抗原还包括CD45，所述免疫分析还包括统计CD45+CD3+的细胞阳性率。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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