WO2023121335A1 - 유행성궤양증후군 검출용 조성물 및 이의 검출방법 - Google Patents

유행성궤양증후군 검출용 조성물 및 이의 검출방법 Download PDF

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WO2023121335A1
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seq
invadans
syndrome
aphanomyces
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윤동빈
김소민
김민정
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(주)바이오니아
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for detecting epidemic ulcer syndrome and a method for detecting the same, specifically, Aphanomyces invadans ( Aphanomyces invadans ) Hypothetical protein coding gene and / or ITS1 (Internal transcribed spacer 1) coding gene It relates to a primer pair for amplifying, a composition for detecting epidemic ulcer syndrome containing the same, a detection kit, and a method for detecting epidemic ulcer syndrome using the same.
  • Epizootic ulcerative syndrome is a disease in which red spots or large ulcerative lesions appear on the body surface of freshwater fish such as rainbow trout and sweetfish. It is a disease designated by the World Organization for Animal Health (OIE).
  • EUS caused by Aphanomyces invadans ( A. invadans ), occurs worldwide and infects both wild and freshwater farmed fish (e.g. rainbow trout and sweetfish) in freshwater, causing mass mortality.
  • Aphanomyces invadans A. invadans
  • Flacoglossus altivelis altivelis a cause of fungal granulomatosis of sweetfish
  • striped mullet Mugil cephalus
  • the amplification product increases proportionally as the amplification product accumulates at every cycle of amplification using a fluorescent reporter material.
  • TaqMan probes use TaqMan with very high specificity without agarose gel analysis like the conventional polymerase chain reaction.
  • the sequence information of the amplified product can be checked in one reaction of about 2 hours, and the amount of nucleic acid in the sample can be accurately measured using a standard sample.
  • Protocol 1 (Ainvad-2F, Ainvad-ITSR1) and 2 (ITS11, ITS23) for diagnosis of EUS registered in the OIE
  • A. astaci a species similar to A. invadans , can be distinguished, so to diagnose and discriminate EUS PCR is performed twice according to the OIE standards, and finally identified through sequencing.
  • An object of the present invention is to provide a composition for detecting Epizootic ulcerative syndrome (EUS) caused by Apanomyces inbadans infection.
  • EUS Epizootic ulcerative syndrome
  • An object of the present invention is to provide a kit for detecting epidemic ulcer syndrome caused by Apanomyces inbadans infection.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting epidemic ulcer syndrome caused by Apanomyces inbadans infection.
  • the present invention Aphanomyces invadans ( Aphanomyces invadans ) Hypothetical protein coding gene and / or ITS1 (Internal transcribed spacer 1) coding gene for amplifying a primer pair comprising, Apanomyces Inbadans It relates to a composition for detecting epizootic ulcerative syndrome (EUS) caused by infection.
  • EUS epizootic ulcerative syndrome
  • the present invention also relates to Aphanomyces invadans ( Aphanomyces invadans ) A hypothetical protein coding gene and / or ITS1 (Internal transcribed spacer 1) containing a pair of primers for amplifying the coding gene, Aphanomyces Inbadance It relates to a kit for detecting epizootic ulcerative syndrome (EUS) caused by infection.
  • Aphanomyces invadans A hypothetical protein coding gene and / or ITS1 (Internal transcribed spacer 1) containing a pair of primers for amplifying the coding gene, Aphanomyces Inbadance
  • EUS epizootic ulcerative syndrome
  • the present invention further amplifies the nucleic acid extracted from the specimen with a primer pair for amplifying the hypothetical protein coding gene and/or ITS1 (Internal transcribed spacer 1) coding gene of Aphanomyces invadans Apanomyces Inbadans, comprising the step of letting It relates to a method for detecting epizootic ulcerative syndrome (EUS) caused by infection.
  • EUS epizootic ulcerative syndrome
  • 1A and 1B are results showing an example of the base sequence of the primer pair and TaqMan probe used in the present invention (A: primer pair and TaqMan probe targeting hypothetical protein, B: primer pair targeting ITS1) and TaqMan probes).
  • Figure 2 shows the results of the fluorescence amount performed when using a composition targeting both the hypothetical protein and the hypothetical protein and ITS1 (A: targeting the hypothetical protein, B: targeting the hypothetical protein and ITS1).
  • 3a to 3f show the results of PCR using a primer pair with improved sensitivity and a TaqMan probe for the nucleic acid of a fungus similar to the causative agent of epizootic ulcerative syndrome (EUS) (A: Fusarium keratoplasticum 1, B : Antrodiella zonata 2, C: Aphanomyces iridis 3, D: Aphanomyces laevis 4, E: Aphanomyces frigidophilus , F: Apiotrichum loubieri ).
  • EUS epizootic ulcerative syndrome
  • 4a and 4b show a primer pair and a TaqMan probe targeting the hypothetical protein of A. invadans , which is the cause of epizootic ulcerative syndrome (EUS), and the plasmid DNA containing the ITS 1 region sequence. This is the result of analyzing the minimum detection limit and cut-off value between primer pairs and TaqMan probes with improved sensitivity.
  • EUS epizootic ulcerative syndrome
  • the present invention is Aphanomyces Invadans ( Aphanomyces invadans ) Hypothetical protein (hypothetical protein) coding gene and / or ITS1 (Internal transcribed spacer 1) containing a primer pair for amplifying the coding gene, Afano Myces Inbadance It relates to a composition for detecting epizootic ulcerative syndrome (EUS) caused by infection.
