CN112391498B - 验孕试纸在乙型肝炎病毒耐药突变基因现场即时检测中的应用 - Google Patents

验孕试纸在乙型肝炎病毒耐药突变基因现场即时检测中的应用 Download PDF

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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

验孕试纸在乙型肝炎病毒耐药突变基因现场即时检测中的应用，涉及HBV耐药突变基因检测领域。该检测方法包括：环介导等温扩增；根据LAMP扩增产物设计三个探针；利用滚环扩增反应获得三维大体积DNA分子；P1偶联hCG信号分子作为信号探针，P1、P2和P3杂交后产生的三通探针与滚环扩增产物结合，产物中多个重复单元与P2末端杂交，固定信号探针使其无法进入验孕试纸，加入LAMP扩增产物使其与P2、P3杂交从而将信号探针置换出来进入验孕试纸显色，实现对HBV耐药突变基因的全均相信号开型POCT检测。本发明操作简便、成本低、无需复杂仪器、灵敏度高、特异性好。

Description

验孕试纸在乙型肝炎病毒耐药突变基因现场即时检测中的 应用
技术领域
本发明涉及乙型肝炎病毒耐药突变基因检测技术领域，具体涉及一种验孕试纸在乙型肝炎病毒耐药突变基因现场即时检测中的应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)是引起传染性疾病乙型肝炎的主要原因，并可引发肝硬化和肝癌。目前，临床治疗乙肝应用最多的药物是核苷类似物，但长期服用抗病毒药物会诱导HBV基因产生耐药突变，严重影响治疗效果。HBV耐药突变基因检测的金标准是PCR产物直接测序法，此外常用的方法还包括实时荧光PCR法、焦磷酸测序法、基因芯片法和限制性片段长度多态性分析法。
现有HBV耐药突变基因的检测方法存在诸多弊端，比如测序技术操作繁琐、价格昂贵且耗时久；实时荧光PCR技术特异性差且需要专业仪器，无法实现现场式即时诊断；基因芯片法价格昂贵，步骤复杂；限制性片段长度多态性分析法虽然操作简便，但存在非特异性切割同源体现象，准确率低，易造成漏检、误判等情况。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种验孕试纸在乙型肝炎病毒耐药突变基因现场即时检测中的应用，具有操作简便、成本低廉、无需复杂仪器且灵敏度高、特异性好的优点。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明提供一种验孕试纸在乙型肝炎病毒耐药突变基因现场即时检测中的应用。
本发明利用验孕试纸实现对乙型肝炎病毒耐药突变基因的现场即时检测，该方法主要包括以下步骤：
(1)以乙型肝炎病毒耐药突变基因位点rt180M处的序列为模板，设计LAMP引物；
(2)利用模板序列和LAMP引物进行环介导等温扩增；
(3)针对LAMP扩增产物中的一种单链DNA环序列设计三个探针，其序列分别为：
P1：5’-NH2-TCGTGGATAGTACTGAAGGAGC-3’；
P2：5’-GAGCCATGAGAAACGGACTATCCACGACCATCGACACCAAGCA-3’；
P3：5’-GCTCCTTCAGTCCGTTTCTC-3’；
(4)滚环扩增
配置反应试剂，包括：RCA模板、RCA引物、T4 DNA连接酶、dNTPs、phi29 DNA聚合酶，经滚环扩增反应获得三维大体积DNA分子；
(5)在探针P1上偶联hCG信号分子，将探针P1、探针P2和探针P3杂交后产生三通探针，将三通探针与三维大体积DNA分子室温反应0.8～1.2h后，加入LAMP扩增产物室温放置25～35min；
(6)将验孕试纸插入上述产物中，取出拍照。
作为优选的实施方式，步骤(1)中，所述LAMP引物包括外部引物对和内部引物对，其序列分别为：
外部引物对：
TCCTGCTCAAGGAACCTCTA；
AAACAGTGGGGGAAAGCC；
内部引物对：
GCCCAGGATGATGGGATGGGATGTTTCCCTCTTGTTGCTGT；
CGCAAGATTCCTATGGGAGGGGACCACTGAACAAATGGCACT。
作为优选的实施方式，步骤(1)中，模板序列为：
TGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGGGGGCCTCAGTCCGTTTCTCATGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAAACCCTAATAAAACCAAACGTTGGGGCTACTCCCTTAACTTCATGGGATATG。
作为优选的实施方式，步骤(2)中，环介导等温扩增的条件为：55～65℃下反应1～3h。
