CN115820939A - 用于猴痘病毒检测的crRNA、核酸分子组合物、检测体系及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于猴痘病毒检测的crRNA、核酸分子组合物、检测体系及应用，所述crRNA包括至少一组如SEQ ID NO 1‑6所示核苷酸序列。核酸分子组合物包括crRNA和RAA引物对，所述crRNA包括SEQ ID NO 1‑6所示的核苷酸序列。本发明检测体系为CRISPR‑Cas12检测体系或CRISPR‑Cas13检测体系或CRISPR‑Cas12‑Cas13双通道检测体系。本发明基于猴痘病毒基因，设计了猴痘病毒特异性crRNA，同时结合CRISPR‑Cas荧光/适配体检测系统，可以短时间检测出是否存在猴痘病毒，能特异性区分不同亚型的猴痘病毒，且操作方便，不需要精密的仪器，特异性好、灵敏度高，最低检测限可达4copies。本发明建立的CRISPR‑Cas12‑Cas13双通道检测体系可检测在一个样本中除了猴痘病毒外是否带有其它病毒，进一步丰富了检测内容。
Description
技术领域
本发明涉及病原检测技术领域。更具体地，涉及一种用于猴痘病毒检测的crRNA、核酸分子组合物、CRISPR-Cas检测体系及试剂盒。
背景技术
猴痘是一种由正痘病毒引起的人畜共患疾病，会导致人类患上类似天花的疾病。感染猴痘的早期症状包括发热、头痛、肌肉疼痛、淋巴结肿大、发冷和疲倦，其后身上出现类似水泡的皮疹并愈合。加强对猴痘病例的监测和检测是了解这种疾病不断变化的流行病学的重要工具。
CRISPR-Cas系统广泛存在于细菌和古细菌中，构成了针对外来入侵核酸的获得性免疫系统，其防御过程包括三个阶段：间隔序列获取，合成crRNA和靶标干扰。通常，CRISPR-Cas系统由CRISPR RNA(crRNA)和Cas蛋白组成，crRNA与靶序列互补，可引导Cas蛋白进行序列特异性识别和切割。
其中CRISPR-Cas系统中Cas12和Cas13系统，跟Cas9系统不同，Cas12和Cas13蛋白具有反式切割活性，蛋白在crRNA的引导下特异性地靶向双链DNA/单链RNA(dsDNA/RNA)并激活其反式切割活性，不加区别的切割非特异性单链DNA/RNA(ssDNA/ssRNA)。Cas12系统识别双链DNA，反式切割识别单链DNA；Cas13系统识别RNA，反式切割识别的也是RNA。有研究发现，靶向的RNA浓度为1～10p mol/L时，仅0.02％Cas13a系统被激活，而剪切效率却可达到25％～50％，每个靶向剪切将会导致后续更多的非特异性靶向剪切活性，对信号进行了放大，可在短时间内检测到特异性增强的荧光信号。因此Cas12和Cas13系统在检测领域迅速发展起来。
病毒的诊断包括临床诊断和实验室诊断，由于猴痘病毒复杂的情况，目前确证猴痘的最有效途径就是进行实验室诊断，常用的方法包括病原学诊断、血清诊断法、分子生物学诊断方法等。最传统的检测方式是病毒分离法，但该方法耗时实验周期长。目前已有的快速检测方法是实时荧光PCR法，但探针购买昂贵，且需依赖一套复杂的热循环系统才能达到扩增核酸的目的，无法运用于即时诊断。相较于此，新的等温扩增技术的优势便突显出来，已成为一种有应用前景的现场检测方法。重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)，可实在恒温条件下短时间内对样品进行大量的扩增，操作简单，不受仪器的限制。但当模板浓度低时，可出现非特异性扩增，容易产生假阳性情况。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种用于猴痘病毒检测的crRNA及核酸分子组合物，可与猴痘病毒的DNA/RNA结合，从而进行检测。本发明的目的之二在于提供猴痘病毒检测CRISPR-Cas检测体系，可以短时间检测出是否存在猴痘病毒，能特异性区分不同亚型的猴痘病毒。
为实现上述目的，本发明公开了一种用于猴痘病毒检测的crRNA，所述crRNA包括至少一组如SEQ ID NO 1-6所示核苷酸序列。
进一步的，所述crRNA包括SEQ ID NO 1-6所示的核苷酸序列。
本发明公开了一种用于猴痘病毒检测的核酸分子组合物，包括crRNA和RAA引物对，所述crRNA包括SEQ ID NO 1-6所示的核苷酸序列，所述RAA引物对包括至少一组以下的引物对：
(1)SEQ ID NO 7所示的上游引物序列和SEQ ID NO 8所示的下游引物序列。
(2)SEQ ID NO 9所示的含T7启动子的上游引物序列和SEQ ID NO 10所示的下游引物序列。
