CN101871016A - 基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒及方法，该试剂盒根据鸭肠炎病毒基因保守区的六个特异区域设计了两条特异性内引物和两条特异性外引物，从而保证了环介导等温扩增的高度特异性和检测结果的可靠性；本发明基于环介导等温扩增技术检测鸭肠炎病毒，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，扩增产物直接用荧光染料显色即可凭肉眼判断结果，检测成本低，特别适合中小型单位和现场检测应用。

Description

基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种生物检测试剂盒及方法，特别涉及一种基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒及方法。

背景技术

鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)又称鸭瘟病毒(Duck plague virus，DPV)，主要感染鸭、鹅及多种雁形目禽类引起急性、致死性传染病——鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis，DVE)，俗称鸭瘟(Duck plague，DP)，往往造成巨大的经济损失，严重影响着水禽养殖业的健康发展。

目前，鸭肠炎病毒的检测方法主要有分离培养鉴定法、聚合酶链式反应(PCR)法和荧光定量PCR(FQ-PCR)法，但分离培养鉴定法操作繁琐、费时，PCR法和FQ-PCR法需要昂贵的仪器和试剂，检测成本高，不适合中小型单位和现场检测应用。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术与其它核酸扩增技术相比，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，成本低，已在病原微生物检测领域显示出广阔的发展前景。但至今尚未见基于环介导等温扩增技术检测鸭肠炎病毒的报道。

发明内容

有鉴于此，为克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒；目的之二在于提供一种使用所述基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒检测鸭肠炎病毒的方法；灵敏度高，特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合中小型单位和现场检测应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒，含有以下5组特异性引物中的任意1组：

①上游内引物FIP：5’-tccacgtcagtttgccgttc-atgtttggcattctacattcg-3’；

下游内引物BIP：5’-cagcgtaccacagataagtattgaa-tcgatattttagcagaagttcc-3’；

上游外引物F3：5’-ggataccgtctaatggctc-3’；

下游外引物B3：5’-tcaaaagctgcgtagagc-3’；

②上游内引物FIP：5’-actcagcgaggaggaggaaa-tctgctaaaatatcgaaagctct-3’；

下游内引物BIP：5’-cctgggtacaagcgcacttc-ctgtgagagtgacgaaacc-3’；

上游外引物F3：5’-ccttaatttcgatggggaact-3’；

下游外引物B3：5’-aaacgctttattccagaaaca-3’；

③上游内引物FIP：5’-gcgtagagctttcgatattttagca-atttattgtaaaatgtgcgacct-3’；

下游内引物BIP：5’-cgattttcctcctcctcgct-gcagcactgctatcttcg-3’；

上游外引物F3：5’-cgtaccacagataagtattgaag-3’；

下游外引物B3：5’-tgtgagagtgacgaaacc-3’；

④上游内引物FIP：5’-gtatccccggcaagcagatt-aatgccgtacatctacacta-3’；

下游内引物BIP：5’-catgtttggcattctacattcgtac-tacttatctgtggtacgctgt-3’；

上游外引物F3：5’-tgtaatgtacattccatttactgg-3’；

下游外引物B3：5’-cgaaattaaggtcgcacat-3’；

⑤上游内引物FIP：5’-tccacgtcagtttgccgttc-taccgtctaatggctcatg-3’；

下游内引物BIP：5’-cagcgtaccacagataagtattgaa-tcgatattttagcagaagttcc-3’；

上游外引物F3：5’-cttaaatctgcttgccgg-3’；

下游外引物B3：5’-tcgtcaaaagctgcgtag-3’。

进一步，还含有以下试剂中的一种或多种：嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst)DNA聚合酶、10×热聚合反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物(dNTPs)、硫酸镁、甜菜碱和荧光染料赛博绿I(SYBR Green I)；所述10×热聚合反应缓冲液由浓度为250mmol/L、pH为8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、浓度为100mmol/L的氯化钾、浓度为100mmol/L的硫酸铵、浓度为20mmol/L的硫酸镁和质量分数为1％的曲拉通(Triton)X-100组成；所述dNTPs由三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)组成。上述试剂均为常规试剂，可直接从商业渠道购得，通常在相关实验室中为常备试剂，故本发明试剂盒中可以不放入上述试剂，或仅放入上述试剂中的一种或几种，当然也可全部放入，提供多种选择以方便使用者购买。