作为优选的实施方式，步骤(3)中，所述单链DNA环序列为：GCCTCAGTCCGTTTCTCATGGCTCAGTTTACT。
作为优选的实施方式，步骤(4)中，所述三维大体积DNA分子是具有无数重复RCA模板互补序列的花型结构分子，其序列为：(TCTACTATATGACGGCGAAGATATCTATATTGCTTGGTGTCGATGGGTAA)n，n为正数。
作为优选的实施方式，步骤(4)中，所述RCA模板序列为：ATATAGTAGATTACCCATCGACACCAAGCAATATAGATATCTTCGCCGTC。
作为优选的实施方式，步骤(4)中，所述RCA引物序列为：TCTACTATATGACGGCGAAG。
作为优选的实施方式，步骤(4)中，滚环扩增的具体实现过程如下：
将RCA模板、RCA引物、T4 DNA连接酶和dNTPs混合，在室温下反应3h后，加入phi29DNA聚合酶并在30℃下孵育48h，75℃反应10min，离心洗涤，获得三维大体积DNA分子。
本发明的有益效果是：
本发明设计了一组LAMP引物，主要用于扩增乙型肝炎病毒耐药突变基因rt180M位点，并根据LAMP扩增产物设计三通探针即信号探针P1(偶联hCG信号分子)、检测探针P2、P3，通过滚环扩增产物(三维大体积DNA分子)中的多个重复单元与探针P2的末端碱基互补配对，将三通探针固定在三维大体积DNA分子上，从而固定信号探针P1使其无法进入验孕试纸，呈现阴性；然后加入LAMP扩增产物，使其与探针P2、探针P3杂交，从而将信号探针P1置换出来进入验孕试纸显色，呈现阳性。
本发明利用验孕试纸灵敏检测人绒毛膜促性腺激素(hCG)浓度的特性，无需分离步骤，实现验孕试纸对HBV耐药突变基因的全均相信号开型现场即时检测(POCT)。上述检测方法将RCA产物中的多个重复单元与探针P2杂交，充分降低了背景信号，灵敏度可达到2copies/μL；将基因突变位点设计在三通探针的“立足点”上，有效地区分单碱基突变，实现HBV突变型与野生型基因的区别检测；将三通探针作为转导探针，利用成本低廉的商品化验孕试纸即时输出信号，肉眼可见，结果直观。本发明利用等温扩增技术与成本低廉的商品化验孕试纸，可以实现对HBV耐药突变基因的低成本、灵敏、特异与便携式检测。
附图说明
图1为验孕试纸对HBV耐药突变基因的即时检测原理图。
图2为LAMP偶联链置换探针对HBV耐药突变基因的检测结果。其中，A为灵敏度检测结果，B为琼脂糖凝胶电泳结果，C为选择性检测结果。
图3为RCA扩增产物(三维大体积DNA分子)真空冻干并室温存储的TEM图。其中，A为真空冻干并室温存储2周；B为真空冻干并室温存储2月；C为真空冻干并室温存储3月；D为真空冻干并室温存储4月后的TEM图。
图4为验孕试纸对HBV耐药突变基因LAMP扩增模拟环序列的浓度梯度检测结果。其中，纵坐标的相对强度表示验孕试纸检测线与控制线颜色深度之比。
图5为验孕试纸对HBV耐药突变基因LAMP扩增产物的检测结果。其中，A为灵敏度检测结果，B为选择性检测结果。其中，纵坐标的相对强度表示验孕试纸检测线与控制线颜色深度之比。
图6为验孕试纸检测HBV耐药突变基因的稳定性试验结果。其中，纵坐标的相对强度表示验孕试纸检测线与控制线颜色深度之比。
具体实施方式
本发明提供一种验孕试纸在乙型肝炎病毒耐药突变基因现场即时检测中的应用。
本发明首次利用验孕试纸实现对乙型肝炎病毒耐药突变基因的现场即时检测(POCT)，该检测方法主要包括以下步骤：
(1)针对乙肝治疗药物拉米夫定、恩替卡韦敏感的乙型肝炎病毒突变基因位点rt180M处的模板序列，设计LAMP引物。
LAMP引物包括外部引物对和内部引物对，其序列分别为：
外部引物对：
TCCTGCTCAAGGAACCTCTA(SEQ ID NO:1)；
AAACAGTGGGGGAAAGCC(SEQ ID NO:2)；
内部引物对：
GCCCAGGATGATGGGATGGGATGTTTCCCTCTTGTTGCTGT(SEQ ID NO:3)；
CGCAAGATTCCTATGGGAGGGGACCACTGAACAAATGGCACT(SEQ ID NO:4)。
模板序列为：
TGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGGGGGCCTCAGTCCGTTTCTCATGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAAACCCTAATAAAACCAAACGTTGGGGCTACTCCCTTAACTTCATGGGATATG(SEQ ID NO:5)。
(2)利用模板序列和LAMP引物进行环介导等温扩增；优选的，55～65℃下反应1～3h；更优选的，63℃下反应1.5h。
(3)所得LAMP扩增产物为具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，选择其中的一种单链DNA环序列(GCCTCAGTCCGTTTCTCATGGCTCAGTTTACT(SEQ ID NO:6))设计三个探针，其序列分别为：
