CN107478836A - 一种同时检测甲肝、乙肝和丙肝的试剂盒及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测甲肝、乙肝和丙肝的试剂盒及其制备方法和用途。本发明利用免疫胶体金层析技术，在借鉴其他层析检测技术的基础上，将我国流行最为广泛的三种肝炎的检测试纸条有机组合在同一检测试剂盒内，一次采血可同时对三种肝炎作出诊断，检测灵敏度和特异性与ELISA相似，但在所需血量、检测时间、检测费用、操作技术等明显低于ELISA法，且检测过程不需要任何检测设备，因此该检测试纸条易于在大面积普查、急诊检查和广大基层医疗机构推广应用，研究具有广大的市场需求，将产生重大的社会和经济效益。

Description

一种同时检测甲肝、乙肝和丙肝的试剂盒及其制备方法和 用途

技术领域

本发明涉及一种同时快速检测甲肝、乙肝和丙肝的试剂盒及其制备方法和用途。本发明属于医药技术领域。

背景技术

病毒性肝炎尤其是乙肝和丙肝在我国流行广泛，传染性较强，发病率高，严重危害人民健康，已成为我国现阶段最为突出的公共卫生问题之一。我国甲型肝炎主要呈散发分布，甲肝病毒(HAV)感染率达80％以上，约有9.7亿人已感染过HAV。据WHO统计全球约有20亿人感染了乙型肝炎病毒(HBV)，其中慢性携带者约3.5亿人，我国目前约有6.9亿人感染乙肝病毒，慢性携带者1亿以上。随着血液制品在世界范围的流通，各种介入性治疗的广泛应用，丙型肝炎病毒(HCV)感染呈世界性分布，我国HCV感染人数达4300万人，其中约50％为慢性携带，为全球之最。病毒性肝炎涉及亿万民众与家庭，对经济发展和社会稳定具有不可低估的潜在影响，必须采取切实有效措施，控制肝炎的流行。

随着对肝炎病毒标志物研究的不断深入，肝炎检测技术也不断取得新的进展，特别是分子生物学技术及生物物理技术的大量应用，更多简便、快速、敏感、特异的方法不断出现，为肝炎的预防、诊断、疗效评价及疫苗效果考察发挥了重要作用。病毒性肝炎的检测方法主要包括免疫学检测和分子生物学检测二个方面。免疫学检测包括免疫扩散、对流免疫电泳(CIEP)、补体结合(CF)、间接血凝(PHA)、反向间接血凝(RPHA)、免疫粘附血凝(IAHA)、免疫电镜(IEM)、免疫荧光、放射免疫(RIA)、酶免疫(EIA)等。目前在临床应用最广泛的是酶联免疫微板法(ELISA)，可用夹心法、间接法或竞争法测定病毒抗原或抗体，该方法将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断试验结果，亦可经酶标分析仪检测做定性或定量分析，其敏感度可达ng水平。但在实际工作中发现，普通的ELISA方法因本身方法学的局限，使之在临床应用上存在着很多问题，如试剂的灵敏度较低、变异大、特异性不强、线性范围小、前带现象、后带现象等，限制了该方法对肝炎病毒浓度正确的检测及评估。

病毒核酸检测被当作肝炎病毒感染和复制的金标准，是病毒复制活跃的可靠指标。目前已有众多的分子生物学技术用于肝炎病毒的DNA或RNA检测。常用的方法主要包括，普通PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR、逆转录PCR、免疫PCR、基因芯片等。分子生物学检测方法的应用为肝炎病毒的定量检测提供了有效的手段，对治疗方案选择、抗病毒疗效观察以及预后判断方面具有重要的意义。但由于分子生物学检测方法易受环境、标本、操作、试剂等因素影响，易出现假阳性和假阴性结果，稳定性和重复性较差，且检测设备和试剂昂贵，目前还无法在临床广泛应用。