(3)SEQ ID NO 11所示的上游引物序列和SEQ ID NO 12所示的下游引物序列。
(4)SEQ ID NO 13所示的含T7启动子的上游引物序列和SEQ ID NO 14所示的下游引物序列。
(5)SEQ ID NO 15所示的上游引物序列和SEQ ID NO 16所示的下游引物序列。
(6)SEQ ID NO 17所示的含T7启动子的上游引物序列和SEQ ID NO 18所示的下游引物序列。
本发明还公开了上述的crRNA或核酸分子组合物在猴痘病毒检测中的应用。
进一步的，本发明公开了一种用于猴痘病毒检测的CRISPR-Cas检测体系，包括上述的crRNA或者上述的核酸分子组合物。
优选的，所述的检测体系为CRISPR-Cas12检测体系或CRISPR-Cas13检测体系或CRISPR-Cas12-Cas13双通道检测体系。
优选的，还包括ssRNA报告分子或/和ssDNA报告分子，所述ssDNA报告分子的序列为5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’或者其序列为5’-HEX-TTATT-BHQ1-3’；所述ssRNA报告分子的序列为5’-FAM-rUrUrUrUrU-BHQ1-3’。
优选的，还包括ThT适配体或Mango III适配体，ThT适配体序列为：
5’-CGAGGCTATTAGGAGGTGGGATGC-3’。
所述Mango III适配体序列为：
5’-GGCACGUACGAAGGAAGGAUUGGUAUGUGGUAUAUUCGUACGUGCC-3’。
其中，所述双通道检测包括猴痘病毒与猴痘病毒亚型、HIV病毒以及新冠病毒中任一种病毒的混合感染检测，或者两种猴痘病毒亚型的混合感染检测。
本发明还公开了一种用于猴痘病毒检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述的crRNA，或者上述的核酸分子组合物，或者上述的CRISPR-Cas检测体系。
与现有技术相比，本发明的优势为：
1、本发明检测方法基于猴痘病毒基因，设计了猴痘病毒特异性crRNA，同时结合CRISPR-Cas荧光/适配体检测系统，能特异性区分不同亚型的猴痘病毒，且操作方便，不需要精密的仪器。方法简单、特异性好、灵敏度高，最低检测限可达4copies/μL,且在紫外下可视化。
2、本发明用于猴痘病毒检测的CRISPR-Cas检测体系为基于CRISPR-Cas检测结合RAA恒温扩增技术检测猴痘病毒的方法，可以短时间检测出是否存在猴痘病毒，检测覆盖面广。
3、本发明建立了CRISPR-Cas双通道检测方法，将Cas12a系统与Cas13a系统联合建立双通道检测，包括了RAA-CRISPR-Cas 12a/13a探针法和RAA-CRISPR-Cas12a/13a联合ThT/Mango适配体法，CRISPR-Cas12a-Cas13a双基因检测，为猴痘及其他疾病的监测与防控提供方案。可扩大猴痘病毒的检测范围，可鉴定猴痘病毒亚型，同时可检测猴痘病毒与其它病毒(如：HIV病毒或者新冠病毒)或者两种猴痘病毒亚型的混合感染。
附图说明
图1为特异性试验图。
图2为RAA-CRISPR-Cas12a探针法检测猴痘病毒灵敏度图。
图3为RAA-CRISPR-Cas12a探针法检测猴痘病毒刚果分支灵敏度图。
图4为RAA-CRISPR-Cas12a探针法检测猴痘病毒西非分支灵敏度图。
图5为RAA-CRISPR-Cas12a-ThT适配体法检测猴痘病毒灵敏度图。
图6为RAA-CRISPR-Cas13a探针法检测猴痘病毒灵敏度图。
图7为RAA-CRISPR-Cas13a探针法检测猴痘病毒刚果分支灵敏度图。
图8为RAA-CRISPR-Cas13a探针法检测猴痘病毒西非分支灵敏度图。
图9为RAA-CRISPR-Cas13a-Mango适配体法检测猴痘病毒灵敏度图。
图10为CRISPR-Cas12a-13a双通道检测图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述。
本发明公开了猴痘病毒检测方法，包括特异性crRNA的设计、体外转录和纯化，Cas12a/13a蛋白的表达与纯化，含有猴痘病毒部分片段的质粒提取，CRISPR-Cas检测体系的建立，RAA-CRISPR-Cas检测方法的建立，以及CRISPR-Cas12a-13a双通道检测方法的建立，结果判断。具体过程详述如下。
实施例一.CRISPR-Cas检测体系的建立
S1：基于CRISPR-Cas的猴痘病毒检测方法的引物设计
1、特异性crRNA的设计