2、使用所述基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒检测鸭肠炎病毒的方法，包括以下步骤：

a、提取待检样品的病毒DNA作为模板DNA，控制模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.6～2.0，浓度为10～100ng/μl；

b、鸭肠炎病毒的环介导等温扩增：在反应管中配制总体积为25μl的环介导等温扩增反应体系，由以下组分组成：浓度各为0.2μmol/L的上游内引物FIP和下游内引物BIP，浓度各为0.8μmol/L的上游外引物F3和下游外引物B3，8U嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶，1×热聚合反应缓冲液，浓度各为1mmol/L的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸，浓度为3mmol/L的硫酸镁，浓度为1mol/L的甜菜碱，待检模板DNA水溶液1μl，余量为水；将反应管于60～65℃水浴中保温反应45～90分钟，再于80～95℃水浴中保温3～5分钟终止反应；

c、显色检测：在反应管中加入质量分数为10％的荧光染料赛博绿I水溶液1μl，用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品中不含有鸭肠炎病毒；如果颜色变为绿色，说明待检样品中含有鸭肠炎病毒。

本发明的有益效果在于：本发明建立了基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒及方法，该试剂盒根据鸭肠炎病毒基因(Genbank Accession No.AF064639)保守区的六个特异区域设计了两条特异性内引物和两条特异性外引物，从而保证了环介导等温扩增的高度特异性和检测结果的可靠性；本发明基于环介导等温扩增技术检测鸭肠炎病毒，由四条引物对靶序列的六个特异区域进行识别，特异性强；在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间损失，耗时短，在1小时内即可将靶序列扩增至10⁹倍，而且受非靶序列的影响小，与PCR法相比灵敏度更高，检测限仅为几个拷贝；此外，该技术不需要特殊、昂贵的仪器和试剂，扩增产物不需要进行凝胶电泳，直接用荧光染料显色即可凭肉眼判断结果，操作简便快速，检测成本低。本发明的试剂盒及方法特别适合中小型单位和现场检测应用。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1

1、基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒，由以下试剂组成：

a、浓度各为5μmol/L的上游内引物FIP水溶液和下游内引物BIP水溶液，浓度各为20μmol/L的上游外引物F3水溶液和下游外引物B3水溶液：引物序列如下：

上游内引物FIP：5’-tccacgtcagtttgccgttc-atgtttggcattctacattcg-3’；

下游内引物BIP：5’-cagcgtaccacagataagtattgaa-tcgatattttagcagaagttcc-3’；

上游外引物F3：5’-ggataccgtctaatggctc-3’；

下游外引物B3：5’-tcaaaagctgcgtagagc-3’；

b、浓度为8U/μl的Bst DNA聚合酶水溶液；

c、10×热聚合反应缓冲液：由浓度为250mmol/L、pH为8.8的Tris-HCl、浓度为100mmol/L的氯化钾、浓度为100mmol/L的硫酸铵、浓度为20mmol/L的硫酸镁和质量分数为1％的Triton X-100组成；

d、浓度为10mmol/L的dNTPs水溶液：由浓度各为10mmol/L的dATP、dGTP、dCTP和dTTP组成；

e、浓度为100mmol/L的硫酸镁水溶液；

f、浓度为2mol/L的甜菜碱水溶液；

g、质量分数为10％的荧光染料SYBR Green I水溶液。

2、使用所述基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒检测鸭肠炎病毒的方法，包括以下步骤：

a、提取待检样品的病毒DNA作为模板DNA：本实施例同时设置实验组和空白对照组，其中实验组为鸭肠炎病毒，来源于四川农业大学禽病研究中心；采用DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取各组病毒DNA，按照试剂盒说明书操作，实验组所得病毒DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.8，浓度为20ng/μl。

b、鸭肠炎病毒的环介导等温扩增：在反应管中配制总体积为25μl的环介导等温扩增反应体系：加入浓度均为5μmol/L的上游内引物FIP水溶液和下游内引物BIP水溶液各1μl，浓度均为20μmol/L的上游外引物F3水溶液和下游外引物B3水溶液各1μl，浓度为8U/μl的Bst DNA聚合酶水溶液1μl，10×热聚合反应缓冲液2.5μl，浓度为10mmol/L的dNTPs水溶液2.5μl，浓度为100mmol/L的硫酸镁水溶液0.75μl，浓度为2mol/L的甜菜碱水溶液12.5μl，用无DNA酶的水稀释至24μl，再加入模板DNA水溶液1μl，混合均匀，即得；将反应管于60～65℃水浴中保温反应60分钟，再于80℃水浴中保温5分钟终止反应；

c、显色检测：在反应管中加入质量分数为10％的荧光染料赛博绿I水溶液1μl，振摇均匀，用肉眼观察颜色变化。

结果：空白对照组的颜色为黄色，说明不含有鸭肠炎病毒；实验组的颜色变为绿色，说明含有鸭肠炎病毒，与预期结果一致。

实施例2

1、基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒，与实施例1所述试剂盒的不同之处在于特异性引物序列不同，本试剂盒的引物序列如下：

