CN103276063A

CN103276063A - 检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环rca方法

Info

Publication number: CN103276063A
Application number: CN2013101669259A
Authority: CN
Inventors: 张波; 林钟劝
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2013-05-08
Filing date: 2013-05-08
Publication date: 2013-09-04

Abstract

本发明公开了一种检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法，按照如下步骤完成：a、锁式探针的环化连接与酶切；b、第一轮RCA；c、RCA产物的酶切；d、锁式探针的连接；e、第二轮RCA，再用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果。本发明锁式探针结合RCA技术是一种检测基因位点突变的新方法，通过锁式探针特异识别靶基因的点突变位点，RCA扩增放大检测信号，并且通过RCA双循环扩增更加放大了检测信号。该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，在病原体耐药位点突变检测方面具有独特优势。

Description

检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法。

背景技术

病原微生物对抗菌药物的耐受大大降低了抗菌药物的治疗效果，已成为临床感染性疾病治疗面临的刺手问题。研究表明，病原微生物的基因突变是其产生耐药性的根本原因。细菌、真菌等病原微生物的耐药性可以通过耐药基因检测和体外药敏实验进行监测，但HBV、HCV等病毒尚无体外药敏实验，只能进行耐药基因检测。因此，耐药位点检测在各种感染性疾病的治疗中，对于指导抗感染药物的选择和合理应用具有重要临床价值。目前，基因突变位点检测有测序法、芯片杂交法等。基因测序方法繁琐，费用昂贵，耗时长；芯片杂交以PCR技术为基础，易出现假阳性。滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）是一种恒温线性扩增技术，以其快速简易、灵敏度高和特异性强等优点受到广泛关注。锁式探针由5’端模板结合区、中间连接序列区和3’端模板结合区组成。其中3’端末端碱基一般为突变位点识别区。当5’端和3’端与模板完全互补时，探针两端在DNA连接酶的作用下形成磷酸二酯键被连接成环，为RCA扩增提供环形模板，后者与引物杂交并在DNA聚合酶的作用下启动滚环扩增反应，形成一条含大量环形模板互补重复序列的DNA单链。当5’端和3’端与模板不能完全配对时，探针无法连接成环而保持线状，也就不会发生RCA扩增反应。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法,该检测方法操作简单、检测时间周期短、检测费用少，通过双循环RCA扩增和锁式探针相结合，能够准确的检测出乙型肝炎病毒耐药基因的方法。

本发明的技术方案如下：一种检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法，按照如下步骤完成：

a、锁式探针的环化连接与酶切：去离子水12μl、1μMol/L的锁式探针2μl、模板2μl和10×E.coliBuffer2μl，混匀，45℃孵育40min后，加入10×BSA缓冲液2μl和0.2μlE.coliDNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×Exonuclease I Buffer2μl和ExonucleaseI核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活ExonucleaseI核酸外切酶；

b、第一轮RCA：取步骤a中制得的探针环化连接产物24μl、100μmol/L引物1μl和10×phi29Buffer3μl，95℃5min，冰浴1min；加入phi29DNA聚合酶1μl、dNTP液1μl，混匀后37℃进行RCA反应2h；

c、RCA产物的酶切：取步骤b制得的第一轮RCA扩增产物30μl、10×HpaI Buffer3.5μl和HpaI核酸内切酶1.5μl，混匀后37℃酶切12h；酶切产物95℃孵育5min，冰浴1min后备用；

d、锁式探针的连接:取步骤c制得的酶切的RCA产物35μl、1μM锁式探针1μl和10×E.coli Buffer4.5μl，混匀，45℃孵育40min；加入10×BSA缓冲液4.5μl和0.4μlE.coli DNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；加入10×Exonuclease I Buffer5μl和Exonuclease I核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活Exonuclease I核酸外切酶；

e、第二轮RCA：取步骤d制得的环化连接产物50μl、100μMol/L引物1μl和10×phi29Buffer6μl，95℃孵育5min，冰浴1min；加入phi29DNA聚合酶2μl和dNTP液1μl，混匀，37℃进行RCA反应2h；

