CN108181473A - 血吸虫抗体检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术检测技术领域，特别是涉及一种用于血吸虫抗体检测的试剂盒，该试剂盒包括样品垫、金标垫、纤维素膜和吸水垫，该试剂盒检测血吸虫抗体的特异性较高；检测血吸虫抗体快速、简便，不需要任何仪器或设备辅助。

Description

血吸虫抗体检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术检测技术领域，特别是涉及一种用于血吸虫抗体检测的试剂盒。
背景技术
日本血吸虫病是一种由日本血吸虫引起的热带疾病。我国日本血吸虫病流行区人口众多，故日本血吸虫病仍然是我国重点防治的寄生虫病之一。诊断是治疗疾病的一个关键环节，所以快速、准确的诊断技术是一个有效控制疾病的先决条件。寻找简便、快速、价廉、便于推广应用、具有普查、临床实际诊断和疗效考察价值的检测方法，是当前迫切需要解决的问题。
目前日本血吸虫病诊断主要有病原学诊断和免疫诊断两大类。病原学检查方法不易检出轻度感染病人和慢性病患者，而且多数病原学方法操作繁琐，用时较久，难以用于大规模筛查疾病；免疫诊断方法具有敏感性高、使用方便等优点，已逐渐成为临床和现场日本血吸虫病感染筛查的重要手段。
目前主流的免疫诊断方法包括间接血凝法、间接ELISA、免疫层析法，其中间接血凝法操作较为复杂，间接ELISA法需要孵育、洗板、仪器扫描，不便于大规模筛查使用。免疫层析法依靠其独特的优势，缩短了检测时间，无需特定仪器，便于血吸虫病的诊断。免疫层析法通常采用间接法检测血清、血浆或全血样本中的血吸虫抗体，即将血吸虫抗原包被在硝酸纤维素膜上，然后采用胶体金或乳胶微球标记抗人的二抗，从而检测样本中的抗体。该方法灵敏度基本能达到95％以上，但特异性较差。因此，发明一种特异性好，同时快速、简便，不需要任何仪器或设备的免疫层析法成为了日本血吸虫病诊断的迫切需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于血吸虫抗体检测的试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种血吸虫抗体检测试剂盒的制备方法。
本发明的第一方面，提供一种用于血吸虫抗体检测的试剂盒，包括样品垫、金标垫、纤维素膜和吸水垫；所述纤维素膜上设置检测线和质控线；
上述金标垫包被胶体金结合抗原，以及胶体金结合蛋白，所述胶体金结合抗原为血吸虫虫卵可溶性抗原，所述胶体金结合蛋白为链霉亲和素或兔IgG。
在一个优选的方案中，上述血吸虫虫卵可溶性抗原的标记使用浓度为20μg/mL-25μg/mL，上述链霉亲和素或兔IgG的标记使用浓度为20μg/mL-25μg/mL。
在一些实施方案中，上述检测线包被有检测血吸虫虫卵可溶性抗原的蛋白。
在一个优选的方案中，所述检测血吸虫虫卵可溶性抗原的蛋白为鼠抗人IgG或金黄葡萄球菌蛋白A，优选地，所述鼠抗人IgG为鼠抗人IgG单克隆抗体。
在一些实施方案中，上述质控线包被蛋白，所述蛋白为生物素酯-BSA偶联物或羊抗兔IgG，优选地，所述羊抗兔IgG为羊抗兔IgG多克隆抗体。
在一个优选的方案中，上述鼠抗人IgG或金黄葡萄球菌蛋白A浓度为1.0mg/mL-2.0mg/mL。
在一个优选的方案中，上述生物素酯-BSA偶联物或羊抗兔IgG浓度为1.0mg/mL-2.0mg/mL。
在一个优选的方案中，
上述血吸虫虫卵可溶性抗原标记使用浓度为20μg/mL；
上述链霉亲和素或兔IgG标记使用浓度为20μg/mL；