  • EUS epizootic ulcerative syndrome
  • the present invention also amplifies the nucleic acid extracted from the specimen with a primer pair for amplifying the hypothetical protein coding gene and / or ITS1 (Internal transcribed spacer 1) coding gene of Aphanomyces invadans Apanomyces Inbadans, comprising the step of letting It relates to a method for detecting epizootic ulcerative syndrome (EUS) caused by infection.
  • EUS epizootic ulcerative syndrome
  • the present invention detects Aphanomyces invadans , the causative agent of Epizootic ulcerative syndrome (EUS), and develops a method for detecting individuals (eg, rainbow trout) infected with the causative pathogen, and specific nucleotide sequences according to fungal types It was possible to detect the causative agent of aquatic life disease using a pair of detection primers and probes having .
  • EUS Epizootic ulcerative syndrome
  • a 'primer' is a single-stranded oligonucleotide capable of acting as a starting point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions (ie, four different nucleoside triphosphates and polymerases) at a suitable temperature and buffer.
  • the sensitivity is improved by about 8 times compared to when a single primer is used as a pair of primers, enabling sensitive detection, and Aphanomyces Inbadans ( Aphanomyces invadans ), it is possible to detect epidemic ulcer syndrome occurring in freshwater fish at an early stage to reduce damage and to prepare quarantine measures for the disease.
  • 'complementary binding' means that a primer hybridizes with a corresponding nucleic acid strand under the conditions of performing a polymerization reaction, and may form a duplex structure. Complementary bonds may be formed even when the complementarity between paired nucleotide sequences forms a Watson-Crick pair or some non-Watson-Crick base pairs exist.
  • the primer pair includes forward and reverse primers, and the forward primer specifically binds to a hypothetical protein coding gene or ITS1 (Internal transcribed spacer 1) coding gene of Aphanomyces invadans can be amplified.
  • the reverse primer can be amplified by binding to a strand complementary to a hypothetical protein coding gene or an internal transcribed spacer 1 (ITS1) coding gene.
  • the primer pair may include sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 or SEQ ID NOs: 4 and 5.
  • the primer pair may include sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 and sequences of SEQ ID NOs: 4 and 5.
  • the primer pair may include a marker.
  • a marker may additionally be included in the reverse primer.
  • the marker included in the primer is biotin, Cy5, Cy3, FITC, EDANS (5- (2'-aminoethyl) amino-1-naphthalene sulfate), tetramethylrhodamine (TMR), tetramethyl It may be rhodamine isocyanate (TMRITC), x-rhodamine, DIG or antibody or nanoparticles coupled thereto, but is not limited thereto.
  • the binding agent may be streptavidin, but is not limited thereto.
  • the present invention may further include a probe that binds to a product amplified by the primer pair.
  • the probe may complementarily hybridize to a gene specifically amplified by the primer pair.
  • the conditions used to achieve a particular level of stringency vary depending on the nature of the nucleic acids being hybridized. For example, the length of the nucleic acid region to be hybridized, degree of homology, nucleotide sequence composition (eg, GC/AT composition ratio), and nucleic acid type (eg, RNA, DNA) are considered in selecting hybridization conditions. A further consideration is whether the nucleic acid is immobilized, for example on a filter or the like.
  • very stringent conditions are: 2X SSC/0.1% SDS at room temperature (hybridization conditions); 0.2X SSC/0.1% SDS at room temperature (low stringency conditions); 0.2X SSC/0.1% SDS at 42° C. (moderate stringency conditions); 0.1X SSC at 68°C (high stringency conditions).
  • the washing process can be carried out using one of these conditions, for example, a condition having high stringency, or each of the above conditions can be used, each 10 to 15 minutes in the order described above, all or all of the conditions described above Some iterations can be performed. However, as described above, optimal conditions will vary depending on the particular hybridization reaction involved and can be determined experimentally. In general, conditions with high stringency are used for hybridization of the probes of interest.
  • the probe may include, for example, a sequence of SEQ ID NO: 3 or 6.
  • the probe may include, for example, sequences of SEQ ID NOs: 3 and 6.
  • a probe that binds to a product amplified by the primer pair including the sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 may include the sequence of SEQ ID NO: 3.
  • a probe that binds to the product amplified by the primer pair including the sequences of SEQ ID NOs: 4 and 5 may include the sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the probe binding to the product amplified by the primer pair including the sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 includes the sequence of SEQ ID NO: 3;
  • a probe that binds to the product amplified by the primer pair including the sequences of SEQ ID NOs: 4 and 5 may include the sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the probe is detectably labeled, for example, a radioactive isotope, a fluorescent compound, a bioluminescent compound, a chemiluminescent compound, a metal chelate, or an enzyme.
  • a radioactive isotope for example, a fluorescent compound, a bioluminescent compound, a chemiluminescent compound, a metal chelate, or an enzyme.
  • the amount of the amplification product can be detected by fluorescence signal.
  • a reagent intercalator
  • a reporter and a fluorescent material of a quencher capable of quenching reporter fluorescence may be bound to both ends of the probe.
  • the reporter may be selected from 6-carboxyfluorescein (FAM) and the quencher from phosphate.
  • Amplification according to the present invention can be performed through real-time quantitative amplification, for example, real-time polymerase chain reaction (Real-Time PCR), and in real-time polymerase chain reaction, the amount of PCR amplification product can be detected by a fluorescence signal.
  • real-time polymerase chain reaction Real-Time PCR
  • the intensity of the fluorescence signal increases according to the amount of polynucleotide, and an amplification profile curve representing the intensity of the fluorescence signal according to the number of amplification cycles is obtained.
  • the fluorescent substance is intercalated into a double-stranded DNA chain during the PCR process, so that the amount of fluorescence is finally detected by the device.