f、取步骤e制得的扩增产物5μl用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果；

所述步骤a和e中所设计用于RCA反应的引物是：

引物5′-ATGGGCACCGAAGAAGCA-3′ SEQ NO1；

探针是：

锁式探针

5′

-CCTACGAACCACTGAACTGCTTCTTCGGTGCCCATACATCAAATGCCACGTTAACAGTCAGGCCTAGTGGGGGAAAGC-3′，探针的5′端进行磷酸化修饰

SEQ NO2。

采用上述技术方案，本发明通过锁式探针结合RCA技术是一种检测基因位点突变的新方法，通过锁式探针特异识别靶基因的点突变位点，RCA扩增放大检测信号。该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，在病原体耐药位点突变检测方面具有独特优势。

锁式探针的设计原则是全长70-125nt，5’端20-30个nt，3’端12-20个nt，，尽量避免5’端、3’端和引物自互补形成二聚体等二级结构。二级结构越少，杂交和扩增阻力越小，效率越高。本发明设计的锁式探针长78nt，5’端20nt，Tm值44.4℃，3’端12nt，Tm值39.9℃。引物长18nt，Tm值59.3℃。利用prime premier5.0软件对引物的二级结构进行预测，结果未见引物二聚体的形成。在MFOLD网站预测中，探针环化连接后二级结构仅1个（如图1），基本为圆形结构，最大限度减少了扩增的阻力，提高扩增效率。

所述锁式探针中间序列加入HpaI核酸内切酶的酶切位点-GTTAAC-。本发明特意在设计的锁式探针的中间序列加入了限制性核酸内切酶HpaI的酶切位点-GTTAAC-，在双循环RCA时，可用HpaI酶切第一次RCA的扩增产物，从而游离出更多的模板（扩增产物为含大量模板重复单位的DNA长链），有利于新一轮的RCA扩增。

RCA扩增反应首先取决于锁式探针的环化连接反应，而探针与模板的杂交温度是影响连接效率的关键因素。本发明设计的锁式探针两端识别序列的Tm值相差＜5℃，保证了检测的特异性。由于琼脂糖凝胶电泳电泳条带之间微弱的信号差异肉眼难以区分，我们将引物修饰在纳米金颗粒上进行RCA扩增并用荧光素标记的探针检测扩增产物，以荧光强度数值进行比较。

纳米金颗粒表面的RCA反应具体步骤如下：

a、引物的纳米金修饰：取浓度为1.24mg/ml，粒径为15nm的纳米金溶液485μl与100μmol/L的巯基化引物15μl混匀，室温放置16h；再加入1mlpH为7.0缓冲液A，缓冲液A成分为0.1mol/LNaCl，10mol/LNaH₂PO₄，混和均匀，室温放置40h；将混合液通过高速离心机离心，离心转速为14000转/分钟，离心时间为25min，弃上清；再加入1ml缓冲液A清洗；再次离心，弃上清后用150μlPH为7.0的缓冲液B重悬，缓冲液B成分为0.3mol/LNaCl，10mol/LNaH₂PO₄，在温度为4℃环境下保存备用；

b、锁式探针的环化连接：去离子水12μl、1μmol/L的锁式探针2μl、模板2μl和10×E.coli Buffer2μl，混匀，45℃孵育40min后，加入10×BSA缓冲液2μl和0.2μl E.coli DNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×Exonuclease I Buffer2μl和Exonuclease I核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活Exonuclease I核酸外切酶；

c、RCA反应和荧光探针杂交检测：取步骤a中制得的纳米金修饰的引物3μl、步骤b中制得的探针环化连接产物10μl和10×phi29Buffer2μl，95℃孵育5min，冰浴1min；再加入phi29DNA聚合酶1μl、dNTP液2μl和100μmol/L荧光素标记探针2μl，混匀后在37℃避光条件下进行RCA反应2h；

d、RCA产物检测：将步骤c中制得的RCA产物溶入1mlPBS缓冲液中，将混合液通过高速离心机离心，离心转速为14000转/分钟，离心时间为25min，弃上清，重复加入缓冲液、离心操作2次；最后用100μlPBS缓冲液重悬，通过多功能读数仪在吸收光波长492nm,发射光波长520nm的条件下进行荧光强度检测；