上述鼠抗人IgG或金黄葡萄球菌蛋白A浓度为1.5mg/mL；
上述生物素酯-BSA偶联物或羊抗兔IgG浓度为1.0mg/mL。
在一个优选的方案中，上述纤维素膜为硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、尼龙、聚四氟乙烯膜的任意一种。
在一些实施方案中，本发明的血吸虫抗体检测试剂盒适用于人血液样本，样本与稀释液比例为1：9，所述稀释液为0.85％氯化钠溶液。
本发明的第二方面，提供了一种制备上述血吸虫抗体检测试剂盒的方法，包括以下步骤：
(1)金标垫标记，将胶体金溶液加入缓冲液，再加入血吸虫虫卵可溶性抗原，最后加入终止液，形成血吸虫虫卵可溶性抗原胶体金复合物，再采用梯度离心后得到纯化后的胶体金复合物，将其喷涂到所述金标垫上；将胶体金溶液加入缓冲液，再加入链霉亲和素或兔IgG，最后加入终止液，形成链霉亲和素胶体金复合物或兔IgG胶体金复合物，再采用梯度离心后得到纯化后的胶体金复合物，将其喷涂到所述金标垫上；
(2)检测线标记，将鼠抗人IgG或金黄葡萄球菌蛋白A加入膜包被液，喷涂到所述检测线上；
(3)质控线标记，将生物素酯-BSA偶联物或羊抗兔IgG加入膜包被液，喷涂到所述质控线上；
(4)将吸水垫粘贴在纤维素膜的远离检测线的一端，将金标垫粘贴在纤维素膜的靠近检测线的一端，将样品垫粘贴于金标垫上与纤维素膜相对的一端，得到血吸虫抗体检测试剂盒。
在一个优选的方案中，上述金标垫标记缓冲液为磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液，PH值为7.4-9.0。
在一个优选的方案中，上述终止液为2％BSA溶液，上述膜包被液为含3％甲醇的0.1M硼酸盐缓冲液。
在一个优选的方案中，上述血吸虫虫卵可溶性抗原胶体金复合物与链霉亲和素胶体金复合物梯度离心转速为5000rpm、8000rpm、10000rpm、13500rpm。
在一个优选的方案中，上述胶体金复合物浓度包被OD为5-10。
本发明的血吸虫抗体检测试剂盒具有以下优点：
1、检测血吸虫抗体的特异性较高；
2、检测血吸虫抗体快速、简便，不需要任何仪器或设备辅助。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的描述。
图1为本发明血吸虫抗体检测试剂盒结构示意图
图中标号是1为PVC底板；2为纤维素膜；3为样品垫；4为金标垫；5为检测线；6为质控线；7为吸水垫。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
1、血吸虫抗体检测试剂盒制备
(1)金标垫标记，将胶体金溶液600ml加入60ml，0.1M，pH＝7.40磷酸盐缓冲液，再按照20μg/mL的量加入血吸虫虫卵可溶性抗原12.0mg，最后加入2％BSA溶液60ml，形成血吸虫虫卵可溶性抗原胶体金复合物，采用梯度离心后得到胶体金复合物，稀释至OD＝8,然后喷涂到所述金标垫上；将胶体金溶液250ml加入25ml，0.1M，pH＝9.00硼酸盐缓冲液，再按照20μg/mL的量加入链霉亲和素5.0mg，最后加入2％BSA溶液25ml，形成链霉亲和素胶体金复合物，采用梯度离心后得到胶体金复合物，稀释至OD＝8,然后喷涂到所述金标垫上；
上述梯度离心步骤：将标记好的复合物分装到洁净的离心管中，配平，2℃～8℃梯度离心，时间如下表。
每次离心后，待沉淀自然溶解完后将沉淀吸出，上清继续下一个梯度的离心，用含0.605％Tris、5％蔗糖、2％BSA、0.3％吐温-20的复溶液按照标记胶体金溶液体积的10％进行复溶，得到胶体金复合物。
