CN116219072A - 一种用于猴痘病毒检测的引物及荧光探针 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于猴痘病毒检测的引物及荧光探针。所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.4所示的序列；所述荧光探针的核酸序列包括SEQ ID NO.5‑SEQ ID NO.6所示的序列。本发明创造性地设计了两对引物及相应荧光探针，能够特异性检测猴痘病毒DNA中的新靶基因B21R，该靶位具有保守性和特异性；此外，建立了双重荧光PCR法，能够进一步提高猴痘病毒检测的特异性和准确性。

Description

一种用于猴痘病毒检测的引物及荧光探针
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于猴痘病毒检测的引物及荧光探针。
背景技术
猴痘是一种具有全球公共卫生性的重要疾病。根据WHO的建议，猴痘病毒的检测应采用聚合酶链反应(PCR)法，不推荐使用免疫法检测抗原，因为猴痘病毒的抗原和其他有亲缘性的正痘病毒间存在免疫交叉，所以基于荧光PCR的检测法兼具准确性和敏感性，是实验室检测的首选方法。
目前，我国最新发布的《猴痘防控技术指南》和美国CDC的方法均采用荧光PCR检测猴痘病毒的单基因靶点。我国指南中检测的靶基因为F3L基因，但从序列对比可以发现F3L基因不具有特异性，引物和探针序列与牛痘病毒的等位基因基本相同，和兔痘、骆驼痘、马痘等其他动物的正痘病毒DNA高度相近，这可能会产生假阳性结果。美国CDC检测的靶基因与先前文献报道(Li et al.J Clin Virol.2006Jul；36(3)；Li et al.VirolMethods.2010Oct；169(1))的靶基因一致，根据文献研究(Li et al.VirolMethods.2010Oct；169(1))该靶基因片段的特异性较好，和其他正痘病毒DNA无阳性交叉，但由于猴痘病毒的DNA序列较长(约198k)，单基因靶标覆盖的区域太小，如果病毒有后续突变，可能会产生脱靶效应而产生假阴性结果，而且单基因靶标检测一旦失效，也没有其他可验证的靶点进行复测。
CN115161414A公开了猴痘病毒特异性检测靶标及其寡核苷酸和试剂盒，包括针对猴痘病毒基因组中F3L基因区域设计特异性的引物及探针，在快速提取样本中的核酸后采用荧光PCR技术检测猴痘病毒核酸，此方法操作简单，采用TaqMan探针检测猴痘病毒靶基因，能特异性区分序列相似度很高的牛痘病毒，可以避免误检与漏检。
CN114752711A公开了检测猴痘病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途，使用此发明的组合物，能够以200拷贝/mL的灵敏度对猴痘病毒进行快速检测，同时在反应体系中实现猴痘病毒的检测和分型，使得不同猴痘分支能够得到区分，可以更有针对性的进行治疗和预防。
综上所述，为了解决猴痘病毒检测的靶基因F3L不具有特异性，单基因靶标覆盖的区域小，易产生脱靶反应，难以复测等问题，开发一种用于猴痘病毒检测的引物及荧光探针很有必要。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于猴痘病毒检测的引物及荧光探针，解决了单基因靶标覆盖的区域小，易产生脱靶反应，难以复测等问题。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于猴痘病毒检测的引物及荧光探针，所述引物的核酸序列包括SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.4所示的序列；所述荧光探针的核酸序列包括SEQ IDNO.5-SEQ ID NO.6所示的序列。
本发明创造性地设计了两对引物及相应荧光探针，能够特异性检测猴痘病毒DNA中的新靶基因B21R，该靶位具有保守性和特异性；此外，建立了双重荧光PCR法，能够进一步提高猴痘病毒检测的特异性和准确性。
SEQ ID NO.1：CACTTCCTCCTAAACCAGTCCA。
SEQ ID NO.2：TGGTTGATCTATAGGAGGAGGT。
SEQ ID NO.3：GTTAATACTGGCAGTTCTATTGTGTC。
SEQ ID NO.4：TGTTGAGGAAGTGGATTACGGA。
SEQ ID NO.5：AACTTCCCCCTAGACCAGTAGGT。
SEQ ID NO.6：AGACGACGACCTAGACGCCCT。
优选地，所述荧光探针的5’端含有荧光基团，3’端含有猝灭基团。
优选地，所述荧光基团包括VIC、FAM、或CY5中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述猝灭基团包括BHQ1和/或BHQ2。