  • a threshold cycle which is an amplification cycle at a point in time when the amount of fluorescence significantly increases beyond the lowest detectable level (background level)
  • a standard calibration curve is obtained by measuring the log value of the initial amount and the critical period using a sample of which the initial amount of nucleic acid is already known, thereby providing a method for real-time measurement of nucleic acid amplification products.
  • the present invention also relates to Aphanomyces invadans ( Aphanomyces invadans ) Hypothetical protein coding gene and / or ITS (Internal transcribed spacer) coding gene, including a pair of primers for amplifying, Aphanomyces invadans, Aphanomyces invadans dance It relates to a kit for detecting epizootic ulcerative syndrome (EUS) caused by infection.
  • EUS epizootic ulcerative syndrome
  • the kit may optionally include reagents necessary for carrying out a nucleic acid amplification PCR reaction, such as a polymerase and a buffer, if necessary.
  • a kit according to the present invention may also further comprise various polynucleotide molecules, various buffers and reagents.
  • Optimal amounts of reagents, buffers, or reactants used for a specific reaction in the kit can be determined by a person skilled in the art, and are prepared in separate packages or compartments containing each of the aforementioned primer pairs and/or probes. It can be.
  • the specimen includes various samples, and preferably, a biosample is analyzed using the method of the present invention. More preferably, it may be a sample mixed with the virus species described in the present invention or a sample of an individual (eg, fish) infected with the virus, and may be a plant, animal, human, fungus, bacteria, or organism of virus origin A sample may be analyzed. When analyzing a sample of mammalian or human origin, the sample may be from a specific tissue or organ. Representative examples of tissues include connective, skin, muscle or nerve tissue.
  • organs include the eye, brain, lungs, liver, spleen, bone marrow, thymus, heart, lymph, blood, bone, cartilage, pancreas, kidney, gallbladder, stomach, small intestine, testicles, ovaries, uterus, rectum, nervous system, Glandular and internal blood vessels are included.
  • the biological sample to be analyzed includes any cell, tissue, fluid from a biological source, or any other medium that can be well analyzed by the present invention, whether human, animal, or human or animal consumption.
  • the biological samples to be analyzed include bodily fluid samples, which include blood, serum, plasma, lymph, breast milk, urine, feces, ocular fluid, saliva, semen, brain extract (e.g., brain fragments), spinal fluid, appendix, and spleen. and tonsil tissue extracts, but are not limited thereto.
  • a step of extracting nucleic acids from the sample may be further included, and the extraction of nucleic acids may be performed using, for example, various commercially available kits or extraction reagents.
  • reagents used for nucleic acid extraction or various factors (eg, vortexing) generate fragments of nucleic acids, which reduces the sensitivity during PCR and makes it difficult to detect pathogens.
  • various factors eg, vortexing
  • Example 1 Construction of a primer set targeting the Hypothetical protein of Aphanomyces invadans and the ITS 1 region, the cause of Epizootic ulcerative syndrome (EUS)
  • FIG. 1a is a gene encoding a hypothetical protein of A. invadans
  • FIG. 1b is a nucleotide sequence diagram showing an example of a primer pair binding to an internal transcribed spacer 1 (ITS1) encoding gene and a TaqMan probe.
  • ITS1 internal transcribed spacer 1
  • Example 2 Comparison of sensitivity of real-time PCR for detection of Aphanomyces invadans , the cause of epizootic ulcerative syndrome (EUS)
  • Figure 2 is a result showing the amount of fluorescence conducted when using a hypothetical protein, a composition targeting both the hypothetical protein and ITS 1.
  • Table 4 shows the amplification conditions and hybridization reaction conditions of the reaction, and shows the process of amplifying and hybridizing the fungal DNA sample and then raising the temperature of the hybridized product. The above process was performed by real-time PCR.
  • Figure 2a is [Table 2]
  • Figure 2b is the result of using the primer mixture of [Table 3]
  • the Ct value was confirmed to be 37.67 when the conditions of [Table 2] were used for the stock-1 sample, but the conditions of the present invention When using , the Ct value was 33.29, confirming about 8 times higher sensitivity.
  • detection was detected under the conditions of the present invention even at a lower dilution factor, and by applying the primer pair, the sensitivity of Aphanomyces invadans , which is the cause of epidemic ulcer syndrome, can be increased for low concentration samples confirmed.
  • a fluorescent reporter can be used by binding to a TaqMan probe as shown in Table 5.
  • Table 5 the fluorescence amplification curve is checked so that the fungus can be detected by the fluorescence reporter ( A. invadans detection by FAM fluorescence).
  • real-time PCR was performed by adding 5 ⁇ L of nucleic acid of a fungus similar to the causative agent of epizootic ulcerative syndrome (EUS) using the hypothetical protein with improved sensitivity and the composition of the PCR reaction targeting ITS 1. .
  • EUS epizootic ulcerative syndrome
  • 3a to 3f show the results of PCR using a primer pair with improved sensitivity and a TaqMan probe for nucleic acids of a fungus similar to the causative agent of epizootic ulcerative syndrome (EUS).
  • EUS epizootic ulcerative syndrome
  • a plasmid DNA containing the sequence of the hypothetical protein of A. invadans , the cause of epizootic ulcerative syndrome (EUS), and the ITS 1 region was constructed, and PCR targeting the hypothetical protein and ITS 1 with improved sensitivity
  • the composition of the reaction and the composition of the PCR reaction targeting only the hypothetical protein were used (see Tables 2 and 3).
  • 3-fold-diluted plasmid DNA with 1000 to 1.4 copies/rxn was used, and 95% probit regression analysis was used for comparative analysis of detection limit and cut-off value.