(2)检测线包被，按浓度1.5mg/mL浓度取鼠抗人IgG单克隆抗体37.5mg，加入到含3％甲醇的0.1M硼酸盐缓冲液中，配制检测线溶液25mL，喷涂到所述检测线上；
(3)质控线包被，按浓度1.0mg/mL浓度取生物素酯-BSA偶联物25.0mg，加入到含3％甲醇的0.1M硼酸盐缓冲液中，配制质控线溶液25mL，喷涂到所述质控线上；
(4)将吸水垫粘贴在纤维素膜的远离检测线的一端，将金标垫粘贴在纤维素膜的靠近检测线的一端，将样品垫粘贴于金标垫上与纤维素膜相对的一端，得到血吸虫抗体检测试剂盒。
2、血吸虫抗体检测试剂盒显色步骤
(1)人血液样本先与胶体金结合垫上用胶体金标记的血吸虫虫卵可溶性抗原反应，形成胶体金-血吸虫虫卵可溶性抗原-血吸虫抗体复合物，随侧向层析反应向上流动，与硝酸纤维素膜上的鼠抗人IgG单克隆抗体反应，从而附着显色，即检测线显色。
(2)人血液样本样本侧向层析会带动胶体金标记的链霉亲和素向上流动，与硝酸纤维素膜上的生物素酯-BSA偶联物反应，从而附着显色，即质控线显色。3、血吸虫抗体检测试剂盒包被条件筛选实验
(1)血吸虫虫卵可溶性抗原最佳标记条件的确定：
取5支洁净的玻璃瓶，编号为1至5，每瓶分别加入1000μl胶体金溶液；然后在1号、2号、3号瓶中分别加入pH值为7.0、7.4、8.0的0.1M磷酸盐缓冲液，4号、5号瓶中分别加入pH值为8.4、9.0的硼酸盐缓冲液；然后分别加入30μg血吸虫虫卵可溶性抗原；最后分别加入100μl2％BSA溶液，观察结果。详细见表1。
表1血吸虫虫卵抗原标记pH确定
编号 1 2 3 4 5
标记pH值 7.0 7.4 8.0 8.4 9.0
胶体金溶液(μl) 1000 1000 1000 1000 1000
0.1M磷酸盐缓冲液(μl) 100 100 100 / /
0.1M硼酸盐缓冲液(μl) / / / 100 100
血吸虫虫卵可溶性抗原(μg) 30 30 30 30 30
终止液(μl) 100 100 100 100 100
沉淀变化 部分溶解 完全溶解 完全溶解 完全溶解 完全溶解
取5支洁净的玻璃瓶，编号为1至5，每瓶分别加入1000μl胶体金溶液；然后在1至5号瓶中分别加入pH值为7.4的0.1M磷酸盐缓冲液100μl；1至5号瓶中分别加入5μg、10μg、15μg、20μg、25μg血吸虫虫卵可溶性抗原；最后分别加入100μl终止液，观察结果。详细见表2。
表2血吸虫虫卵抗原标记蛋白量确定
(2)链霉亲和素最佳标记蛋白量确定：
取5支洁净的玻璃瓶，编号为1至5，每瓶分别加入1000μl胶体金溶液；然后在1号、2号、3号瓶中分别加入pH值为7.0、7.4、8.0的0.1 M磷酸盐缓冲液，4号、5号瓶中分别加入pH值为8.4、9.0的硼酸盐缓冲液；然后分别加入30μg链霉亲和素；最后分别加入100μl终止液，观察结果。详细见表3。
表3链霉亲和素标记pH确定
编号 1 2 3 4 5
标记pH值 7.0 7.4 8.0 8.4 9.0
胶体金溶液(μl) 1000 1000 1000 1000 1000
0.1M磷酸盐缓冲液(μl) 100 100 100 / /
0.1M硼酸盐缓冲液(μl) / / / 100 100
链霉亲和素(μg) 30 30 30 30 30
终止液(μl) 100 100 100 100 100
沉淀变化 未溶解 未溶解 部分溶解 部分溶解 完全溶解