登录NCBI，根据GenBank中的3360条猴痘病毒基因序列，通过比对，作为检测靶向区，设计crRNA。其中猴痘病毒通用crRNA选自F3L片段，猴痘病毒刚果金分支crRNA选自C3L片段，猴痘病毒西非分支sgRNA选自G2R片段。
2.crRNA的体外转录和纯化
将设计的crRNA的序列5’端，引入T7序列，并合成用于体外转录的模板。采用T7RAN转录试剂盒(T7High Yield RNA Transcription Kit,诺唯赞)体外转录制备crRNA。crRNA序列如表1所示。
表1：crRNA序列表
3、构建含有靶向序列的重组质粒pUC57-MPXV,pUC57-MPXV-CA,pUC57-MPXV-WA下载针对检测猴痘病毒的基因序列，送于通用生物公司合成。序列如表2所示。
S2.原核系统中LbCas12a/huLwCas13a蛋白的表达与纯化
1.蛋白表达
在Addgene上获得质粒pMBP-LbCas12a，包含10xHis-MBP标签、TEV位点；质粒pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a，包含6xHis标签、SUMO位点。取质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中。筛选鉴定后在含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养过夜。次日按1:100的比例转移菌液至新的含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养至OD 600为0.6后，加入诱导剂IPTG使其终浓度为0.1mM，在18℃下诱导表达16h。
2.蛋白纯化
将步骤1中获得的菌液4℃，3500rpm离心30min收集沉淀，用buffer A(25mM Tris，150mM NaCl，25mM Imidazole，10％glycerol，Final PH 7.5)重悬后，反复冻融3次，使用超声波细胞粉碎机(KS-1200DN型，昆山洁力美超声仪器有限公司)超声处理(超声条件：工作3s，停2s，功率35％)直至细胞液清亮。而后，20000rpm，4℃离心1h，收集上清。
将上清加载到5mL His TrapTM FF crud(G EHealthcare Life Sciences)，通过蛋白纯化仪(AKTAexplorer,GE公司)对目的蛋白进行洗脱，用SDS-PAGE验证后，进行酶切。将酶切产物加载到5mL His TrapTM FF crud(G E Healthcare Life Sciences)，通过蛋白纯化仪对蛋白进行洗脱，经SDS-PAGE验证后，用BCA(Bicinchoninic Acid)蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后在放置-80℃存储。
S3.初步建立猴痘病毒CRISPR-Cas12a/13a检测体系
1.LbCas12a与crRNA最佳比例筛选
将LbCas12a与crRNA根据不同浓度进行组合，LbCas12a与crRNA摩尔比从1：0.5～1：2，0.25为一个梯度，LbCas12为100nM，以pUC57-Monkeypox为阳性模板，pUC57空载为阴性对照，在同一反应条件下，选出最佳反应体系。考虑成本以及实验效果，最终最佳反应体系为100nM LbCas12a与200nM crRNA。
2.huLwCas13a与crRNA最佳比例筛选
根据文献推荐huLwCas13a与crRNA摩尔比为2：1，因此后期反应体系中huLwCas13a为100nM，crRNA为50nM。
3.CRISPR-Cas 12a探针法
反应体系如下：
①100nM纯化的LbCas12a；
②200nM crRNA；
③2μL质粒DNA；质粒DNA提取按照FastPure Plasmid Mini Kit说明操作，用NanoPhotometer-N50测定浓度后，放置-20℃储存备用。
④250nM淬灭荧光ss DNA报告分子(ss DNA FQ-labeled reporter)：其序列为5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’，其中，5’-TTATT-3’，5'端修饰为FAM，3'端修饰为BHQ1。或者其序列为5’-HEX-TTATT-BHQ1-3’，其中5’-TTATT-3’，5'端修饰为HEX，3'端修饰为BHQ1；
⑤RNase抑制剂(1U/μL)；
混合于Cas12a反应缓冲液(20mM HEPES,10mM MgCl2,pH 7.9)中，反应体积为20μL。