免疫胶体金层析技术已成为当今最快速、敏感的免疫学检测技术之一，在生物医学各研究领域特别是在医学检验中得到了日益广泛的应用，具有简单、快速、准确、无污染和可单份操作等优点。特别适合于广大基层单位、医院、野外作业人员以及大批量时间紧的检测和大面积普查等，因此该技术具有巨大的发展潜力和广泛的应用前景。目前该技术已经广泛应用于激素(早孕、LH等)、病毒抗体和抗原(艾滋病、乙脑、流感等)、性病(梅毒螺旋体抗体、淋球菌等)、寄生虫(弓形虫、包虫、血吸虫、人囊虫等)、肿瘤标记物(甲胎蛋白、血清癌胚抗原等)、心血管病标记物(血清心肌钙蛋白等)以及大麻、吗啡、海洛因等的快速检测。随着层析材料、包被方法、金标记技术以及加工工艺研究的不断发展和完善，该检测技术已被认为是诊断技术标准化最有前途的新技术之一，并有望进行定量或半定量检测。

本发明在借鉴其他层析检测技术的基础上，将我国流行最为广泛三种肝炎有机组合在同一检测试剂盒内，一次采血可同时对三种肝炎作出诊断，检测灵敏度和特异性与ELISA相似，但在所需血量、检测时间、检测费用、操作技术等明显低于ELISA法，且检测过程不需要任何检测设备，因此该检测试剂盒易于在大面积普查、急诊检查和广大基层医疗机构推广应用，研究具有广大的市场需求，将产生重大的社会和经济效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可同时、快速检测甲肝、乙肝和丙肝的试剂盒，为各级医院、疾控中心等进行病毒性肝炎的快速筛查提供新的检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种同时检测甲肝、乙肝和丙肝的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括分别用于甲肝、乙肝和丙肝检测的纳米胶体金检测试纸条，所述的试纸条按照连接顺序依次包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫，还包括位于下方的底衬、其中底衬的作用是提供组装平台，样品垫提供了待测样品加入的位置；

用于甲肝检测的纳米胶体金检测试纸条中，所述硝酸纤维素膜上具有抗甲型肝炎病毒多克隆抗体喷涂的质控线，以及甲型肝炎病毒抗原喷涂的检测线，金标垫上涂覆有胶体金颗粒标记的甲型肝炎病毒抗原；

用于乙肝检测的纳米胶体金检测试纸条中，所述硝酸纤维素膜上具有羊抗鼠二抗喷涂的质控线，以及乙型肝炎病毒单克隆抗体1喷涂的检测线，金标垫上涂覆有胶体金颗粒标记的乙型肝炎病毒单克隆抗体2，乙型肝炎病毒单克隆抗体1以及乙型肝炎病毒单克隆抗体2识别不同的抗原表位；

用于丙肝检测的纳米胶体金检测试纸条中，所述硝酸纤维素膜上具有抗丙型肝炎病毒多克隆抗体喷涂的质控线，以及丙型肝炎病毒抗原喷涂的检测线，金标垫上涂覆有胶体金颗粒标记的丙型肝炎病毒抗原。

在本发明中，优选的，甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒单克隆抗体1和丙型肝炎病毒抗原分别以0.30μg/ml、0.24μg/ml以及0.20μg/ml的浓度喷涂到各自硝酸纤维膜上的检测线上。

在本发明中，优选的，羊抗鼠二抗以0.3μg/ml、抗甲型肝炎病毒多克隆抗体以0.2μg/ml HAV、抗丙型肝炎病毒多克隆抗体以0.2μg/ml的浓度喷涂到硝酸纤维膜上的质控线上。

在本发明中，优选的，胶体金颗粒标记的甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒单克隆抗体2或丙型肝炎病毒抗原按照以下方法制备：