  • Figure 4a is the result of analyzing the detection limit and cut-off value for the PCR composition targeting only the hypothetical protein
  • Figure 4b is the detection limit and cut-off value analysis for the PCR composition targeting the hypothetical protein
  • ITS 1 is a result
  • Figure 4b is the result of using the primer mixture of [Table 3], and it was confirmed that the cut-off value was 1.43 higher than when using the primer mixture of [Table 2], and the detection limit was about twice as high. It was confirmed that the sensitivity of Aphanomyces invadans , the cause of epidemic ulcer syndrome, was increased by the primer mixture [Table 3] according to the present invention.
  • a composition, kit, and detection method capable of sensitively molecularly diagnosing Aphanomyces invadans , which is the cause of epidemic ulcer syndrome, through the primer pair according to the present invention can be provided.
  • a primer pair and a TaqMan probe to amplify a hypothetical protein and ITS1 of Aphanomyces invadans
  • a high performance by using a dual-probe rather than a single primer pair There is an effect that can be detected with sensitivity.

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Abstract

본 발명은 유행성궤양증후군 검출용 조성물 및 이의 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans)의 가설 단백질(hypothetical protein) 코딩 유전자 및/또는 ITS1 (Internal transcribed spacer 1) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍, 이를 포함하는 유행성궤양증후군 검출용 조성물, 검출용 키트 및 이를 이용한 유행성궤양증후군 검출방법에 관한 것이다.

Description

유행성궤양증후군 검출용 조성물 및 이의 검출방법
본 발명은 유행성궤양증후군 검출용 조성물 및 이의 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans)의 가설 단백질(hypothetical protein) 코딩 유전자 및/또는 ITS1 (Internal transcribed spacer 1) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍, 이를 포함하는 유행성궤양증후군 검출용 조성물, 검출용 키트 및 이를 이용한 유행성궤양증후군 검출방법에 관한 것이다.
유행성궤양증후군(Epizootic ulcerative syndrome; EUS)은 무지개송어 및 은어와 같은 담수어류의 체표에 붉은 반점이나 큰 궤양성 병변이 나타나는 질환으로 1971년 일본에서 처음 발생한 이후 전 세계로 널리 퍼져있고 지금까지 단 하나의 유전형만 존재하며, 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health, OIE)에 지정되어 있는 질병이다.
아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans: A. invadans)에 의해 발병하는 EUS는 전 세계적으로 발생하며 담수에 서식하는 야생 및 담수 양식 어류(예를 들어 무지개송어, 은어) 모두에 감염되어 대량 폐사를 초래한다. 일본에서는 원래 은어(Plecoglossus altivelis altivelis)의 진균성 육아종증의 원인으로 보고되었고, 최근에는 남아시아, 호주에서는 후천성 궤양성 증후군 또는 줄무늬뱀머리(Channa striata) 및 줄무늬 숭어(Mugil cephalus)의 붉은 반점의 원인으로 알려져 있다.
수산생물질병의 진단방법으로는 다양한 분자 진단 방법과 키트 등이 개발되어 있다. 일반적으로 중합효소연쇄반응을 이용하여 전기영동법을 통해 확인하거나 SYBR Green과 TaqMan 프로브를 이용한 실시간중합효소연쇄반응 (Real-time Polymerase Chain Reaction; Real-time PCR) 기반의 진단방법이 많이 사용되고 있다.
실시간중합효소연쇄반응에서는 형광 리포터 물질을 사용하여 증폭의 매 주기마다 증폭 산물이 축적됨에 따라 비례하여 증가하게 된다. 실시간 정량 분석 방법 중 TaqMan을 이용한 방법으로, TaqMan 프로브는 기존의 중합효소연쇄반응처럼 아가로즈겔 분석 없이, 특이성이 매우 높은 TaqMan을 이용한다. 약 2시간 정도의 1회 반응으로 증폭된 산물의 서열 정보를 확인할 수 있으며, 표준시료를 이용하여 시료 중 핵산의 양을 정확하게 측정할 수 있다.
현재까지 수산생물법정전염병에 대한 표준 진단법으로는 일반적인 유전자 진단법인 종래 PCR(conventional PCR)법이 지정되어 있다. 하지만 유행성궤양증후군 (Epizootic ulcerative syndrome; EUS)의 원인체인 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans: A. invadans)의 경우 중합효소연쇄반응과 FISH (Fluorescent peptide nucleic acid in-situ hybridisation) 방법이 개발되어 OIE에 등록되어 있으나, Real-time PCR 기반의 진단방법과 키트가 개발되어 있지 않아, 기존의 종래 PCR법을 수행하여 PCR 증폭산물을 전기영동으로 확인한 다음, 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health, OIE)의 수생동물위생규약(Aquatic Animal Health Code)의 기준에 따른 진단을 수행하도록 규정되어 있다. EUS의 진단을 하기 위해서는 감염조직으로부터 DNA를 분리하고, PCR를 진행해야 하는 단점이 있어 Real-time PCR을 이용한 진단법은 현재까지 보고된 바로는 없는 실정이다.
OIE에 등록되어 있는 EUS의 진단 방법은 Protocol 1(Ainvad-2F, Ainvad-ITSR1), 2 (ITS11, ITS23)가 있고 A. invadans와 유사한 종인 A. astaci를 구분가능하여 EUS를 진단 및 판별을 위해서는 OIE 기준에 따라 2번의 PCR를 실시하고 시퀀싱 단계를 거쳐 최종적으로 판별한다.