取5支洁净的玻璃瓶，编号为1至5，每瓶分别加入1000μl胶体金溶液；然后在1至5号瓶中分别加入pH值为9.0的0.1M硼酸盐缓冲液100μl；1至5号瓶中分别加入5μg、10μg、15μg、20μg、25μg血吸虫虫卵可溶性抗原；最后分别加入100μl终止液，观察结果。详细见表4。
表4链霉亲和素标记蛋白量确定
由表1、表2可知，可用于标记本发明血吸虫虫卵可溶性抗原的pH为100μl/mL，0.1M磷酸盐缓冲液(pH值＝7.4-9.0)，适宜的标记蛋白量为20-25μg/mL。由表3、表4可知，可用于本发明的链霉亲和素的标记pH为100μl/mL，0.1M硼酸盐缓冲液(pH值＝9.0)，适宜的标记蛋白量为20-25μg/mL。由于蛋白最适合标记pH选择蛋白等电点稍微偏碱的pH，蛋白与胶体金结合最为稳定，最适标记蛋白量选择胶体金与蛋白结合的饱和点，蛋白量过量容造成原料浪费。因此最优选地，血吸虫虫卵可溶性抗原的最佳标记pH为100μl/mL，0.1M磷酸盐缓冲液(pH值＝7.4)，最佳标记蛋白量为20μg/mL；链霉亲和素的最佳标记pH为100μl/mL，0.1M硼酸盐缓冲液(pH值＝9.0)，最佳标记蛋白量为20μg/mL。
(3)标记离心力确定
标记蛋白复合物分成两组进行离心。1组采用常规离心，离心力设为27964g，转速为13500rpm，观察最终离心效果，详见表5-1；2组采用梯度离心，离心力梯度由低到高分别设置为3836g、9820g、15344g、27964g，转速为5000rpm、8000rpm、10000rpm、13500rpm，每个梯度离心后，保留下层沉淀，上层液体继续采用下一梯度离心力离心，直到上清澄清为止。将几次离心收集的沉淀溶解后汇总。详见表5-2。
表5-1标记复合物常规离心结果
表5-2标记复合物梯度离心结果
由表5-1、2可知，常规离心易导致离心后胶体金复合物贴壁、不易溶解，导致胶体金特异性偏差。梯度离心采用离心转速逐渐增加，保护了胶体金复合物的稳定，最后的胶体金复合物也易于溶解。因此血吸虫虫卵可溶性抗原胶体金复合物与链霉亲和素胶体金复合物梯度离心转速为3836g(5000rpm)、9820g(8000rpm)、15344g(10000rpm)、27964g(13500rpm)离心效果良好，满足使用要求。
(4)标记所用胶体金包被量确定
将标记纯化后的胶体金复合物用胶体金复溶液分别稀释到OD＝3、OD＝5、OD＝10、OD＝15；然后喷涂到金垫上，制备成试纸检测参考品，观察结果。详见表6。
表6胶体金复合物包被浓度确定实验结果
包被浓度 最低检出量 阳性符合率 阴性符合率
OD＝3 1︰10为阴性 14/15 15/15
OD＝5 1︰10为阳性 15/15 15/15
OD＝10 1︰10为阳性 15/15 15/15
OD＝15 1︰10为阳性 15/15 14/15
由表6可知，胶体金复合物包被浓度过低会出现假阴性，胶体金复合物包被浓度过高会出现假阳性。因此胶体金复合物浓度包被OD在5至10均满足标准要求。
(5)检测线包被浓度确定
使用含3％甲醇的0.1M硼酸盐缓冲液，将鼠抗人IgG单克隆抗体分别稀释到0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL，然后喷涂到硝酸纤维素膜形成检测线，制备成试纸检测参考品，观察结果。详见表7。
表7鼠抗人IgG单克隆抗体包被浓度确定
包被浓度 最低检出量 阳性符合率 阴性符合率
0.5mg/mL 1︰10为阴性 13/15 15/15
1.0mg/mL 1︰10为阳性 15/15 15/15
1.5mg/mL 1︰15为阳性 15/15 15/15
2.0mg/mL 1︰30为阳性 15/15 15/15