1)以柠檬酸三钠为还原剂，采用化学还原氯金酸制备纳米胶体金

(1)玻璃器皿的清洁：所有玻璃器皿过酸24小时后，流水冲洗去除残余酸，蒸馏水冲洗4-5次，双蒸水冲洗3-4次，烤箱干燥后备用；

(2)取100ug/ml氯金酸水溶液100ml加热至沸腾；

(3)搅动下准确加入10mg/ml柠檬酸三钠水溶液0.7ml，溶液应立即呈紫红色，继续煮沸15分钟；

(4)冷却后以蒸馏水恢复到原体加热至溶液为透明红色为止，得到纳米胶体金溶液；

2)纳米胶体金的标记

(1)将待标记的甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒单克隆抗体2和丙型肝炎病毒抗原分别预先在0.005mol/L pH 7.0NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100000g 4℃离心1h，去除聚合物；

(2)将纳米胶体金溶液以0.1mol/L K₂CO₃或0.1mol/L HCl调节pH值，标记抗原时调至9.0；标记单克隆抗体时，调至8.2；

(3)将调好pH的胶体金分装10管，每管1ml；

(4)将待标记的甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒单克隆抗体2或丙型肝炎病毒抗原以0.005mol/L pH8.2硼酸盐缓冲液做系列稀释为5μg/ml～50μg/ml，分别取1ml，加入纳米胶体金溶液中，混匀；

(5)5min后，在上述各管中加入0.1ml 10w/w％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果，确定标记量；

(6)100ml纳米胶体金溶液中加入确定标记量的抗体溶液，搅拌2～3分钟，加入5ml10mg/ml PEG20000溶液；

(7)于10000～100000g离心30～60分钟，小心吸去上清液；

(8)将沉淀悬浮于含0.2～0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液重新悬浮，得到标记好的胶体金复合物，4℃保存；

3)采用凝胶过滤法技术分离纯化纳米胶体金

(1)标记好的胶体金复合物装入透析袋内，置硅胶中浓缩至原体积1/10左右，用蒸馏水冲洗软化透析袋后，取出浓缩液；

(2)以15000r/min离心15min；

(3)吸取上清液加到丙烯葡聚糖S-400色谱柱上分离纯化；

(4)洗脱，流速为8ml/h，按红色深浅分管收集洗脱液；

4)按照步骤1)-3)分别制备得到胶体金颗粒标记的甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒单克隆抗体2以及丙型肝炎病毒抗原。

进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测甲肝、乙肝和丙肝试剂中的用途。

相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

1、纳米胶体金颗粒制备和纯化过程简便，工艺成熟稳定，适合规模化生产，颗粒应为直径20nm的均一球体。

2、检测灵敏度达到1-2ng/ml，特异性达到98％以上，检出率范围在95-100％。

3、使用本发明的试剂盒可同时检测三种肝炎，具有高灵敏度、高特异性、操作简便快速、且成本较低的特点，产品具有较强的市场竞争力和价格竞争力。

附图说明

图1为本发明的甲肝、乙肝和丙肝的纳米胶体金联合检测试纸条的结构示意图；

图2为采用本发明的纳米胶体金检测试纸条检测乙肝的原理示意图。

Y1：胶体金标记的乙型肝炎病毒单克隆抗体2；Y2：固相标记的乙型肝炎病毒单克隆抗体1；Y3:羊抗鼠二抗。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1甲肝、乙肝和丙肝的纳米胶体金联合检测试纸条的制备

材料及其来源：

甲型肝炎病毒抗原、鼠抗人乙型肝炎病毒单克隆抗体1和2、丙型肝炎病毒抗原均由生物制品公司提供，甲型肝炎病毒抗原购自北京佰桥瑞景生物科技有限公司，鼠抗人乙型肝炎病毒单克隆抗体1和2以及丙型肝炎病毒抗原购自Polaris-Bio公司。