이러한 기술적 배경에서, 본 출원의 발명자들은 유행성궤양증후군 (Epizootic ulcerative syndrome; EUS)의 원인체인 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans) 검출용 PCR 산물을 시퀀싱 단계를 생략하여 어류 질병 원인체를 판별하고, 상기 질병 원인체에 감염된 개체 (예컨대, 담수 어류)로부터 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans)를 검출하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans) 중 2개 유전자의 염기서열을 유행성궤양증후군 판별 및/또는 검출용 유전자 마커로 선정하고, 선정된 마커를 이용하여 형광의 증폭을 나타나게 함으로써 어류 질병 원인병원체를 기존 종래 PCR법(Conventional PCR) 보다 신속, 정확하게 판별할 수 있는 효과가 있음을 확인하였고, 본 발병을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술에 대한 정보는 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 아파노마이세스 인바단스 감염에 의한 유행성궤양증후군 (Epizootic ulcerative syndrome; EUS) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 아파노마이세스 인바단스 감염에 의한 유행성궤양증후군 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 아파노마이세스 인바단스 감염에 의한 유행성궤양증후군 검출방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans)의 가설 단백질(hypothetical protein) 코딩 유전자 및/또는 ITS1 (Internal transcribed spacer 1) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는, 아파노마이세스 인바단스 감염에 의한 유행성궤양증후군 (Epizootic ulcerative syndrome; EUS) 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans)의 가설 단백질(hypothetical protein) 코딩 유전자 및/또는 ITS1 (Internal transcribed spacer 1) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는, 아파노마이세스 인바단스 감염에 의한 유행성궤양증후군 (Epizootic ulcerative syndrome; EUS) 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이, 검체에서 추출된 핵산을 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans)의 가설 단백질(hypothetical protein) 코딩 유전자 및/또는 ITS1 (Internal transcribed spacer 1) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로 증폭시키는 단계를 포함하는, 아파노마이세스 인바단스 감염에 의한 유행성궤양증후군 (Epizootic ulcerative syndrome; EUS) 검출방법에 관한 것이다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명에 사용된 프라이머 쌍 및 택맨 프로브 (TaqMan probe)의 염기서열 일례를 나타낸 결과이다 (A: 가설단백질을 표적하는 프라이머 쌍 및 TaqMan probe, B: ITS1을 표적하는 프라이머 쌍 및 TaqMan probe).
도 2는 가설 단백질, 가설 단백질과 ITS1 모두 표적으로 하는 조성물을 이용하였을 때 실시한 형광량을 나타낸 결과이다 (A: 가설 단백질 표적, B: 가설 단백질 및 ITS 1 표적).
도 3a 내지 도 3f는 유행성궤양증후군(Epizootic ulcerative syndrome; EUS)의 원인체와 유사한 곰팡이류의 핵산에 대해 민감도가 향상된 프라이머 쌍 및 TaqMan probe를 이용하여 PCR을 수행한 결과이다 (A: Fusarium　keratoplasticum 1, B: Antrodiella　zonata 2, C: Aphanomyces iridis 3, D: Aphanomyces laevis 4, E: Aphanomyces frigidophilus, F: Apiotrichum loubieri).
도 4a 및 도 4b는 유행성궤양증후군(Epizootic ulcerative syndrome; EUS)의 원인체인 A. invadans의 가설 단백질과 ITS 1 region이 서열이 포함되어 있는 Plasmid DNA에 대해 가설 단백질을 표적으로 하는 프라이머 쌍 및 TaqMan probe와 민감도가 향상된 프라이머 쌍 및 TaqMan probe간 최소검출한계(Limit of detection) 및 cut-off value를 분석한 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans)의 가설 단백질(hypothetical protein) 코딩 유전자 및/또는 ITS1 (Internal transcribed spacer 1) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는, 아파노마이세스 인바단스 감염에 의한 유행성궤양증후군 (Epizootic ulcerative syndrome; EUS) 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 검체에서 추출된 핵산을 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans)의 가설 단백질(hypothetical protein) 코딩 유전자 및/또는 ITS1 (Internal transcribed spacer 1) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로 증폭시키는 단계를 포함하는, 아파노마이세스 인바단스 감염에 의한 유행성궤양증후군 (Epizootic ulcerative syndrome; EUS) 검출방법에 관한 것이다.
본 발명은 유행성궤양증후군(Epizootic ulcerative syndrome; EUS)의 원인체인 Aphanomyces invadans의 검출하고, 상기 원인병원체에 감염된 개체(예컨대, 무지개송어)를 검출하는 방법을 개발하고자, 곰팡이 유형에 따른 특이적 염기서열을 가지는 검출용 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 수산생물전염병의 원인병원체를 검출할 수 있었다.
본 명세서에서 '프라이머'는 적합한 온도 및 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명에 따른 프라이머는 실시간중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 프라이머 쌍으로 단일의 프라이머를 사용했을 때보다 민감도가 약 8배 정도 향상되어, 민감한 검출이 가능하고, 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans)를 검출할 수 있어, 담수 어류에서 발생하는 유행성궤양증후군에 대해 조기에 검출하여 피해를 줄일 수 있고 질병에 대한 방역 대책을 마련할 수 있는 효과가 있다.
본 명세서에서 '상보적 결합'은 중합반응을 수행하는 조건에서 프라이머가 대응하는 핵산 가닥과 하이브리다이제이션되는 것을 의미하고, 이합체(duplex) 구조를 형성할 수 있다. 상보적 결합은 쌍을 이루는 뉴클레오티드 서열 간의 상보성이 왓슨-크릭 결합(Watson-Crick pair)을 이루거나, 일부 비 왓슨-크릭 결합(Non-Watson-Crick base pair)이 존재하여도 형성될 수 있다.