由表7可知，检测线的包被浓度为0.5mg/mL时，出现漏检，检测线的包被浓度包被范围为1.0mg/mL～2.0mg/mL，满足标准要求。
(6)样本检测稀释比例研究
分别采用稀释液0.85％氯化钠溶液稀释国家最低检出量参考品(购自中国药品生物制品检定研究院)和干扰样本(含5g/L血红蛋白的血浆样本)，样本：稀释液分别等于1:0、1:1、1:3、1:9、1:19，然后用试纸检测，观察结果。详见表8。
表8样本检测稀释比例确定
由表8可知，国家参考品最低检出量参考品采用1:1、1:3和1:9时检测结果均为阳性，采用1:19稀释后检测结果为弱阳性；对于干扰的样本，如果样本稀释倍数过低，容易造成背景偏红，影响结果判断。因此综合考虑国家参考品最低检出量的要求和抗干扰能力，样本：稀释液的比例为1:9最适宜。
4、对比实验
与现有技术的对比试验研究数据
方法1为采用间接法检测血清、血浆或全血样本中的血吸虫抗体，即将血吸虫抗原包被在硝酸纤维素膜上，然后采用胶体金标记抗人的二抗，从而检测样本中的抗体。
方法2为本发明试剂盒检测方法，分别用方法1、方法2检测血吸虫抗体国家参考品：
表9检测国家参考品比对
国家参考品类型 标准要求 方法1 方法2
阳性参考品P1-P15 阳性符合率100％ 93.33％，P10为阴性 100％
阴性参考品N1-N15 阴性符合率100％ 100％ 100％
灵敏度参考品S 结果为阳性 阳性 阳性
由表9可知，方法1漏检阳性参考品中的P10。
收集460例临床样本，经过市场公认敏感性和特异性较好的间接血凝法检测，其中有1例血吸虫抗体阳性、459例血吸虫抗体阴性。然后用方法1和方法2检测，观察两者的阴阳性符合率：
表10方法1与方法2检测临床样本符合率
类别 阳性检测结果 阳性符合率 阴性检测结果 阴性符合率
方法1 1 100％(1/1) 390 84.97％(390/459)
方法2 1 100％(1/1) 453 98.69％(453/459)
结果分析：
由表10可知，方法2与间接血凝法试纸的阴性符合率为98.69％，方法1阴性符合率为84.97％，方法2较方法1阴性符合率高13.72％，说明方法2较方法1特异性明显提高。
上述间接血凝法操作简介：
(1)配置致敏红细胞悬液：取冻干致敏红细胞1支，加稀释液1ml，充分混匀。
(2)于血凝板的第1列第1孔加稀释液100μl，第2-4孔各加稀释液25μl，再向第1孔加待测血清25μl，充分混匀后吸出25μl于第2孔，第2孔充分混匀后吸出25μl于第3孔，第3孔充分混匀后吸出25μl于第4孔，第4孔充分混匀后弃去25μl，然后在第1孔吸取75μl弃去。第1-4孔血清稀释度分别为1:5、1:10、1:20、1:40。最后向第1-4孔每孔加致敏红细胞悬液25μl，震摇1-2分钟，置37℃条件下30分钟观察结果。
(3)每次试验均应设阴性、阳性对照。阴性、阳性对照血清为冻干品，使用前每管加100μl稀释液稀释，充分溶解后使用。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims (15)

1.一种血吸虫抗体检测试剂盒，包括样品垫、金标垫、纤维素膜和吸水垫；所述纤维素膜上设置检测线和质控线；其特征在于，所述金标垫包被胶体金结合抗原，以及胶体金结合蛋白，所述胶体金结合抗原为血吸虫虫卵可溶性抗原，所述胶体金结合蛋白为链霉亲和素或兔IgG。
2.如权利要求1所述的血吸虫抗体检测试剂盒，其特征在于，所述血吸虫虫卵可溶性抗原的标记使用浓度为20μg/mL-25μg/mL，所述链霉亲和素或兔IgG的标记使用浓度为20μg/mL-25μg/mL。