方法：

1、以柠檬酸三钠为还原剂，采用化学还原氯金酸制备纳米胶体金

(1)玻璃器皿的清洁：所有玻璃器皿过酸24小时后，流水冲洗去除残余酸，蒸馏水冲洗4-5次，双蒸水冲洗3-4次，烤箱干燥后备用；

(2)取100μg/ml氯金酸水溶液100ml加热至沸腾；

(3)搅动下准确加入10mg/ml柠檬酸三钠水溶液0.7ml，溶液应立即呈紫红色，继续煮沸15分钟；

(4)冷却后以蒸馏水恢复到原体加热至溶液为透明红色为止，得到纳米胶体金溶液；

2、纳米胶体金的标记

(1)将待标记的甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒单克隆抗体2和丙型肝炎病毒抗原预先在0.005mol/L pH 7.0NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100000g4℃离心1h，去除聚合物；

(2)将纳米胶体金溶液以0.1mol/L K₂CO₃或0.1mol/L HCl调节pH值，标记抗原时调至9.0；标记单克隆抗体(McAb)时，调至8.2；

(3)将调好pH的纳米胶体金溶液分装10管，每管1ml；

(4)将步骤(1)处理后的待标记的甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒单克隆抗体2和丙型肝炎病毒抗原以0.005mol/L pH8.2硼酸盐缓冲液做系列稀释为5μg/ml～50μg/ml，分别取1ml，加入纳米胶体金溶液中，混匀，对照管只加1ml稀释液；

(5)5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果，确定最佳标记量；

(6)100ml纳米胶体金溶液中加入最佳标记量的抗体溶液，搅拌2～3分钟，加入5ml10mg/ml PEG20000溶液；

(7)于10000～100000g离心30～60分钟，小心吸去上清液；

(8)将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液重新悬浮，得到标记好的胶体金复合物，4℃保存；

3、采用凝胶过滤法技术分离纯化纳米胶体金

1)标记好的胶体金复合物装入透析袋内，置硅胶中浓缩至原体积1/10左右，用蒸馏水冲洗软化透析袋后，取出浓缩液。

2)以15000r/min离心15min(或用上述离心法纯化后的胶体金，再进一步用此方法纯化)。

3)吸取上清液加到丙烯葡聚糖S-400色谱柱上分离纯化。

4)洗脱，流速为8ml/h，按红色深浅分管收集洗脱液。

5)纯化的金标记复合物滤出液随浓度增加而红色逐渐加深，清亮透明，获取的纳米金颗粒应为直径20nm的均一球体。

4、HAV和HCV多克隆抗体制备。

(1)将100ug灭活的HAV或HCV病毒用生理盐水稀释，与100ug完全弗氏佐剂完全混合形成稳定的乳剂。

(2)将该乳剂在兔子双肩周围的皮下进行皮下和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用25ug HAV或HCV抗原。

