CN113899893B - 一种ivd流式产品的开发方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种IVD流式产品的开发方法。本发明中，测试样本的要求包括样本处理方法和抗凝血剂的种类，其中样本处理方法包括样本溶血处理，保存、转运的条件和方法；抗凝血剂包括EDTA、肝素钠、柠檬酸钠；如果用热电的载体蛋白用无菌水溶解；测试染色前和染色后的稳定性，同时联系测试机构测试市面上占有率较高的流式细胞仪，测试结束之后，即可以完成IVD流式产品的开发，取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG‑25或G—50柱，分离游离荧光素；之后对收集标记的荧光抗体进行鉴定；从而可以鉴定处抗体是否被标记，从而提高了后续的IVD流式产品开发的准确度，提高了产品质量。
Description
技术领域
本发明属于IVD产品开发技术领域，具体为一种IVD流式产品的开发方法。
背景技术
VD作为医疗器械的一个独立分支，拥有其特有的界定和法规监管体系，特别是美国食品药品监督管理局FDA与欧盟EC。IVD主要包括用于体外诊断的仪器、试剂或系统。但在中国情况却不同，IVD未被独立区分与界定，即没有IVD的概念。而国际上通常的IVD概念所包括的产品被打散，分别从属于医疗器械、体外诊断试剂以及药品中。
但是常见的开发方法在操作时，缺少鉴定的过程，使得开发后的产品精确度不够高。
发明内容
本发明的目的在于：为了解决上述提出的问题，提供一种IVD流式产品的开发方法。
本发明采用的技术方案如下：一种IVD流式产品的开发方法，其特征在于：所述IVD流式产品的开发方法包括以下步骤：
S1:确定好测试样本的要求之后先进行APC-Cy7、PE-Cy7和PerCP-Cy5.5的偶联；先平衡EDC到室温，加入2mg的APC-Cy7、5mg的PE-Cy7H和7mg的PerCP-Cy5.5到200ul偶联缓冲液，如果用热电的载体蛋白用无菌水溶解；
S2:溶解2mg多肽或半抗原到500ul偶联缓冲液加入200ul载体蛋白中；
S3:室温反应100～～120min；用脱盐柱纯化偶联蛋白，得到APC-Cy7、PE-Cy7和PerCP-Cy5.5的偶联蛋白；
S4:进行抗体的标记和分离纯化；取来抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3％碳酸钠水溶液、0.01mol/L pH8.0PBS、1％硫柳汞、离心机及离心管、烧杯(25ml)搅拌器、无菌吸管，无菌吸管及毛细滴管、烧杯500ml透析袋，
S5:先进行抗体准备,用0～4℃的pH8。0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30～40mg/ml，置入25ml烧杯内，放于冰槽中；
S6:按每毫克免疫球蛋白加入荧光素0.01rug计算，称取所需的荧光素，用3％碳酸钠水溶液溶解；
S7:将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在0～4℃冰箱中结合(最好在磁力搅拌机上持续搅拌)18～24h；
S8:结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析；
S9:取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素；之后对收集标记的荧光抗体进行鉴定；
S10:与BD、迈瑞等上市产品进行对比，包括阳性率、细胞分群；通过流式实验进行对比，包括抗体用量、阳性率、细胞分群，根据结果进行优化，以确定最佳条件；
S11:测试染色前和染色后的稳定性，同时联系测试机构测试市面上占有率较高的流式细胞仪，测试结束之后，即可以完成IVD流式产品的开发。
在一优选的实施方式中，所述步骤S2中，APC-Cy7、或PE-Cy7结合，溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加100ul该溶液到载体-多肽溶液中；对PerCP-Cy5.5结合溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加50ul该溶液到载体-多肽溶液中，如果发生沉淀进一步减少EDC用量。
在一优选的实施方式中，所述步骤S3中，如果存储免疫原数天，无菌过滤储存在无菌容器中或-20℃保存。
在一优选的实施方式中，所述步骤S4中，标记抗体可以使用FITC、PE、APC、PE-Cy7、PerCP、PerCP-Cy5.5、APC-Cy7中的一种。
在一优选的实施方式中，所述步骤S7中，充分搅匀之后，在0～4℃冰箱中放入磁力搅拌机，磁力搅拌机上持续搅拌18～24h。
在一优选的实施方式中，所述步骤S8中，标记的球蛋白溶液离心速度为2500r/min，离心的时间为20min，且缓冲盐水透析过程中温度控制在0～4℃；时间为20～～24小时。
在一优选的实施方式中，所述步骤S9中，洗脱液为pH为7.2，且浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲液；过滤前未透析且过滤量为12ml的标记全球蛋白液；收集量为20ml。
在一优选的实施方式中，所述步骤S1中，测试样本的要求包括样本处理方法和抗凝血剂的种类，其中样本处理方法包括样本溶血处理，保存、转运的条件和方法；抗凝血剂包括EDTA、肝素钠、柠檬酸钠。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明中，取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素；之后对收集标记的荧光抗体进行鉴定；从而可以鉴定处抗体是否被标记，从而提高了后续的IVD流式产品开发的准确度，提高了产品质量。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