상기 프라이머 쌍은 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하고, 정방향 프라이머는 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans)의 가설 단백질(hypothetical protein) 코딩 유전자 또는 ITS1 (Internal transcribed spacer 1) 코딩 유전자에 특이적으로 결합하여 증폭할 수 있다. 역방향 프라이머는 가설 단백질(hypothetical protein) 코딩 유전자 또는 ITS1 (Internal transcribed spacer 1) 코딩 유전자와 상보적 가닥에 결합하여 증폭할 수 있다.
예를 들어 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 2의 서열 또는 서열번호 4 및 5의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 2의 서열 및 서열번호 4 및 5의 서열을 포함할 수 있다. 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans)의 유전자 가설 단백질과 ITS1을 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 사용하여 실시간중합효소연쇄반응을 수행할 경우 단일 프라이머 쌍보다 높은 민감도로 검출할 수 있는 효과가 있다.
상기 프라이머 쌍은 표지자를 포함할 수 있다. 역방향 프라이머에 표지자를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 프라이머에 포함된 표지자는 비오틴, Cy5, Cy3, FITC, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민, DIG 또는 항체 또는 이와 결합된 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
여기에, 표지자의 발색을 유도하는 결합제와 반응시켜 발색 또는 형광 발현 여부를 확인하고 표적 핵산의 증폭을 검출할 수 있다. 이 때, 상기 결합제는 스트렙타비딘일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로브는 프라이머 쌍에 의해 특이적으로 증폭된 유전자에 상보적으로 혼성화 할 수 있다.
혼성화 반응에서, 엄격한 특정 수준을 달성하기 위하여 사용되는 조건은 혼성화 되는 핵산의 성질에 따라 다양하다. 예를 들면, 혼성화 되는 핵산 부위의 길이, 상동성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들면, GC/AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA)등이 혼성화 조건을 선택하는데 고려된다. 추가적인 고려 조건은 핵산이 예를 들면, 필터 등에 고정화되어 있는지의 여부이다.
매우 엄격하게 진행되는 조건의 예를 들면 다음과 같다: 실온의 2X SSC/0.1% SDS(혼성화 조건); 실온의 0.2X SSC/0.1% SDS(엄격성이 낮은 조건); 42℃에서의 0.2X SSC/0.1% SDS(보통의 엄격성을 가지는 조건); 68℃에서 0.1X SSC(높은 엄격성을 가지는 조건). 세척 과정은 이들 중 한가지 조건을 사용하여 수행할 수 있고, 예를 들면 높은 엄격성을 가지는 조건, 또는 상기 조건을 각각 사용할 수 있으며, 상기 기재된 순서대로 각각 10~15분씩, 상기 기재된 조건을 전부 또는 일부 반복하여 수행할 수 있다. 그러나 상기에 기술한 바와 같이, 최적 조건은 포함된 특별한 혼성화 반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 중요한 프로브의 혼성화에는 높은 엄격성을 가지는 조건이 사용된다.
상기 프로브는 예를 들어, 서열번호 3 또는 6의 서열을 포함할 수 있다. 상기 프로브는 예를 들어, 서열번호 3 및 6의 서열을 포함할 수 있다.
서열번호 1 및 2의 서열을 포함하는 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브는 서열번호 3의 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 4 및 5의 서열을 포함하는 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브는 서열번호 6의 서열을 포함할 수 있다.
또한, 서열번호 1 및 2의 서열을 포함하는 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브는 서열번호 3의 서열; 및 서열번호 4 및 5의 서열을 포함하는 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브는 서열번호 6의 서열을 포함할 수 있다.
경우에 따라서, 프로브는 검출할 수 있도록 표지되며, 예를 들면 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.
상기 증폭 산물의 양은 형광신호에 의해 검출할 수 있다. 프로브가 결합된 증폭산물의 이중 나선 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(intercalator)을 사용하는 인터컬레이팅(Intercalating)법, 5' 말단은 형광물질, 3' 말단은 소광자(quencher)로 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법 등이 있다.
구체적으로, 상기 프로브 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자 (quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), 상기 소광자는 포스페이트 (Phosphate)에서 선택되어 사용할 수 있다.
본원발명에 따른 증폭은 실-시간 정량 증폭 예를 들어 실시간 중합효소연쇄반응 (Real-Time PCR)을 통해 수행될 수 있으며, 실시간 중합효소연쇄반응에 있어 PCR 증폭 산물의 양은 형광 신호에 의해 검출할 수 있다. 실시간 중합효소연쇄반응이 진행되면서 증가하는 폴리뉴클레오티드 양에 따라 형광 신호의 세기가 증가하게 되고, 증폭 사이클 횟수에 따른 형광 신호 세기를 나타내는 증폭 프로파일(amplification profile) 곡선을 얻게 된다.