(3)每间隔2周重复免疫接种1次，免疫量及部位同上，约免疫4-5次。

(4)最后一次免疫后采用动脉插管取血，分离血清，-20℃冻存。

5、胶体金试纸条的组装

将已标记的甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒单克隆抗体2和丙型肝炎病毒抗原分别喷涂在各自金标垫上，将另HAV抗原、乙型肝炎病毒单克隆抗体1和HCV抗原分别以0.30μg/ml、0.24μg/ml以及0.20μg/ml喷涂到各自硝酸纤维膜上的检测区(检测线，T线)，将羊抗鼠二抗以0.3μg/ml、HAV多克隆抗体以0.2μg/ml、HCV多克隆抗体以0.2μg/ml分别喷涂到硝酸纤维膜上的质控区(质控线，C线)，T线与C线的距离0.5cm；将样本垫(加样区)、金标垫(纳米金结合区)，喷涂后的硝酸纤维素膜，和吸水垫(吸引区)组装成试纸条，37℃烘箱干燥。试纸条的组装顺序如图1所示，所述的试纸条按照连接顺序依次包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫，还包括位于下方的底衬、其中底衬的作用是提供组装平台，样品垫提供了待测样品加入的位置。用于甲肝检测的纳米胶体金检测试纸条中，所述硝酸纤维素膜上具有抗甲型肝炎病毒多克隆抗体喷涂的质控线，以及甲型肝炎病毒抗原喷涂的检测线，金标垫上涂覆有胶体金颗粒标记的甲型肝炎病毒抗原；用于乙肝检测的纳米胶体金检测试纸条中，所述硝酸纤维素膜上具有羊抗鼠二抗喷涂的质控线，以及乙型肝炎病毒单克隆抗体1喷涂的检测线，金标垫上涂覆有胶体金颗粒标记的乙型肝炎病毒单克隆抗体2，乙型肝炎病毒单克隆抗体1以及乙型肝炎病毒单克隆抗体2识别不同的抗原表位，采用本发明的纳米胶体金联合检测试纸条检测乙肝的原理示意图如图2所示；用于丙肝检测的纳米胶体金检测试纸条中，所述硝酸纤维素膜上具有抗丙型肝炎病毒多克隆抗体喷涂的质控线，以及丙型肝炎病毒抗原喷涂的检测线，金标垫上涂覆有胶体金颗粒标记的丙型肝炎病毒抗原。

实施例2本发明的胶体金试纸条的使用及与化学发光方法、ELISA法和PCR法检测灵敏度和特异性的比较

1)阳性甲肝患者血清50份，乙肝血清100份，丙肝血清50份，健康阴性对照血清50份。相应质控标准品由医院检验科提供。

2)依据Gene Bank发表的HAV、HBV、HCV基因序列设计合成特异性引物。

3)以临床应用的化学发光方法为金标准，评价ELISA法、PCR和本发明胶体金法的灵敏度和特异性。

4)灵敏度分析：将质控标准品10倍稀释10³-10^-1ng/ml；将阳性血清10倍稀释后，分别进行倍比稀释为1:20—1:1280。

5)采用ELISA法、PCR和胶体金法稀释后的标准品和阳性血清进行检测，以最低检测浓度或稀释倍数为该检测方法的灵敏度。

6)特异性分析：分别以ELISA法、PCR、胶体金法和化学发光方法检测各血清样本，评价各方法的特异性。

7)灵敏度和特异性统计方法

灵敏度和特异性统计方法如下表1所示：

表1

其中A为真阳性，是化学发光和ELISA或PCR或胶体金法共同检出的阳性标本数；B为假阳性，是化学发光检测阴性而ELISA或PCR或胶体金检测阳性标本数；C为假阴性，是化学发光法检测阳性而ELISA或PCR或胶体金检测阴性性标本数；D为真阴性，是化学发光检测阴性和ELISA或PCR或胶体金法共同检出的阴性标本数。

灵敏度＝A/(A+C)×100％

特异性＝D/(B+D)×100％

假阳性率＝B/(B+D)×100％

假阴性率＝C/(A+C)×100％

结果：

1、灵敏度：

ELISA法：87.4％，PCR法：89.7％，胶体金法：83.4％。ELISA法和胶体金法最低检测浓度均为1ng/ml。

2、特异性：

ELISA法：88.8％，PCR法：76.6％，胶体金法：98.4％。

Claims (5)

1.一种同时检测甲肝、乙肝和丙肝的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括分别用于甲肝、乙肝和丙肝检测的纳米胶体金检测试纸条，所述的试纸条按照连接顺序依次包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫，还包括位于下方的底衬、其中底衬的作用是提供组装平台，样品垫提供了待测样品加入的位置；

用于甲肝检测的纳米胶体金检测试纸条中，所述硝酸纤维素膜上具有抗甲型肝炎病毒多克隆抗体喷涂的质控线，以及甲型肝炎病毒抗原喷涂的检测线，金标垫上涂覆有胶体金颗粒标记的甲型肝炎病毒抗原；