一种IVD流式产品的开发方法，所述IVD流式产品的开发方法包括以下步骤：
S1:确定好测试样本的要求之后先进行APC-Cy7、PE-Cy7和PerCP-Cy5.5的偶联；先平衡EDC到室温，加入2mg的APC-Cy7、5mg的PE-Cy7H和7mg的PerCP-Cy5.5到200ul偶联缓冲液，如果用热电的载体蛋白用无菌水溶解；步骤S1中，测试样本的要求包括样本处理方法和抗凝血剂的种类，其中样本处理方法包括样本溶血处理，保存、转运的条件和方法；抗凝血剂包括EDTA、肝素钠、柠檬酸钠；
S2:溶解2mg多肽或半抗原到500ul偶联缓冲液加入200ul载体蛋白中；步骤S2中，APC-Cy7、或PE-Cy7结合，溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加100ul该溶液到载体-多肽溶液中；对PerCP-Cy5.5结合溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加50ul该溶液到载体-多肽溶液中，如果发生沉淀进一步减少EDC用量；
S3:室温反应100～～120min；用脱盐柱纯化偶联蛋白，得到APC-Cy7、PE-Cy7和PerCP-Cy5.5的偶联蛋白；步骤S3中，如果存储免疫原数天，无菌过滤储存在无菌容器中或-20℃保存；
S4:进行抗体的标记和分离纯化；取来抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3％碳酸钠水溶液、0.01mol/L pH8.0PBS、1％硫柳汞、离心机及离心管、烧杯(25ml)搅拌器、无菌吸管，无菌吸管及毛细滴管、烧杯500ml透析袋，步骤S4中，标记抗体可以使用FITC、PE、APC、PE-Cy7、PerCP、PerCP-Cy5.5、APC-Cy7中的一种；
S5:先进行抗体准备,用0～4℃的pH8。0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30ml，置入25ml烧杯内，放于冰槽中；
S6:按每毫克免疫球蛋白加入荧光素0.01rug计算，称取所需的荧光素，用3％碳酸钠水溶液溶解；
S7:将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在0～4℃冰箱中结合(最好在磁力搅拌机上持续搅拌)18～24h；所述步骤S7中，充分搅匀之后，在0～4℃冰箱中放入磁力搅拌机，磁力搅拌机上持续搅拌18～24h；
S8:结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析；步骤S8中，标记的球蛋白溶液离心速度为2500r/min，离心的时间为20min，且缓冲盐水透析过程中温度控制在0～4℃；时间为20～～24小时；
S9:取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素；之后对收集标记的荧光抗体进行鉴定；步骤S9中，洗脱液为pH为7.2，且浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲液；过滤前未透析且过滤量为12ml的标记全球蛋白液；收集量为20ml；
S10:与BD、迈瑞等上市产品进行对比，包括阳性率、细胞分群；通过流式实验进行对比，包括抗体用量、阳性率、细胞分群，根据结果进行优化，以确定最佳条件；
S11:测试染色前和染色后的稳定性，同时联系测试机构测试市面上占有率较高的流式细胞仪，测试结束之后，即可以完成IVD流式产品的开发。
实施例二：
一种IVD流式产品的开发方法，所述IVD流式产品的开发方法包括以下步骤：
S1:确定好测试样本的要求之后先进行APC-Cy7、PE-Cy7和PerCP-Cy5.5的偶联；先平衡EDC到室温，加入2mg的APC-Cy7、5mg的PE-Cy7H和7mg的PerCP-Cy5.5到200ul偶联缓冲液，如果用热电的载体蛋白用无菌水溶解；步骤S1中，测试样本的要求包括样本处理方法和抗凝血剂的种类，其中样本处理方法包括样本溶血处理，保存、转运的条件和方法；抗凝血剂包括EDTA、肝素钠、柠檬酸钠；
S2:溶解2mg多肽或半抗原到500ul偶联缓冲液加入200ul载体蛋白中；步骤S2中，APC-Cy7、或PE-Cy7结合，溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加100ul该溶液到载体-多肽溶液中；对PerCP-Cy5.5结合溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加50ul该溶液到载体-多肽溶液中，如果发生沉淀进一步减少EDC用量；
S3:室温反应100～～120min；用脱盐柱纯化偶联蛋白，得到APC-Cy7、PE-Cy7和PerCP-Cy5.5的偶联蛋白；步骤S3中，如果存储免疫原数天，无菌过滤储存在无菌容器中或-20℃保存；
S4:进行抗体的标记和分离纯化；取来抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3％碳酸钠水溶液、0.01mol/L pH8.0PBS、1％硫柳汞、离心机及离心管、烧杯(25ml)搅拌器、无菌吸管，无菌吸管及毛细滴管、烧杯500ml透析袋，步骤S4中，标记抗体可以使用FITC、PE、APC、PE-Cy7、PerCP、PerCP-Cy5.5、APC-Cy7中的一种；
S5:先进行抗体准备,用0～4℃的pH8。0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30ml，置入25ml烧杯内，放于冰槽中；