본 발명의 Real-time PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥 (double strand) DNA 사슬에 인터컬레이션(intercalation)됨으로써 형광량이 비로소 기기에 감지되기 시작한다. 이렇게 형광량이 최저 감지가능 수준(background level)을 넘어 두드러지게 증가하는 시점의 증폭주기인 한계 주기(threshold cycle, Ct)가 나타난다. 주형 초기량의 로그(log)값과 주형을 실시간 중합효소 연쇄반응을 통하여 증폭할 때 해당하는 한계 주기 사이에는 직선적으로 비례하는 관계를 가지고 있다. 따라서, 핵산의 초기량을 이미 알고 있는 시료를 이용하여 초기량의 로그값과 한계 주기를 측정하여 표준검량곡선을 얻음으로써 핵산 증폭산물의 실시간 측정방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans)의 가설 단백질(hypothetical protein) 코딩 유전자 및/또는 ITS (Internal transcribed spacer) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는, 아파노마이세스 인바단스 감염에 의한 유행성궤양증후군 (Epizootic ulcerative syndrome; EUS) 검출용 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 경우에 따라, 중합효소, 버퍼와 같은 핵산 증폭 PCR 반응을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 다양한 버퍼 및 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기 키트에서 특정 반응을 위해 사용되는 시약, 버퍼 또는 반응물의 최적량은 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 앞서 언급된 프라이머 쌍 및/또는 프로브 각각을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
본 발명에 따른 방법을 수행함에 있어 사용되는 키트와 관련된 구성에 대한 설명은 방법에도 동일하게 적용될 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 검체는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 바이러스 종(species)과 혼합된 시료이거나 상기 바이러스에 감염된 개체(예컨대, 어류 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검체로부터 핵산을 추출하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 핵산의 추출은 예를 들어 상업화 되어 공급되고 있는 다양한 키트 또는 추출 시약을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명은 검체로부터 표적 핵산 추출시, 핵산 추출에 사용되는 시약(예컨대 Buffer) 혹은 여러 가지 요소 (예컨대, vortexing)에 의해 핵산의 단편이 발생하여 PCR시 민감도가 감소하여 병원체를 검출하기 어려운 가능성이 있다. 핵산의 단편에 의한 민감도를 개선하기 위해 서열번호 1~3 및 서열번호 1~6의 염기서열을 각각 이용하여 비교하는 실험을 수행하였다. 상기 PCR 산물에 대한 형광량을 측정하였을 시 유행성궤양증후군(Epizootic ulcerative syndrome; EUS)의 원인체인 Aphanomyces invadans의 검출하기 위한 두 방법에서 서열번호 1~6을 이용한 방법이 서열번호 1~3을 이용한 방법보다 민감도가 약 8배 증가한 것을 확인할 수 있었다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1] 유행성궤양증후군(Epizootic ulcerative syndrome; EUS)의 원인체인 Aphanomyces invadans의 Hypothetical 단백질과 ITS 1 region을 표적으로 하는 프라이머 세트 제작
유행성궤양증후군(Epizootic ulcerative syndrome; EUS)의 원인체인 Aphanomyces invadans의 가설 (hypothetical) 단백질을 코딩하는 유전자와 ITS1 (Internal transcribed spacer 1) 코딩 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트를 제작하기 위해서, 미국 국립생물공학정보센터물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 뉴클레오티드 DB(nucleotide database)에 등록된 염기서열과 전체 유전자 염기서열을 참조하였다. 이로부터 A. invadans의 가설 (hypothetical) 단백질을 구성하는 유전자와 ITS1 (Internal transcribed spacer 1) 코딩 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였으며, 이를 하기 표 1에 나타내었다.
도 1a는 A. invadans의 가설 (hypothetical) 단백질을 코딩하는 유전자, 도 1b는 ITS1 (Internal transcribed spacer 1) 코딩 유전자에 결합하는 프라이머 쌍 및 택맨 프로브 (TaqMan probe)의 일례를 나타내는 염기 서열도이다.
Figure PCTKR2022021049-appb-img-000001
[실시예 2] 유행성궤양증후군(Epizootic ulcerative syndrome; EUS)의 원인체인 Aphanomyces invadans의 검출용 Real-Time PCR의 민감도 비교
실시예 1에서 제작된 TaqMan 프로브 및 프라이머를 이용하여, 유행성궤양증후군(Epizootic ulcerative syndrome; EUS)의 원인체인 Aphanomyces invadans의 DNA 샘플에 대하여 증폭곡선을 도출하였고, 이를 분석하여 원인곰팡이의 검출을 수행하였다. PCR은 Exicycler96™ (Bioneer, 대한민국)을 이용하여 수행하였다. Hypothetical 단백질을 표적으로 하는 PCR을 위한 반응물의 조성은 표 2에 나타내었고 가설 단백질과 ITS 1을 표적으로 하는 PCR을 위한 반응물의 조성은 표 3에 나타내었으며, PCR master mix를 만든 후 5μl 곰팡이 DNA를 첨가하여 Real-time PCR을 수행하였다.
도 2는 가설 단백질, 가설 단백질과 ITS 1 모두 표적으로 하는 조성물을 이용하였을 때 실시한 형광량을 나타낸 결과이다.
Figure PCTKR2022021049-appb-img-000002
Figure PCTKR2022021049-appb-img-000003
표 4는 반응물의 증폭 조건 및 혼성화 반응 조건을 나타낸 것으로, 곰팡이 DNA 샘플을 증폭하고 혼성화한 다음, 상기 혼성화된 산물의 온도를 높이는 과정을 나타낸 것이다. 상기 과정은 Real-time PCR로 수행되었다.
Figure PCTKR2022021049-appb-img-000004
도 2a는 [표 2], 도 2b는 [표 3]의 프라이머 혼합액을 사용한 결과이고 stock-1 샘플에 대해 [표 2]의 조건을 사용하였을 때 Ct값이 37.67로 확인되었지만, 본 발명의 조건을 사용하였을 때, Ct값이 33.29로 약 8배 높은 민감도를 확인하였다. 또한 더 낮은 희석 배수에서도 본 발명의 조건에서는 검출하는 것이 확인되어 상기 프라이머 쌍을 적용함으로써 낮은 농도의 샘플에 대해 유행성궤양증후군의 원인체인 아파노마이세스 인바단스(Aphanomyces invadans)의 민감도를 높일 수 있음을 확인하였다.