放置ROCHE LightCycler 96实时荧光定量PCR仪，收集荧光值。程序设置:37℃，每30s收集一次荧光，60次。
4.CRISPR-Cas 13a探针法
反应体系如下：
①100nM纯化的huLwCas13a；
②50nM crRNA；
③RNA模板；
④300nM淬灭荧光ssRNA报告分子(ss RNA FQ-labeled reporter)，其序列为5’-FAM-rUrUrUrUrU-BHQ1-3’，其中，5’-rUrUrUrUrU-3’，5'端修饰为FAM，3'端修饰为BHQ1；
⑤RNase抑制剂(1U/μL)；
混合于Cas13a反应缓冲液(20mM HEPES,10mM MgCl2,pH 7.9)中，反应体积为20μL。
混合均匀后，放置ROCHE LightCycler 96实时荧光定量PCR仪，收集荧光值。程序设置:37℃，每30s收集一次荧光，60次。
5、CRISPR-Cas12a-Cas13a探针法
CRISPR-Cas12a-Cas13a探针法的完整检测体系为：
①50nM纯化的huLwCas13a；
②25nM Cas13a-crRNA；
③300nM纯化的LbCas12a；
④600nM Cas12a-crRNA；
⑤500nM淬灭荧光ssDNA报告分子；
⑥300nM淬灭荧光ssRNA报告分子；
⑦T7RNA聚合酶(2.5U/μL)；
⑧NTP mix(1mM)；
⑨RNA酶抑制剂(1U/μL)；
⑩2μL DNA模板；
混合于反应缓冲液(20mM HEPES,10mM MgCl2,pH 7.9)中，反应体积为20μL。
放置ROCHE LightCycler 96实时荧光定量PCR仪，收集荧光值(FAM和HEX)。程序设置:37℃，每30s收集一次荧光，60次。
6.CRISPR-Cas 12a-ThT适配体法
反应体系如下：
①100nM纯化的LbCas12a；
②200nM crRNA；
③1μM ssDNA-ThT适配体，ThT适配体，其序列为
CGAGGCTATTAGGAGGTGGGATGC(SEQ ID NO 13)；
④RNase抑制剂(1U/μL)，
⑤2μL质粒DNA，
混合于Cas12a反应缓冲液(100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,100μg/mLBSA,pH 7.9)中，反应体积为20μL。
混合均匀后37℃，35min。加入5mM ThT染料，在312nm紫外灯下观察显色。放置全波长多功能酶标仪Varioskan Flash，溶液在425nm处被激发，在450-650nm波长范围内监测发射，收集在490nm的荧光发射强度。
7、CRISPR-Cas13a-Mango适配体法
反应体系如下：
①100nM纯化的huLwCas13a；
②50nM crRNA；
③3μM Mango III适配体；Mango III适配体，其序列为
GGCACGUACGAAGGAAGGAUUGGUAUGUGGUAUAUUCGUACGUCC(SEQ ID NO 14)；
④220nM TO3-3PEG-Biotin染料；
⑤RNA模板；
⑥RNase抑制剂(1U/μL)；
混合于Cas13a反应缓冲液(20mM HEPES,10mM MgCl2,pH 7.9)中，反应体积为20μL。
混合均匀后37℃，20min。在312nm紫外灯下观察显色。放置全波长多功能酶标仪Varioskan Flash，溶液在580nm处被激发，在500-800nm波长范围内监测发射，收集在656nm的荧光发射强度。
S4.检测结果判断
1、CRISPR-Cas12a/13a探针法/CRISPR-Cas12a-Cas13a探针法：将待测样品加入到上述反应体系中，若待测样品中含有猴痘病毒的DNA/RNA时，crRNA序列可与靶标DNA/RNA结合，被Cas蛋白识别并改变其构象，激活切割活性，非特异的切割淬灭荧光报告分子，释放出荧光。收集最初荧光值和最后的荧光值的差值，将实验组与阴性对照组，进行生物统计学分析，是否存在差异，若存在差异则为阳性结果，若无差异测为阴性结果。其中CRISPR-Cas12a/13a探针法的反应产物可在紫外下观察颜色，若反应液呈绿色为阳性结果，若呈透明或者浅绿色为阴性结果。
2、CRISPR-Cas12a/13a适配体法：将待测样品加入到上述反应体系中，若待测样品中含有猴痘病毒的DNA/RNA时，crRNA序列可与靶标DNA/RNA结合，被Cas蛋白识别并改变其构象，激活切割活性，非特异的切割ThT/Mango适配体。紫外灯下，反应液呈绿色/红色为阴性结果，透明或者相对浅绿色/浅红色为阳性结果；收集在490nm/580nm的荧光发射强度，将实验组与阴性对照组，进行生物统计学分析，是否存在差异，若存在差异则为阳性结果，若无差异测为阴性结果。