第二方面，本发明提供第一方面所述的用于猴痘病毒检测的引物及荧光探针在制备用于猴痘病毒检测的产品中的应用。
第三方面，本发明提供一种用于猴痘病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于猴痘病毒检测的引物及探针。
第四方面，本发明提供第一方面所述的用于猴痘病毒检测的引物及探针在猴痘病毒检测中的应用。
第五方面，本发明提供一种非疾病诊断和/或治疗为目的的用于猴痘病毒检测的方法，所述方法包括：
以待测样本的核酸为模板，利用第一方面所述的用于猴痘病毒检测的引物及荧光探针进行荧光PCR扩增，根据荧光PCR扩增结果进行判断。
优选地，所述待测样本包括痘泡液、痘痂、病灶的拭子、咽拭子、全血或血清中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述引物的扩增靶点包括猴痘病毒基因和内参基因。
优选地，所述猴痘病毒基因包括B21R、J2R，所述内参基因包括人RNaseP基因。
优选地，所述荧光PCR扩增的扩增程序为：
(1)93-95℃，3-10min；(2)93-95℃，10-50s；(3)50-70℃，0.5-3min；20-50个循环。
上述93-95中的具体点值可以选择93、94、95等。
上述3-10中的具体点值可以选择3、4、5、6、7、8、9、10等。
上述10-50中的具体点值可以选择10、15、20、30、40、45、48、50等。
上述50-70中的具体点值可以选择50、55、60、65、68、70等。
上述0.5-3中的具体点值可以选择0.5、1、1.5、2、2.5、3等。
上述20-50中的具体点值可以选择20、25、30、35、40、45、48、50等。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明创造性地设计了两对引物及相应荧光探针，能够特异性检测猴痘病毒DNA中的新靶基因B21R，该靶位具有保守性和特异性；此外，建立了双重荧光PCR法，能够进一步提高猴痘病毒检测的特异性和准确性。
附图说明
图1A为猴痘病毒B21R基因DNA(1-280碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1B为猴痘病毒B21R基因DNA(281-494碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1C为猴痘病毒B21R基因DNA(495-715碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1D为猴痘病毒B21R基因DNA(716-977碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1E为猴痘病毒B21R基因DNA(978-1198碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1F为猴痘病毒B21R基因DNA(1199-1435碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1G为猴痘病毒B21R基因DNA(1436-1721碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1H为猴痘病毒B21R基因DNA(1722-1966碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1I为猴痘病毒B21R基因DNA(1967-2216碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1J为猴痘病毒B21R基因DNA(2217-2516碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1K为猴痘病毒B21R基因DNA(2517-2766碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1L为猴痘病毒B21R基因DNA(2767-3016碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1M为猴痘病毒B21R基因DNA(3017-3316碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1N为猴痘病毒B21R基因DNA(3317-3566碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1O为猴痘病毒B21R基因DNA(3567-3816碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1P为猴痘病毒B21R基因DNA(3817-4116碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