[실시예 3] Real-time PCR의 증폭 곡선에 따른 곰팡이의 검출 방법
본 발명에 따른 검출 방법으로 Real-time PCR를 수행하여 샘플을 검출하고자 하는 경우, 표 5에 나타난 바와 같이 형광 리포터를 TaqMan probe에 결합시켜 사용할 수 있다. 예컨대, 표 5에 나타난 바와 같이, 형광 리포터로 곰팡이를 검출할 수 있도록 형광 증폭곡선을 확인한다(FAM 형광으로 A. invadans 검출).
Figure PCTKR2022021049-appb-img-000005
[실시예 4] 유행성궤양증후군(Epizootic ulcerative syndrome; EUS)의 원인체인 Aphanomyces invadans의 검출용 Real-Time PCR의 특이도 비교
본 발명에서 민감도가 향상된 가설 단백질과 ITS 1을 표적으로 하는 PCR 반응물의 조성을 이용하여 유행성궤양증후군(Epizootic ulcerative syndrome; EUS)의 원인체와 유사한 곰팡이류의 핵산을 5 μL 첨가하여 Real-time PCR을 수행하였다.
도 3a 내지 도 3f는 유행성궤양증후군(Epizootic ulcerative syndrome; EUS)의 원인체와 유사한 곰팡이류의 핵산에 대해 민감도가 향상된 프라이머 쌍 및 TaqMan probe를 이용하여 PCR을 수행한 결과이다.
[실시예 5] 유행성궤양증후군(Epizootic ulcerative syndrome; EUS)의 원인체인 Aphanomyces invadans의 검출용 Real-Time PCR의 검출 한계 및 cut-off value 비교
본 발명에서 유행성궤양증후군(Epizootic ulcerative syndrome; EUS)의 원인체인 A. invadans의 가설 단백질과 ITS 1 region이 서열이 포함되어 있는 Plasmid DNA를 제작하였고 민감도가 향상된 가설 단백질과 ITS 1을 표적으로 하는 PCR 반응물의 조성과 가설 단백질만 표적으로 하는 PCR반응물의 조성을 이용하였다(표 2, 3 참고). 검출 한계 및 cut-off value 분석은 위해 1000~1.4 copies/rxn으로 3 fold-dilution된 Plasmid DNA를 이용하였고 95% probit regression analysis를 사용하여 검출 한계 및 cut-off value를 비교 분석하였다.
도 4a는 가설 단백질만 표적으로하는 PCR 조성물에 대한 검출 한계 및 cut-off value를 분석한 결과이고 도 4b는 가설 단백질과 ITS 1을 표적으로 하는 PCR 조성물에 대한 검출 한계 및 cut-off value를 분석한 결과이다.
도 4b는 [표 3]의 프라이머 혼합액을 사용한 결과이고 [표 2]의 프라이머 혼합액을 사용하였을 때 보다 cut-off value가 1.43 더 높게 확인되었고 검출 한계도 약 2배 정도 차이나는 것을 확인하였다. 본 발명의 따른 프라이머 혼합액 [표 3]에 의해 유행성궤양증후군의 원인체인 아파노마이세스 인바단스(Aphanomyces invadans)의 민감도가 상승함을 확인하였다.
본 발명에 따른 프라이머 쌍을 통해 유행성궤양증후군의 원인체인 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans)를 민감하게 분자적으로 진단할 수 있는 조성물, 키트 및 검출방법을 제공할 수 있다. 특히, 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans)의 유전자 가설 단백질과 ITS1을 증폭하기 위한 프라이머 쌍 및 TaqMan probe를 사용하여 실시간중합효소연쇄반응을 수행할 경우 단일 프라이머 쌍보다 dual-probe를 사용함으로써 높은 민감도로 검출할 수 있는 효과가 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (12)

  1. 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans)의 가설 단백질(hypothetical protein) 코딩 유전자 및/또는 ITS1 (Internal transcribed spacer 1) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는, 아파노마이세스 인바단스 감염에 의한 유행성궤양증후군 (Epizootic ulcerative syndrome; EUS) 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 2의 서열 및/또는 서열번호 4 및 5인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브를 추가로 포함하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 3 및/또는 6의 서열인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans)의 가설 단백질(hypothetical protein) 코딩 유전자 및/또는 ITS1 (Internal transcribed spacer 1) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는, 아파노마이세스 인바단스 감염에 의한 유행성궤양증후군 (Epizootic ulcerative syndrome; EUS) 검출용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 2의 서열 및/또는 서열번호 4 및 5의 서열인 것을 특징으로 하는 키트.
  7. 제5항에 있어서, 상기 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브를 추가로 포함하는 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 3 및/또는 6의 서열인 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 검체에서 추출된 핵산을 아파노마이세스 인바단스 (Aphanomyces invadans)의 가설 단백질(hypothetical protein) 코딩 유전자 및/또는 ITS1 (Internal transcribed spacer 1) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로 증폭시키는 단계를 포함하는, 아파노마이세스 인바단스 감염에 의한 유행성궤양증후군 (Epizootic ulcerative syndrome; EUS) 검출방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 2의 서열 및/또는 서열번호 4 및 5의 서열인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브를 추가로 포함하는 검출방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 3 및/또는 6의 서열인 것을 특징으로 하는 검출방법.
PCT/KR2022/021049 2021-12-24 2022-12-22 유행성궤양증후군 검출용 조성물 및 이의 검출방법 WO2023121335A1 (ko)

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