实施例二.RAA-CRISPR-Cas检测方法的建立
在实施例一的基础上继续进行RAA-CRISPR-Cas检测，具体方法如下详述：
针对猴痘病毒通用检测方法，特异性试验选择的模板为：鼠痘病毒ECTV(AF012825)，牛痘病毒CPXVA(F482758)，天花病毒VARV-1(L22579)，天花病毒VARV-2(NC001611)，天花病毒VARV-3(Y16780)，猴痘病毒MPXV，NC各2μL加入CRISPR-Cas12a/13a检测体系中进行特异性试验；猴痘病毒西非亚型检测方法，特异性试验选择的模板为：天花病毒VARV(L22579)，猴痘病毒刚果分支亚型MPXV-CA，猴痘病毒西非亚型MPXV-WA，NC各2μL加入CRISPR-Cas12a/13a检测体系中进行特异性试验；猴痘病毒刚果分支亚型检测方法，特异性试验选择的模板为：鼠痘病毒ECTV(AF482758)，猴痘病毒刚果分支亚型MPXV-CA，NC各2μL加入CRISPR-Cas12a/13a检测体系中进行特异性试验。具体序列见表2，试验结果如图1所示。
表2模板序列
S5.RAA-CRISPR-Cas检测方法的建立
根据筛选的最佳crRNA序列位置的两端，设计相应的RAA引物如下表3所示：
表3.RAA引物
RAA反应体系及条件：缓冲液V：25μL；引物F(10μM)：2μL；引物R(10μM)：2μL；
乙酸镁Ⅰ：5μL；模板2μL加水共50μL。39℃条件下，反应30min。
将RAA产物取2μL加入CRISPR-Cas12a/13a探针法体系中，37℃条件下，反应30min，收集荧光增值判断阴阳性。
将RAA产物取2μL于CRISPR-Cas12a-ThT适配体法体系中，37℃条件下，反应30min，加入5mM ThT染料判断阴阳性。
将RAA产物取2μL于CRISPR-Cas13a-Mango适配体法体系中，37℃条件下，反应20min判断阴阳性。
1、RAA-CRISPR-Cas12a探针法
将合成的MPXV DNA序列(2μL)作为RAA反应(39℃,30min)的模板。RAA-CRISPR-Cas12a探针法的完整检测体系为：
①100nM纯化的LbCas12a；
②200nM crRNA，2μL RAA产物；
③250nM淬灭荧光ssDNA报告分子；
④RNase抑制剂(1U/μL)；
混合于Cas12a反应缓冲液(20mM HEPES,10mM MgCl2,pH 7.9)中，反应体积为20μL。
放置ROCHE LightCycler 96实时荧光定量PCR仪，收集荧光值。程序设置:37℃，每30s收集一次荧光，60次。
2、RAA-CRISPR-Cas12a-ThT适配体法
将合成的MPXV DNA序列(2μL)作为RAA反应(39℃,30min)的模板。
RAA-CRISPR-Cas12a-ThT适配体法的完整检测体系为：
①100nM纯化的LbCas12a；
②200nM crRNA,2μLRAA产物；
③1μM ThT适配体；
④RNase抑制剂(1U/μL)；
混合于Cas12a反应缓冲液(100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,100μg/mLBSA,pH 7.9)中，反应体积为20μL。
将混合液置于PCR管(Cellpro,江苏,中国)中，在C1000Touch热循环仪(Bio-Rad)中37℃反应35min。加入5mM ThT染料，在312nm紫外灯下观察显色。放置全波长多功能酶标仪Varioskan Flash，溶液在425nm处被激发，在450-650nm波长范围内监测发射，收集在490nm的荧光发射强度。
3、RAA-CRISPR-Cas13a探针法
将合成的MPXV DNA序列(2μL)作为RAA反应(39℃,30min)的模板。
RAA-CRISPR-Cas13a探针法的完整检测体系为：
①100nM纯化的huLwCas13a；
②50nM crRNA，T7RNA聚合酶(2.5U/μL)；
③NTP mix(1mM)；
④RNase抑制剂(1U/μL)；
⑤2μLRAA产物；
⑥250nM淬灭荧光ssRNA报告分子；
混合于Cas13a反应缓冲液(20mM HEPES,10mM MgCl2,pH 7.9)中，反应体积为20μL。
放置ROCHE LightCycler 96实时荧光定量PCR仪，收集荧光值。程序设置:37℃，每30s收集一次荧光，60次。
4、RAA-CRISPR-Cas13a-Mango适配体法