P1：5’NH2-TCGTGGATAGTACTGAAGGAGC-3’(SEQ ID NO:9)；
P2：5’-GAGCCATGAGAAACGGACTATCCACGACCATCGACACCAAGCA-3’(SEQ ID NO:10)；
P3：5’-GCTCCTTCAGTCCGTTTCTC-3’(SEQ ID NO:11)。
(4)滚环扩增(RCA)
配置反应试剂，包括：RCA模板、RCA引物、T4 DNA连接酶、dNTPs、phi29 DNA聚合酶。将RCA模板、RCA引物、T4 DNA连接酶和dNTPs混合，在室温下反应3h后，加入phi29 DNA聚合酶并在30℃下孵育48h，75℃反应10min，离心洗涤，获得三维大体积DNA分子。
所获得的三维大体积DNA分子是具有无数重复RCA模板互补序列的花型结构分子，其序列为：
(TCTACTATATGACGGCGAAGATATCTATATTGCTTGGTGTCGATGGGTAA)n(SEQ ID NO:14)，n为正数。
其中，RCA模板序列为：ATATAGTAGATTACCCATCGACACCAAGCAATATAGATATCTTCGCCGTC(SEQ ID NO:12)。
其中，RCA引物序列为：TCTACTATATGACGGCGAAG(SEQ ID NO:13)。
(5)在探针P1上偶联hCG信号分子作为信号探针，而探针P2和探针P3则作为检测探针。首先探针P1、探针P2和探针P3杂交后产生三通探针，将其与滚环扩增(RCA)产生的三维大体积DNA分子室温反应0.8～1.2h(优选1h)后，加入LAMP扩增产物室温放置25～35min(优选30min)；
(6)将验孕试纸插入上述产物中，3min后取出拍照。
如图1所示，HBV突变型基因的LAMP扩增产物不存在时，信号探针P1由于被固定在RCA扩增产生的三维大体积DNA分子上导致体积过大不能进入验孕试纸，呈现阴性；而HBV突变型基因的LAMP扩增产物能够将信号探针P1置换出来，使其进入验孕试纸，呈现阳性。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 LAMP偶联链置换探针实时检测HBV耐药突变基因，验证LAMP扩增引物的有效性
实验方法：
1、配制25μL反应体系，包含外部引物对(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)、内部引物对(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)、dNTP、甜菜碱和缓冲液，缓冲液为1×等温扩增缓冲液，分别加入1μL浓度为0、2copies/μL、20copies/μL、2×102copies/μL、2×103copies/μL、2×104copies/μL的HBV突变型模板(SEQ ID NO:5)；退火后加入荧光淬灭式链置换探针(SEQID NO:7和SEQ ID NO:8)、Bst 2.0DNA聚合酶；最后放入实时荧光定量PCR仪中，63℃反应90min。
2、应用1％琼脂糖凝胶电泳表征LAMP扩增产物。称取0.25g琼脂糖溶于25mL 1×TAE溶液，微波炉加热至溶解，加入gel red染色，摇匀并倒入凝胶槽中，插入样梳。待胶冷却，拔出样梳，将凝胶放入电泳槽，并取适量LAMP扩增产物加入梳孔，120V电压下运行30min，凝胶成像仪拍照分析。所得LAMP扩增产物为具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，选择其中一种单链DNA环序列作为检测目标：GCCTCAGTCCGTTTCTCATGGCTCAGTTTACT(SEQ ID NO:6)。
3、配制25μL反应体系，包含外部引物对(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)、内部引物对(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)、dNTP、甜菜碱和缓冲液，缓冲液为1×等温扩增缓冲液，分别加入1μL浓度为0、2×102copies/μL的HBV突变型模板(SEQ ID NO:5)、2×102copies/μL的HBV野生型模板(SEQ ID NO:15)；退火后分别加入荧光淬灭式链置换探针(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)、Bst 2.0DNA聚合酶；最后放入实时荧光定量PCR仪中，63℃反应90min。
实验结果：
灵敏度检测结果：实时曲线(参照图2中A)表明随靶分子拷贝数增大，起峰时间逐渐提前，曲线呈现S型，可检测至2copies/μL，且无假阳性。琼脂糖凝胶电泳结果(参照图2中B)中，仅靶分子存在时呈现梯形条带，说明LAMP引物能够有效地对靶分子进行扩增，这与实时曲线检测结果相一致。