3.如权利要求1所述的血吸虫抗体检测试剂盒，其特征在于，所述检测线包被有检测血吸虫虫卵可溶性抗原的蛋白。
4.如权利要求3所述的血吸虫抗体检测试剂盒，其特征在于，所述检测血吸虫虫卵可溶性抗原的蛋白为鼠抗人IgG或金黄葡萄球菌蛋白A。
5.如权利要求4所述的血吸虫抗体检测试剂盒，其特征在于，所述鼠抗人IgG或金黄葡萄球菌蛋白A浓度为1.0mg/mL-2.0mg/mL。
6.如权利要求4所述的血吸虫抗体检测试剂盒，其特征在于，所述质控线包被蛋白，所述蛋白为生物素酯-BSA偶联物或羊抗兔IgG。
7.如权利要求6所述的血吸虫抗体检测试剂盒，其特征在于，所述生物素酯-BSA偶联物或羊抗兔IgG浓度为1.0mg/mL-2.0mg/mL。
8.如权利要求6所述的血吸虫抗体检测试剂盒，其特征在于，所述血吸虫虫卵可溶性抗原的标记使用浓度为20μg/mL；所述链霉亲和素或兔IgG的标记使用浓度为20μg/mL；所述鼠抗人IgG或金黄葡萄球菌蛋白A浓度为1.5mg/mL；所述生物素酯-BSA偶联物或羊抗兔IgG浓度为1.0mg/mL。
9.如权利要求1-8任一项所述的血吸虫抗体检测试剂盒，其特征在于，所述纤维素膜为硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、尼龙、聚四氟乙烯膜的任意一种。
10.如权利要求1-8任一项所述的血吸虫抗体检测试剂盒，其特征在于，所述血吸虫抗体检测试剂盒适用于人血液样本。
11.如权利要求1所述的血吸虫抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下制备步骤：
(1)金标垫标记，将胶体金溶液加入缓冲液，再加入血吸虫虫卵可溶性抗原，最后加入终止液，形成血吸虫虫卵可溶性抗原胶体金复合物，再采用梯度离心后得到纯化后的胶体金复合物，将其喷涂到所述金标垫上；将胶体金溶液加入缓冲液，再加入链霉亲和素或兔IgG，最后加入终止液，形成链霉亲和素胶体金复合物或兔IgG胶体金复合物，再采用梯度离心后得到纯化后的胶体金复合物，将其喷涂到所述金标垫上；
(2)检测线标记，将鼠抗人IgG或金黄葡萄球菌蛋白A加入膜包被液，喷涂到所述检测线上；
(3)质控线标记，将生物素酯-BSA偶联物或羊抗兔IgG加入膜包被液，喷涂到所述质控线上；
(4)将吸水垫粘贴在纤维素膜的远离检测线的一端，将金标垫粘贴在纤维素膜的靠近检测线的一端，将样品垫粘贴于金标垫上与纤维素膜相对的一端，得到血吸虫抗体检测试剂盒。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述金标垫标记缓冲液为磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液，PH值为7.4-9.0。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述终止液为2％BSA溶液，所述膜包被液为含3％甲醇的0.1M硼酸盐缓冲液。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述血吸虫虫卵可溶性抗原胶体金复合物与链霉亲和素胶体金复合物梯度离心转速为5000rpm、8000rpm、10000rpm、13500rpm。
15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述胶体金复合物浓度包被OD为5-10。
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