用于乙肝检测的纳米胶体金检测试纸条中，所述硝酸纤维素膜上具有羊抗鼠二抗喷涂的质控线，以及乙型肝炎病毒单克隆抗体1喷涂的检测线，金标垫上涂覆有胶体金颗粒标记的乙型肝炎病毒单克隆抗体2，乙型肝炎病毒单克隆抗体1以及乙型肝炎病毒单克隆抗体2识别不同的抗原表位；

用于丙肝检测的纳米胶体金检测试纸条中，所述硝酸纤维素膜上具有抗丙型肝炎病毒多克隆抗体喷涂的质控线，以及丙型肝炎病毒抗原喷涂的检测线，金标垫上涂覆有胶体金颗粒标记的丙型肝炎病毒抗原。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒单克隆抗体1和丙型肝炎病毒抗原分别以0.30μg/ml、0.24μg/ml以及0.20μg/ml的浓度喷涂到各自硝酸纤维膜上的检测线上。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，羊抗鼠二抗以0.3μg/ml、抗甲型肝炎病毒多克隆抗体以0.2μg/ml HAV、抗丙型肝炎病毒多克隆抗体以0.2μg/ml的浓度喷涂到硝酸纤维膜上的质控线上。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，胶体金颗粒标记的甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒单克隆抗体2或丙型肝炎病毒抗原按照以下方法制备：

1)以柠檬酸三钠为还原剂，采用化学还原氯金酸制备纳米胶体金

(1)玻璃器皿的清洁：所有玻璃器皿过酸24小时后，流水冲洗去除残余酸，蒸馏水冲洗4-5次，双蒸水冲洗3-4次，烤箱干燥后备用；

(2)取100ug/ml氯金酸水溶液100ml加热至沸腾；

(3)搅动下准确加入10mg/ml柠檬酸三钠水溶液0.7ml，溶液应立即呈紫红色，继续煮沸15分钟；

(4)冷却后以蒸馏水恢复到原体加热至溶液为透明红色为止，得到纳米胶体金溶液；

2)纳米胶体金的标记

(1)将待标记的甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒单克隆抗体2和丙型肝炎病毒抗原分别预先在0.005mol/L pH 7.0NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100000g 4℃离心1h，去除聚合物；

(2)将纳米胶体金溶液以0.1mol/L K₂CO₃或0.1mol/L HCl调节pH值，标记抗原时调至9.0；标记单克隆抗体时，调至8.2；

(3)将调好pH的胶体金分装10管，每管1ml；

(4)将待标记的甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒单克隆抗体2或丙型肝炎病毒抗原以0.005mol/L pH8.2硼酸盐缓冲液做系列稀释为5μg/ml～50μg/ml，分别取1ml，加入纳米胶体金溶液中，混匀；

(5)5min后，在上述各管中加入0.1ml 10w/w％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果，确定标记量；

(6)100ml纳米胶体金溶液中加入确定标记量的抗体溶液，搅拌2～3分钟，加入5ml10mg/ml PEG20000溶液；

(7)于10000～100000g离心30～60分钟，小心吸去上清液；

(8)将沉淀悬浮于含0.2～0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液重新悬浮，得到标记好的胶体金复合物，4℃保存；

3)采用凝胶过滤法技术分离纯化纳米胶体金

(1)标记好的胶体金复合物装入透析袋内，置硅胶中浓缩至原体积1/10左右，用蒸馏水冲洗软化透析袋后，取出浓缩液；

(2)以15000r/min离心15min；

(3)吸取上清液加到丙烯葡聚糖S-400色谱柱上分离纯化；

(4)洗脱，流速为8ml/h，按红色深浅分管收集洗脱液；

4)按照步骤1)-3)分别制备得到胶体金颗粒标记的甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒单克隆抗体2以及丙型肝炎病毒抗原。

5.权利要求1-4任一项所述的试剂盒在制备检测甲肝、乙肝和丙肝试剂中的用途。