将合成的MPXV DNA序列(2μL)作为RAA反应(39℃,30min)的模板。
RAA-CRISPR-Cas13a-Mango适配体法的完整检测体系为：
①100nM纯化的huLwCas13a；
②50nM crRNA；
③T7RNA聚合酶(2.5U/μL)；
④NTP mix(1mM)；
⑤RNase抑制剂(1U/μL)；
⑥2μLRAA产物；
⑦3μM Mango III；
⑧220nM TO3-3PEG-Biotin染料；
混合于Cas13a反应缓冲液(20mM HEPES,10mM MgCl2,pH 7.9)中，反应体积为20μL。
将混合液置于PCR管(Cellpro,江苏,中国)中，在C1000Touch热循环仪(Bio-Rad)中37℃反应20min。在312nm紫外灯下观察显色。放置全波长多功能酶标仪VarioskanFlash，溶液在580nm处被激发，在500-800nm波长范围内监测发射，收集在656nm的荧光发射强度。
S6.RAA-CRSPR-Cas12a/13a灵敏性试验
1、RAA-CRISPR-Cas12a探针法检测猴痘病毒
以质粒pUC57-MPXV为模板，进行稀释即2×103、2×102、2×25、2×101、2×100copies/μL。取2μL于RAA反应体系中，39℃条件下，30min。取4μL RAA产物于CRISPR-Cas12a探针法体系中，进行灵敏性试验。其中空载pUC57为阴性对照。RAA-CRISPR-Cas12a探针法最低可检测到4copies，试验结果如图2。
2、RAA-CRISPR-Cas12a探针法检测猴痘病毒刚果金分支
以质粒pUC57-MPXV-CA为模板，进行10倍梯度稀释即2×104、2×103、2×102、2×101、2×100copies/μL。取2μL于RAA反应体系中，39℃条件下，30min。取4μL RAA产物于CRISPR-Cas12a探针法体系中，进行灵敏性试验。其中空载pUC57为阴性对照。RAA-CRISPR-Cas12a探针法最低可检测到40copies，试验结果如图3。
3、RAA-CRISPR-Cas 12a探针法检测猴痘病毒西非分支
以质粒pUC57-MPXV-WA为模板，进行10倍梯度稀释即2×104、2×103、2×102、2×101、2×100copies/μL。取2μL于RAA反应体系中，39℃条件下，30min。取4μL RAA产物于CRISPR-Cas12a探针法体系中，进行灵敏性试验。其中空载pUC57为阴性对照。RAA-CRISPR-Cas12a探针法最低可检测到4000copies，试验结果如图4。
4、RAA-CRISPR-Cas12a-ThT适配体法检测
以质粒pUC57-MPXV为模板，进行10倍梯度稀释即2×103、2×102、2×25、2×101、2×100copies/μL。取2μL于RAA反应体系中，39℃条件下，30min。取2μL RAA产物于CRISPR-Cas12a-ThT法体系中，进行灵敏性试验。RAA-CRISPR-Cas12a-ThT适配体法最低可检测到100copies，试验结果如图5。
5、RAA-CRISPR-Cas13a探针法检测猴痘病毒
以质粒pUC57-MPXV为模板，进行10倍梯度稀释即2×104、2×103、2×102、2×101、2×100copies/μL。取2μL于RAA反应体系中，39℃条件下，30min。取2μL RAA产物于CRISPR-Cas13a-Mango适配体法体系中，进行灵敏性试验。其中空载pUC57为阴性对照。RAA-CRISPR-Cas13a探针法最低可检测到4copies，试验结果如图6。
RAA-CRISPR-Cas13a探针法检测猴痘病毒刚果金分支
以质粒pUC57-MPXV-CA为模板，进行10倍梯度稀释即2×104、2×103、2×102、2×101、2×100copies/μL。取2μL于RAA反应体系中，39℃条件下，30min。取2μL RAA产物于CRISPR-Cas13a探针法体系中，进行灵敏性试验。其中空载pUC57为阴性对照。RAA-CRISPR-Cas13a探针法最低可检测至4copies，试验结果如图7。
7、RAA-CRISPR-Cas13a探针法检测猴痘病毒西非分支
以质粒pUC57-MPXV-WA为模板，进行10倍梯度稀释即2×104、2×103、2×102、2×101、2×100copies/μL。取2μL于RAA反应体系中，39℃条件下，30min。取4μL RAA产物于CRISPR-Cas13a探针法体系中，进行灵敏性试验，RAA-CRISPR-Cas13a探针法针对质粒pUC57-猴痘病毒西非分支最低可检测至4copies，试验结果如图8。