特异性检测结果(参照图2中C)：0拷贝的曲线没有起峰，HBV突变型基因对应的曲线呈正常S型，而野生型基因对应的曲线呈小S型，表明该荧光淬灭式链置换探针能够区分单碱基突变，具有良好的特异性。
实施例2三维大体积DNA分子的制备及稳定性试验
实验方法：
1、配置20μL反应液体系，包含RCA模板(SEQ ID NO:12)、RCA引物(SEQ ID NO:13)、T4 DNA连接酶和缓冲液，缓冲液为1×DNA连接酶缓冲液，室温反应3h。
2、配置20μL反应液体系，包含phi29 DNA聚合酶、dNTP、BSA和缓冲液，缓冲液为1×RCA扩增缓冲液，并与上述反应完成的溶液混合，30℃反应48h，75℃反应10min，离心洗涤，重新分散于40μL H2O中。
3、将反应产物真空冻干，并于室温下存放不同时间后分散于水中，考察其形貌变化。
实验结果：
如图3所示，冻干并室温存储4个月后没有明显的形貌变化，表明该反应产物即三维大体积DNA分子具有长期稳定性。
实施例3验孕试纸对HBV耐药突变基因LAMP扩增模拟环序列的浓度梯度检测
实验方法：
1、在探针P1上偶联hCG信号分子作为信号探针；将探针P1、探针P2和探针P3杂交后产生三通探针；其中，探针P2和探针P3作为检测探针。
2、配置20μL体系，包含5μL滚环扩增产物(实施例2获得的三维大体积DNA分子)与20nM三通探针，室温反应1h。
3、在上述溶液中加入0、0.5nM、2nM、5nM、20nM、50nM等不同浓度的HBV耐药突变基因LAMP扩增模拟环序列(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，该HBV耐药突变基因LAMP扩增模拟环与实施例1获得的单链DNA环的序列相同)，室温反应30min。
4、将验孕试纸同时插入上述反应管中，3min后取出拍照。
实验结果：
如图4所示，HBV耐药突变基因LAMP扩增模拟环序列不存在时，验孕试纸呈现阴性；存在时，验孕试纸呈现阳性，且随着基因浓度逐渐增大，检测线颜色依次加深。
实施例4验孕试纸对HBV耐药突变基因LAMP扩增产物的灵敏度检测及选择性检测
实验方法：
1、配制25μL反应体系，包含外部引物对(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)、内部引物对(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)、dNTP、甜菜碱和缓冲液，缓冲液为1×等温扩增缓冲液，分别加入1μL浓度为0、2copies/μL、20copies/μL、2×102copies/μL、2×103copies/μL、2×104copies/μL的HBV突变型模板(SEQ ID NO:5)以及2×102copies/μL的HBV野生型模板(SEQID NO:15)；退火后加入Bst 2.0DNA聚合酶，置于PCR仪中，63℃反应1.5h。
2、在探针P1上偶联hCG信号分子作为信号探针；将探针P1、探针P2和探针P3杂交后产生三通探针；其中，探针P2和探针P3作为检测探针。
3、配置20μL体系，包含5μL滚环扩增产物(实施例2获得的三维大体积DNA分子)与20nM三通探针，室温反应1h。
4、在上述溶液中加入20μL不同浓度HBV突变型基因和HBV野生型基因的LAMP扩增产物，室温反应30min。
5、将验孕试纸同时插入上述反应管中，3min后取出拍照。
实验结果：
如图5所示，HBV突变型基因存在时验孕试纸呈现阳性，可检测至2拷贝/微升，表明该方法具有良好的灵敏度；而HBV突变型基因不存在或HBV野生型基因存在时验孕试纸呈现阴性，体现了该方法良好的特异性，甚至能够区分单碱基突变。
实施例5验孕试纸检测HBV耐药突变基因LAMP扩增模拟环序列的稳定性试验
实验方法：
1、将实施例2获得的滚环扩增产物即三维大体积DNA分子与三通探针分别冻干并室温储存。
2、将冻干样品分别存放3天、15天、30天后，重新分散于水中，然后将5μL三维大体积DNA分子与20nM三通探针混合，室温反应1h。
3、在上述溶液中分别加入0、0.5nM HBV耐药突变基因LAMP扩增模拟环序列(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，该HBV耐药突变基因LAMP扩增模拟环与实施例1获得的单链DNA环的序列相同)，室温反应30min。
4、将验孕试纸同时放入上述反应管中，3min后取出拍照。
实验结果：
如图6所示，室温存放30天后，三通探针依旧具有活性，只是活性稍微降低(约降低10％)，表明三通探针具有短期的存储稳定性。
本发明公开了一种用于检测乙型肝炎病毒耐药突变基因的LAMP引物及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