所述步骤a和c中所设计用于RCA反应的引物是：

巯基化引物

5′-AAAAAAAAAAAAATGGGCACCGAAGAAGCA-3′，引物的5′端进行巯基化修饰

SEQ NO3；

荧光素标记探针5′-CCTACGAACCACTGAACTGC-3′，探针的5′端进行荧光素修饰

SEQ NO4。

杂交温度对锁式探针环化连接效率的影响：

采用纳米金颗粒表面的RCA反应，将锁式探针分别在35℃、40℃、45℃、50℃和55℃条件下与终浓度为10pmol/L的HBV野生型模板进行杂交，HBV野生型模板的基因序列为：

5′-ACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTT-3′SEQ NO5；连接成环后与纳米金颗粒修饰的引物进行RCA扩增反应。利用荧光探针检测RCA扩增产物，以荧光强度表示扩增产物量（图2）。结果表明锁式探针与模板在45℃杂交时，探针环化连接的产物最多，后续RCA的扩增效率最高。

杂交温度对锁式探针环化特异性的影响：

采用纳米金颗粒表面的RCA反应，将锁式探针分别在35℃、40℃、45℃、50℃和55℃条件下与高浓度突变型模板（1μmol/L）杂交，突变型模板的基因序列为：

5′-ACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGACTTTCCCCCACTGTTTGGCTT-3′SEQNO6，利用荧光探针检测RCA非特异性扩增产物，产物量以荧光强度表示（图3）。结果表明，锁式探针与模板杂交温度为45℃时，RCA的非特异性扩增产物最少，RCA扩增反应的特异性最高。

锁式探针的特异性验证：

实验设计的锁式探针分别与高浓度的HBV野生型和突变性模板（终浓度1μmol/L）在上述建立的条件下进行环化连接反应，反应产物用核酸外切酶ExonI切除未连接的探针，连接反应产物电泳结果（如图4）所示。结果显示探针与野生型模板特异识别，杂交结合后被连接成环，从而不被核酸外切酶切除，电泳条带明亮（W泳道）。突变型模板中由于基因位点突变，不存在探针结合的特异序列，探针不能与模板结合，因此探针未能连接成环，仍保持线状而被ExonI消化，电泳结果无条带出现（M泳道），证明本实验针对HBV的替诺福韦耐药位点设计的锁式探针具有较强的特异识别能力。

锁式探针是通过3’端末端来实现对检测模板基因突变位点的识别，只有二者完全互补才能发生连接反应，但不同种类的连接酶会影响探针识别和环化连接的特异性。E.coli连接酶不存在探针会发生自成环连接的现象这种问题。探针自成环连接会导致后续RCA反应的背景条带干扰，严重影响检测的特异性。本实验采用E.coli连接酶，在高浓度（终浓度1μmol/L）的突变型模板的环化连接实验和空白对照实验中均未见产物生成，而野生型模板的环化产物条带清晰、明亮。结果证明采用E.coli连接酶，探针不会发生自成环连接，同时也证明本发明设计的锁式探针特异性强，可准确识别检测模板中的单个碱基突变，能够用于HBV耐药基因的检测。

RCA扩增反应的特异性：

用双循环RCA扩增检测终浓度分别为500fM、5pM、50pM、和500pM的突变型模板，探讨RCA扩增反应的特异性。电泳结果显示各浓度的突变型模板均未见明显扩增产物条带（图5），证明本实验所建立的RCA扩增反应的特异性强。