8、RAA-CRISPR-Cas13a-Mango适配体法检测猴痘病毒
以质粒pUC57-MPXV为模板，进行10倍梯度稀释即2×104、2×103、2×102、2×101、2×100copies/μL。取2μL于RAA反应体系中，39℃条件下，30min。取2μL RAA产物于CRISPR-Cas13a-Mango适配体法体系中，进行灵敏性试验。其中空载pUC57为阴性对照。RAA-CRISPR-Cas13a-Mango适配体法最低可检测到4copies，试验结果如图9。
实施例三.CRISPR-Cas12a-13a双通道检测方法的建立
本实施例在实施例一和实施例二的基础上，将Cas12a系统与Cas13a系统联合建立双通道检测，具体方法如下：
1、CRISPR-Cas12a-Cas13a双通道检测探针法
CRISPR-Cas12a-Cas13a探针法的完整检测体系为：
①50nM纯化的huLwCas13a；
②25nM Cas13a-crRNA；
③300nM纯化的LbCas12a；
④600nM Cas12a-crRNA；
⑤500nM淬灭荧光ssDNA报告分子；
⑥300nM淬灭荧光ssRNA报告分子；
⑦T7RNA聚合酶(2.5U/μL)；
⑧NTP mix(1mM)；
⑨RNase抑制剂(1U/μL)；
⑩2μL DNA模板；
混合于反应缓冲液(20mM HEPES,10mM MgCl2,pH 7.9)中，反应体积为20μL。放置ROCHE LightCycler 96实时荧光定量PCR仪，收集荧光值(FAM和HEX)。程序设置:37℃，每30s收集一次荧光，60次。
2、猴痘病毒双通道检测探针法
猴痘病毒双通道检测探针法的完整检测体系为：
①50nM纯化的huLwCas13a；
②25nM Cas13a-crRNA(猴痘病毒)；
③300nM纯化的LbCas12a；
④600nM Cas12a-crRNA(猴痘病毒刚果金分支)；
⑤500nM淬灭荧光ssDNA报告分子；
⑥300nM淬灭荧光ssRNA报告分子；
⑦T7RNA聚合酶(2.5U/μL)；
⑧NTP mix(1mM)；
⑨RNase抑制剂(1U/μL)；
⑩2μL DNA模板；
混合于反应缓冲液(20mM HEPES,10mM MgCl2,pH 7.9)中，反应体积为20μL。
放置ROCHE LightCycler 96实时荧光定量PCR仪，收集荧光值(FAM和HEX)。程序设置:37℃，每30s收集一次荧光，60次，结果如图10。
3、猴痘病毒分型检测探针法
猴痘病毒分型检测探针法的完整检测体系为：
①50nM纯化的huLwCas13a；
②25nM Cas13a-crRNA(猴痘病毒西非分支)；
③300nM纯化的LbCas12a；
④600nM Cas12a-crRNA(猴痘病毒刚果金分支)；
⑤500nM淬灭荧光ssDNA报告分子；
⑥300nM淬灭荧光ssRNA报告分子；
⑦T7RNA聚合酶(2.5U/μL)；
⑧NTP mix(1mM)；
⑨RNase抑制剂(1U/μL)；
⑩2μL DNA模板；
混合于反应缓冲液(20mM HEPES,10mM MgCl2,pH 7.9)中，反应体积为20μL。
放置ROCHE LightCycler 96实时荧光定量PCR仪，收集荧光值(FAM和HEX)。程序设置:37℃，每30s收集一次荧光，60次，结果如图10。
4、HIV与猴痘病毒双通道检测法
HIV与猴痘病毒双通道检测法的完整检测体系为：
①50nM纯化的huLwCas13a；
②25nM Cas13a-crRNA(猴痘病毒)；
③300nM纯化的LbCas12a；
④600nM Cas12a-crRNA(HIV)；
⑤500nM淬灭荧光ssDNA报告分子；
⑥300nM淬灭荧光ssRNA报告分子；
⑦T7RNA聚合酶(2.5U/μL)；
⑧NTP mix(1mM)；
⑨RNase抑制剂(1U/μL)；
⑩2μL DNA模板；
混合于反应缓冲液(20mM HEPES,10mM MgCl2,pH 7.9)中，反应体积为20μL。
放置ROCHE LightCycler 96实时荧光定量PCR仪，收集荧光值(FAM和HEX)。程序设置:37℃，每30s收集一次荧光，60次，结果如图10。
5、新冠病毒与猴痘病毒双通道检测法
新冠病毒与猴痘病毒双通道检测法的完整检测体系为：
①50nM纯化的huLwCas13a；
②25nM Cas13a-crRNA(猴痘病毒)；
③300nM纯化的LbCas12a；
④600nM Cas12a-crRNA(新冠病毒)；