序列表
<110> 中国科学院长春应用化学研究所
<120> 验孕试纸在乙型肝炎病毒耐药突变基因现场即时检测中的应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcctgctcaa ggaacctcta 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaacagtggg ggaaagcc 18
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcccaggatg atgggatggg atgtttccct cttgttgctg t 41
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcaagattc ctatgggagg ggaccactga acaaatggca ct 42
<210> 5
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtcctctac ttccaggaac atcaactacc agcacgggac catgcaagac ctgcacgatt 60
cctgctcaag gaacctctat gtttccctct tgttgctgta caaaaccttc ggacggaaac 120
tgcacttgta ttcccatccc atcatcctgg gctttcgcaa gattcctatg ggagggggcc 180
tcagtccgtt tctcatggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt 240
tcccccactg tttggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac 300
aacatcttga gtcccttttt acctctatta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt 360
taaaccctaa taaaaccaaa cgttggggct actcccttaa cttcatggga tatg 414
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcctcagtcc gtttctcatg gctcagttta ct 32
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agtaaactga gccatgagaa acggactgag gccga 35
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<211> 22
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<400> 9
tcgtggatag tactgaagga gc 22
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gagccatgag aaacggacta tccacgacca tcgacaccaa gca 43
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gctccttcag tccgtttctc 20
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atatagtaga ttacccatcg acaccaagca atatagatat cttcgccgtc 50
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tctactatat gacggcgaag 20
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tctactatat gacggcgaag atatctatat tgcttggtgt cgatgggtaa 50
<210> 15
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgtcctctac ttccaggaac atcaactacc agcacgggac catgcaagac ctgcacgatt 60
cctgctcaag gaacctctat gtttccctct tgttgctgta caaaaccttc ggacggaaac 120
tgcacttgta ttcccatccc atcatcctgg gctttcgcaa gattcctatg ggagggggcc 180