S6:按每毫克免疫球蛋白加入荧光素0.01rug计算，称取所需的荧光素，用3％碳酸钠水溶液溶解；
S7:将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在0～4℃冰箱中结合(最好在磁力搅拌机上持续搅拌)18～24h；所述步骤S7中，充分搅匀之后，在0～4℃冰箱中放入磁力搅拌机，磁力搅拌机上持续搅拌18～24h；
S8:结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析；步骤S8中，标记的球蛋白溶液离心速度为2500r/min，离心的时间为20min，且缓冲盐水透析过程中温度控制在0～4℃；时间为20～～24小时；
S9:取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素；之后对收集标记的荧光抗体进行鉴定；步骤S9中，洗脱液为pH为7.2，且浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲液；过滤前未透析且过滤量为12ml的标记全球蛋白液；收集量为20ml；
S10:与BD、迈瑞等上市产品进行对比，包括阳性率、细胞分群；通过流式实验进行对比，包括抗体用量、阳性率、细胞分群，根据结果进行优化，以确定最佳条件；
S11:测试染色前和染色后的稳定性，同时联系测试机构测试市面上占有率较高的流式细胞仪，测试结束之后，即可以完成IVD流式产品的开发。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种IVD流式产品的开发方法，其特征在于：所述IVD流式产品的开发方法包括以下步骤：
S1:确定好测试样本的要求之后先进行APC-Cy7、PE-Cy7和PerCP-Cy5.5的偶联；先平衡EDC到室温，加入2mg的APC-Cy7、5mg的PE-Cy7H和7mg的PerCP-Cy5.5到200ul偶联缓冲液，如果用热电的载体蛋白用无菌水溶解；
S2:溶解2mg多肽或半抗原到500ul偶联缓冲液加入200ul载体蛋白中；
S3:室温反应100～～120min；用脱盐柱纯化偶联蛋白，得到APC-Cy7、PE-Cy7和PerCP-Cy5.5的偶联蛋白；
S4:进行抗体的标记和分离纯化；取来抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3％碳酸钠水溶液、0.01mol/L pH8.0PBS、1％硫柳汞、离心机及离心管、25ml烧杯搅拌器、无菌吸管，无菌吸管及毛细滴管、烧杯500ml透析袋，
S5:先进行抗体准备,用0～4℃的pH8，0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30～40mg/ml，置入25ml烧杯内，放于冰槽中；
S6:按每毫克免疫球蛋白加入荧光素0.01rug计算，称取所需的荧光素，用3％碳酸钠水溶液溶解；
S7:将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在0～4℃冰箱中结合18～24h；
S8:结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析；
S9:取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素；之后对收集标记的荧光抗体进行鉴定；
S10:与BD、迈瑞上市产品进行对比，包括阳性率、细胞分群；通过流式实验进行对比，包括抗体用量、阳性率、细胞分群，根据结果进行优化，以确定最佳条件；
S11:测试染色前和染色后的稳定性，同时联系测试机构测试市面上占有率较高的流式细胞仪，测试结束之后，即可以完成IVD流式产品的开发。
2.如权利要求1所述的一种IVD流式产品的开发方法，其特征在于：所述步骤S2中，APC-Cy7、或PE-Cy7结合，溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加100ul该溶液到载体-多肽溶液中；对PerCP-Cy5.5结合溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加50ul该溶液到载体-多肽溶液中，如果发生沉淀进一步减少EDC用量。
3.如权利要求1所述的一种IVD流式产品的开发方法，其特征在于：所述步骤S3中，如果存储免疫原数天，无菌过滤储存在无菌容器中或-20℃保存。
4.如权利要求1所述的一种IVD流式产品的开发方法，其特征在于：所述步骤S4中，标记抗体使用FITC、PE、APC、PE-Cy7、PerCP、PerCP-Cy5.5、APC-Cy7中的一种。
5.如权利要求1所述的一种IVD流式产品的开发方法，其特征在于：所述步骤S7中，充分搅匀之后，在0～4℃冰箱中放入磁力搅拌机，磁力搅拌机上持续搅拌18～24h。
6.如权利要求1所述的一种IVD流式产品的开发方法，其特征在于：所述步骤S8中，标记的球蛋白溶液离心速度为2500r/min，离心的时间为20min，且缓冲盐水透析过程中温度控制在0～4℃；时间为20～～24小时。
7.如权利要求1所述的一种IVD流式产品的开发方法，其特征在于：所述步骤S9中，洗脱液为pH为7.2，且浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲液；过滤前未透析且过滤量为12ml的标记全球蛋白液；收集量为20ml。
8.如权利要求1所述的一种IVD流式产品的开发方法，其特征在于：所述步骤S1中，测试样本的要求包括样本处理方法和抗凝血剂的种类，其中样本处理方法包括样本溶血处理，保存、转运的条件和方法；抗凝血剂包括EDTA、肝素钠、柠檬酸钠。
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