RCA扩增反应的最低检测浓度：

采用单循环RCA和双循环RCA反应检测不同浓度野生型模板，RCA扩增产物电泳结果（如图6）所示。结果显示，单循环RCA在模板终浓度5p mol/L以下均未见扩增产物，模板终浓度50p mol/L以上均可见明亮条带（6-1），表明单循环RCA的最低检测浓度为50p mol/L。双循环RCA在模板终浓度500fmol/L以下均未见明显条带，模板终浓度5p mol/L以上均可见明亮条带（6-2），并且条带亮度明显强于单循环RCA。结果提示，双循环RCA的最低检测浓度为5p mol/L，其检测灵敏度较单循环RCA反应提高了10倍，能较好地满足低病毒载量标本的检测。

有益效果：本发明锁式探针结合RCA技术是一种检测基因位点突变的新方法，通过锁式探针特异识别靶基因的点突变位点，RCA扩增放大检测信号，并且通过RCA双循环扩增更加放大了检测信号。该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，在病原体耐药位点突变检测方面具有独特优势。

附图说明

图1MFOLD网站对环形探针的预测图。

图2杂交温度对锁式探针环化连接效率的影响。

图3杂交温度对锁式探针环化连接特异性的影响。

图4锁式探针环化连接产物电泳结果。

图5双循环RCA检测不同浓度的HBV替诺福韦耐药突变位点。

图6单循环RCA和双循环RCA检测不同浓度HBV替诺福韦耐药位点的野生型模板。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明：

实施例1

一种检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法，按照如下步骤完成：

a、锁式探针的环化连接与酶切：去离子水12μl、1μmol/L的锁式探针2μl、模板2μl和10×E.coli Buffer2μl，混匀，45℃孵育40min后，加入10×BSA缓冲液2μl和0.2μl E.coli DNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×Exonuclease I Buffer2μl和Exonuclease I核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活Exonuclease I核酸外切酶；

所述步骤a和e中所设计用于RCA反应的引物是：

引物5′-ATGGGCACCGAAGAAGCA-3′ SEQ NO1；

探针是：

锁式探针

5′

SEQ NO2。

序列表

<110> 检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法

<120>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院

<160> 6

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400> 5′-ATGGGCACCGAAGAAGCA-3′

<210> 2

<211> 78

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 锁式探针

<400> 5′-CCTACGAACCACTGAACTGCTTCTTCGGTGCCCATACATCAAATGCCACGTTAACAGTCAGGCCTAGTGGGGGAAAGC-3′

，探针的5′端进行磷酸化修饰

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>巯基化引物

<400>5′-AAAAAAAAAAAAATGGGCACCGAAGAAGCA-3′，引物的5′端进行巯基化修饰

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>荧光素标记探针

<400> 5′-CCTACGAACCACTGAACTGC-3′，探针的5′端进行荧光素修饰

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>野生型模板

<400>5′-ACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTT-3′

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变型模板

<400>5′-ACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGACTTTCCCCCACTGTTTGGCTT-3′

Claims

1.一种检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法，其特征在于，按照如下步骤完成：

d、锁式探针的连接：取步骤c制得的酶切的RCA产物35μl、1μM锁式探针1μl和10×E.coli Buffer4.5μl，混匀，45℃孵育40min；加入10×BSA缓冲液4.5μl和0.4μl E.coli DNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；加入10×Exonuclease I Buffer5μl和Exonuclease I核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活Exonuclease I核酸外切酶；

f、取步骤e制得的扩增产物5μl用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果；

所述步骤a和e中所设计用于RCA反应的引物是：

引物5′-ATGGGCACCGAAGAAGCA-3′ SEQ N01；

探针是：

锁式探针

5-CCTACGAACCACTGAACTGCTTCTTCGGTGCCCATACATCAAATGCCACGTTAACAGTCAGGCCTAGTGGGGGAAAGC-3′，探针的5′端进行磷酸化修饰

SEQ N02。

2.根据权利要求1所述的检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法，其特征在于：所述锁式探针中间序列加入HpaI核酸内切酶的酶切位点-GTTAAC-。