tcagtccgtt tctcctggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt 240
tcccccactg tttggctttc agttatgtgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac 300
aacatcttga gtcccttttt acctctatta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt 360
taacccctaa taaaaccaaa cgttggggct actcccttaa cttcatggga tatg 414

Claims (10)

1.验孕试纸在非疾病诊断和治疗目的乙型肝炎病毒耐药突变基因现场即时检测中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以乙型肝炎病毒耐药突变基因位点rt180M处的序列为模板，设计LAMP引物；
(2)利用模板序列和LAMP引物进行环介导等温扩增；
(3)针对LAMP扩增产物中的一种单链DNA环序列设计三个探针，其序列分别为：
P1：5’-NH2-TCGTGGATAGTACTGAAGGAGC-3’；
P2：5’-GAGCCATGAGAAACGGACTATCCACGACCATCGACACCAAGCA-3’；
P3：5’-GCTCCTTCAGTCCGTTTCTC-3’；
(4)滚环扩增
配置反应试剂，包括：RCA模板、RCA引物、T4 DNA连接酶、dNTPs、phi29 DNA聚合酶，经滚环扩增反应获得三维大体积DNA分子；
(5)在探针P1上偶联hCG信号分子，将探针P1、探针P2和探针P3杂交后产生三通探针，将三通探针与三维大体积DNA分子室温反应0.8～1.2h后，加入LAMP扩增产物室温放置25～35min；
(6)将验孕试纸插入上述产物中，取出拍照。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述LAMP引物包括外部引物对和内部引物对，其序列分别为：
外部引物对：
TCCTGCTCAAGGAACCTCTA；
AAACAGTGGGGGAAAGCC；
内部引物对：
GCCCAGGATGATGGGATGGGATGTTTCCCTCTTGTTGCTGT；
CGCAAGATTCCTATGGGAGGGGACCACTGAACAAATGGCACT。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，模板序列为：TGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGGGGGCCTCAGTCCGTTTCTCATGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAAACCCTAATAAAACCAAACGTTGGGGCTACTCCCTTAACTTCATGGGATATG。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，环介导等温扩增的条件为：55～65℃下反应1～3h。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述单链DNA环序列为：GCCTCAGTCCGTTTCTCATGGCTCAGTTTACT。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，所述三维大体积DNA分子是具有无数重复RCA模板互补序列的花型结构分子，其序列为：(TCTACTATATGACGGCGAAGATATCTATATTGCTTGGTGTCGATGGGTAA)n，n为正数。
8.据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，所述RCA模板序列为：ATATAGTAGATTACCCATCGACACCAAGCAATATAGATATCTTCGCCGTC。
9.据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，所述RCA引物序列为：TCTACTATATGACGGCGAAG。
10.据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，滚环扩增的具体实现过程如下：
将RCA模板、RCA引物、T4 DNA连接酶和dNTPs混合，在室温下反应3h后，加入phi29 DNA聚合酶并在30℃下孵育48h，75℃反应10min，离心洗涤，获得三维大体积DNA分子。
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