⑤500nM淬灭荧光ssDNA报告分子；
⑥300nM淬灭荧光ssRNA报告分子；
⑦T7RNA聚合酶(2.5U/μL)；
⑧NTP mix(1mM)；
⑨RNase抑制剂(1U/μL)；
⑩2μL DNA模板；
混合于反应缓冲液(20mM HEPES,10mM MgCl2,pH 7.9)中，反应体积为20μL。
放置ROCHE LightCycler 96实时荧光定量PCR仪，收集荧光值(FAM和HEX)。程序设置:37℃，每30s收集一次荧光，60次，结果如图10。
需要说明的是，本发明实施例以RAA-CRISPR-Cas12a/13a检测体系进行猴痘病毒检测的说明，CRISPR-Cas12a-Cas13a检测体系对猴痘病毒及其分支，猴痘病毒与HIV，猴痘病毒与新冠病毒双通道检测的说明。对于本领域技术人员来说，通过阅读本发明，也可以采用其他CRISPR-Cas检测体系来实现发明方案。
实施例四
本实施例公开了一种用于猴痘病毒检测试剂盒，检测试剂盒包括上述实施例中的crRNA，或者核酸分子组合物，或者CRISPR-Cas检测体系。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于猴痘病毒检测的crRNA，其特征在于：所述crRNA包括至少一组如SEQ ID NO1-6所示核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的用于猴痘病毒检测的crRNA，其特征在于：所述crRNA包括SEQ IDNO 1-6所示的核苷酸序列。
3.一种用于猴痘病毒检测的核酸分子组合物，其特征在于：包括crRNA和RAA引物对，所述crRNA包括SEQ ID NO 1-6所示的核苷酸序列，所述RAA引物对包括至少一组以下的引物对：
(1)SEQ ID NO 7所示的上游引物序列和SEQ ID NO 8所示的下游引物序列；
(2)SEQ ID NO 9所示的含T7启动子的上游引物序列和SEQ ID NO 10所示的下游引物序列；
(3)SEQ ID NO 11所示的上游引物序列和SEQ ID NO 12所示的下游引物序列；
(4)SEQ ID NO 13所示的含T7启动子的上游引物序列和SEQ ID NO 14所示的下游引物序列；
(5)SEQ ID NO 15所示的上游引物序列和SEQ ID NO 16所示的下游引物序列；
(6)SEQ ID NO 17所示的含T7启动子的上游引物序列和SEQ ID NO 18所示的下游引物序列。
4.如权利要求1或2所述的crRNA或权利要求3所述的核酸分子组合物在猴痘病毒检测中的应用。
5.一种用于猴痘病毒检测的CRISPR-Cas检测体系，其特征在于：包括权利要求1或2所述的crRNA或者权利要求3所述的核酸分子组合物。
6.如权利要求要求5所述的用于猴痘病毒检测的CRISPR-Cas检测体系，其特征在于，所述的检测体系为CRISPR-Cas12检测体系或CRISPR-Cas13检测体系或CRISPR-Cas12-Cas13双通道检测体系。
7.如权利要求要求6所述的用于猴痘病毒检测的CRISPR-Cas检测体系，其特征在于：还包括ssRNA报告分子或/和ssDNA报告分子，所述ssDNA报告分子的序列为5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’或者其序列为5’-HEX-TTATT-BHQ1-3’；所述ssRNA报告分子的序列为5’-FAM-rUrUrUrUrU-BHQ1-3’。
8.如权利要求要求6所述的用于猴痘病毒检测的CRISPR-Cas检测体系，其特征在于：还包括ThT适配体或Mango III适配体；
所述ThT适配体，其序列为：5’-CGAGGCTATTAGGAGGTGGGATGC-3’；
所述Mango III适配体序列为：
5’-GGCACGUACGAAGGAAGGAUUGGUAUGUGGUAUAUUCGUACGUCC-3’。
9.如权利要求要求6所述的用于猴痘病毒检测的CRISPR-Cas检测体系，其特征在于：所述双通道检测包括猴痘病毒与猴痘病毒亚型、HIV病毒以及新冠病毒中任一种病毒的混合感染检测，或者两种猴痘病毒亚型的混合感染检测。
10.一种用于猴痘病毒检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括权利要求1或2所述的crRNA，或者权利要求3所述的核酸分子组合物，或者权利要求5～9中任一项所述的CRISPR-Cas检测体系。
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