上游内引物FIP：5’-actcagcgaggaggaggaaa-tctgctaaaatatcgaaagctct-3’；

下游内引物BIP：5’-cctgggtacaagcgcacttc-ctgtgagagtgacgaaacc-3’；

上游外引物F3：5’-ccttaatttcgatggggaact-3’；

下游外引物B3：5’-aaacgctttattccagaaaca-3’。

2、使用所述基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒检测鸭肠炎病毒的方法，与实施例1所述方法相同，结果发现：空白对照组的颜色为黄色，说明不含有鸭肠炎病毒；实验组的颜色变为绿色，说明含有鸭肠炎病毒，与预期结果一致。

实施例3

1、基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒，与实施例1所述试剂盒的不同之处在于特异性引物序列不同，本试剂盒的引物序列如下：

上游内引物FIP：5’-gcgtagagctttcgatattttagca-atttattgtaaaatgtgcgacct-3’；

下游内引物BIP：5’-cgattttcctcctcctcgct-gcagcactgctatcttcg-3’；

上游外引物F3：5’-cgtaccacagataagtattgaag-3’；

下游外引物B3：5’-tgtgagagtgacgaaacc-3’。

2、使用所述基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒检测鸭肠炎病毒的方法，与实施例1所述方法相同，结果发现：空白对照组的颜色为黄色，说明不含有鸭肠炎病毒；实验组的颜色变为绿色，说明含有鸭肠炎病毒，与预期结果一致。

实施例4

1、基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒，与实施例1所述试剂盒的不同之处在于特异性引物序列不同，本试剂盒的引物序列如下：

上游内引物FIP：5’-gtatccccggcaagcagatt-aatgccgtacatctacacta-3’；

下游内引物BIP：5’-catgtttggcattctacattcgtac-tacttatctgtggtacgctgt-3’；

上游外引物F3：5’-tgtaatgtacattccatttactgg-3’；

下游外引物B3：5’-cgaaattaaggtcgcacat-3’。

2、使用所述基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒检测鸭肠炎病毒的方法，与实施例1所述方法相同，结果发现：空白对照组的颜色为黄色，说明不含有鸭肠炎病毒；实验组的颜色变为绿色，说明含有鸭肠炎病毒，与预期结果一致。

实施例5

1、基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒，与实施例1所述试剂盒的不同之处在于特异性引物序列不同，本试剂盒的引物序列如下：

上游内引物FIP：5’-tccacgtcagtttgccgttc-taccgtctaatggctcatg-3’；

下游内引物BIP：5’-cagcgtaccacagataagtattgaa-tcgatattttagcagaagttcc-3’；

上游外引物F3：5’-cttaaatctgcttgccgg-3’；

下游外引物B3：5’-tcgtcaaaagctgcgtag-3’。

2、使用所述基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒检测鸭肠炎病毒的方法，与实施例1所述方法相同，结果发现：空白对照组的颜色为黄色，说明不含有鸭肠炎病毒；实验组的颜色变为绿色，说明含有鸭肠炎病毒，与预期结果一致。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>重庆市畜牧科学院、四川农业大学

<120>基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒及方法

<160>20

<210>1

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第①组上游内引物FIP

<400>1

tccacgtcag tttgccgttc atgtttggca ttctacattc g                  41

<210>2

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第①组下游内引物BIP

<400>2

cagcgtacca cagataagta ttgaatcgat attttagcag aagttcc           47

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第①组上游外引物F3

<400>3

ggataccgtc taatggctc                                          19

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第①组下游外引物B3

<400>4

tcaaaagctg cgtagagc                                    18

<210>5

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第②组上游内引物FIP

<400>5

actcagcgag gaggaggaaa tctgctaaaa tatcgaaagc tct       43

<210>6

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第②组下游内引物BIP

<400>6

cctgggtaca agcgcacttc ctgtgagagt gacgaaacc            39

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第②组上游外引物F3

<400>7

ccttaatttc gatggggaac t                               21

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第②组下游外引物B3

<400>8

aaacgcttta ttccagaaac a                                21

<210>9

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第③组上游内引物FIP

<400>9

gcgtagagc tttcgatattt tagcaattta ttgtaaaatgt gcgacct             48

<210>10

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第③组下游内引物BIP

<400>10

cgattttcct cctcctcgct gcagcactgc tatcttcg                        38

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第③组上游外引物F3

<400>11

cgtaccacag ataagtattg aag                                        23

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第③组下游外引物B3

<400>12

tgtgagagtg acgaaacc                                              18

<210>13

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第④组上游内引物FIP

<400>13

gtatccccgg caagcagatt aatgccgtac atctacacta                    40

<210>14

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第④组下游内引物BIP

<400>14

catgtttggc attctacatt cgtactactt atctgtggta cgctgt             46

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第④组上游外引物F 3

<400>15

tgtaatgtac attccattta ctgg                                     24

<210>16

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第④组下游外引物B3

<400>16

cgaaattaag gtcgcacat                                           19

<210>17

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第⑤组上游内引物FIP

<400>17

tccacgtcag tttgccgttc taccgtctaa tggctcatg                 39

<210>18

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第⑤组下游内引物BIP

<400>18

cagcgtacca cagataagta ttgaatcgat attttagcag aagttcc         47

<210>19

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第⑤组上游外引物F3

<400>19

cttaaatctg cttgccgg                                         18

<210>20

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第⑤组下游外引物B3

<400>20

tcgtcaaaag ctgcgtag                                         18

Claims (3)

1.基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒，其特征在于：含有以下5组特异性引物中的任意1组：

①上游内引物FIP：5’-tccacgtcagtttgccgttc-atgtttggcattctacattcg-3’；

  下游内引物BIP：5’-cagcgtaccacagataagtattgaa-tcgatattttagcagaagttcc-3’；

  上游外引物F3：5’-ggataccgtctaatggctc-3’；

  下游外引物B3：5’-tcaaaagctgcgtagagc-3’；

②上游内引物FIP：5’-actcagcgaggaggaggaaa-tctgctaaaatatcgaaagctct-3’；

  下游内引物BIP：5’-cctgggtacaagcgcacttc-ctgtgagagtgacgaaacc-3’；

  上游外引物F3：5’-ccttaatttcgatggggaact-3’；

  下游外引物B3：5’-aaacgctttattccagaaaca-3’；

③上游内引物FIP：5’-gcgtagagctttcgatattttagca-atttattgtaaaatgtgcgacct-3’；

  下游内引物BIP：5’-cgattttcctcctcctcgct-gcagcactgctatcttcg-3’；

  上游外引物F3：5’-cgtaccacagataagtattgaag-3’；

  下游外引物B3：5’-tgtgagagtgacgaaacc-3’；

④上游内引物FIP：5’-gtatccccggcaagcagatt-aatgccgtacatctacacta-3’；

  下游内引物BIP：5’-catgtttggcattctacattcgtac-tacttatctgtggtacgctgt-3’；

  上游外引物F3：5’-tgtaatgtacattccatttactgg-3’；

  下游外引物B3：5’-cgaaattaaggtcgcacat-3’；

⑤上游内引物FIP：5’-tccacgtcagtttgccgttc-taccgtctaatggctcatg-3’；

  下游内引物BIP：5’-cagcgtaccacagataagtattgaa-tcgatattttagcagaagttcc-3’；

  上游外引物F3：5’-cttaaatctgcttgccgg-3’；

  下游外引物B3：5’-tcgtcaaaagctgcgtag-3’。

2.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒，其特征在于：还含有以下试剂中的一种或多种：嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶、10×热聚合反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物、硫酸镁、甜菜碱和荧光染料赛博绿I；所述10×热聚合反应缓冲液由浓度为250 mmol/L、pH为8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、浓度为100 mmol/L的氯化钾、浓度为100 mmol/L的硫酸铵、浓度为20 mmol/L的硫酸镁和质量分数为1％的曲拉通X-100组成；所述三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物由三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸组成。

3.使用权利要求1所述的基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒检测鸭肠炎病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、提取待检样品的病毒DNA作为模板DNA，控制模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.6～2.0，浓度为1 0～1 00 ng/μl；

b、鸭肠炎病毒的环介导等温扩增：在反应管中配制总体积为25 μl的环介导等温扩增反应体系，由以下组分组成：浓度各为0.2 μmol/L的上游内引物FIP和下游内引物BIP，浓度各为0.8 μmol/L的上游外引物F3和下游外引物B3，8 U嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶，1×热聚合反应缓冲液，浓度各为1 mmol/L的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸，浓度为3 mmol/L的硫酸镁，浓度为1 mol/L的甜菜碱，待检模板DNA水溶液1μl，余量为水；将反应管于60～65℃水浴中保温反应20～60分钟，再于80～95℃水浴中保温3～5分钟终止反应；

c、显色检测：在反应管中加入质量分数为10％的荧光染料赛博绿I水溶液1μl，用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品中不含有鸭肠炎病毒；如果颜色变为绿色，说明待检样品中含有鸭肠炎病毒。