1Q为猴痘病毒B21R基因DNA(4117-4366碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1R为猴痘病毒B21R基因DNA(4367-4616碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1S为猴痘病毒B21R基因DNA(4617-4916碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1T为猴痘病毒B21R基因DNA(4917-5166碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1U为猴痘病毒B21R基因DNA(5167-5416碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图1V为猴痘病毒B21R基因DNA(5417-5643碱基)和其他类似正痘病毒同源基因序列对比图；
图2为不同年度猴痘病毒基因组中保守的B21R扩增子序列图；
图3为正向引物为SEQ ID NO.1，反向引物为SEQ ID NO.2，荧光探针为SEQ IDNO.5时的扩增曲线图；
图4为正向引物为SEQ ID NO.3，反向引物为SEQ ID NO.4，荧光探针为SEQ IDNO.6时的扩增曲线图；
图5为根据图3结果所绘制的标准曲线图；
图6为根据图4结果所绘制的标准曲线图；
图7为正向引物①为SEQ ID NO.1，反向引物①为SEQ ID NO.2，荧光探针①为SEQID NO.5，正向引物②为SEQ ID NO.7，反向引物②为SEQ ID NO.8，荧光探针②为SEQ IDNO.9(5’端带有FAM荧光基团，3’端带有BHQ1猝灭基团)，正向引物③为SEQ ID NO.10，反向引物③为SEQ ID NO.11，荧光探针③为SEQ ID NO.12(5’端带有CY5荧光基团，3’端带有BHQ2猝灭基团)时的多重PCR扩增曲线图；
图8为正向引物①为SEQ ID NO.3，反向引物①为SEQ ID NO.4，荧光探针①为SEQID NO.6，正向引物②为SEQ ID NO.7，反向引物②为SEQ ID NO.8，荧光探针②为SEQ IDNO.9(5’端带有FAM荧光基团，3’端带有BHQ1猝灭基团)，正向引物③为SEQ ID NO.10，反向引物③为SEQ ID NO.11，荧光探针③为SEQ ID NO.12(5’端带有CY5荧光基团，3’端带有BHQ2猝灭基团)时的多重PCR扩增曲线图；
图9为正向引物为SEQ ID NO.1，反向引物为SEQ ID NO.2，荧光探针为SEQ IDNO.5，含骆驼痘B21R基因的片段为模板(SEQ ID NO.15)时的多重PCR扩增曲线图；
图10为正向引物为SEQ ID NO.3，反向引物为SEQ ID NO.4，荧光探针为SEQ IDNO.6，含骆驼痘B21R基因的片段为模板(SEQ ID NO.15)时的多重PCR扩增曲线图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
特异性的B21R靶基因的确定。
(1)利用多重DNA序列对比从猴痘病毒的全基因序列中选择出具有高特异性的靶基因B21R，猴痘病毒特异性引物和探针分别以下划线标出，扩增子以方框标出(图1I-J)，由图1A-图1V的基因序列对比结果图可知，B21R基因在多种正痘病毒中存在多态性，从中可以找到猴痘病毒特异性的基因片段作为荧光PCR的靶位；
(2)根据多重DNA序列对比设计两对高特异性的引物和两条对应的荧光探针，从图1A-图1V扩增子的序列对比可以看出，新设计的B21R靶位在除骆驼痘外的其他亲缘正痘病毒中均不存在，而骆驼痘的等位基因序列片段和所设计的猴痘B21R扩增子靶位差异性也较大，理论上不会被设计的引物所扩增和检测到荧光信号；
(3)从图2收集的不同年份的猴痘病毒基因组序列对比来看，所选的靶位保守性较高，没有高频的突变，仅在一处有重复性插入TAC，但不影响所设计引物的结合，不会产生脱靶效应，再经Blast检索证明所设计引物的特异性；
(4)合成相应骆驼痘的DNA片段，用特异性的猴痘引物和探针进行扩增，均未见扩增现象，从而确定在B21R上的两个特异性的靶位。
实施例2
基于实施例1的B21R靶位的荧光PCR检测。
引物、荧光探针、含猴痘病毒靶基因(B21R)片段的质粒均按DNA序列经化学合成获得，含猴痘病毒靶基因(B21R)片段的质粒作为扩增模板(SEQ13)，靶基因浓度为10pg，1pg，0.1pg，0.01pg，0.001pg，反应体系配比如表1所示，PCR扩增程序为：95℃，10min，1个循环；95℃，30s；60℃，1min，40个循环，PCR扩增和检测均在ABI 7500Real-Time PCR仪(赛默飞)上进行，当正向引物为SEQ ID NO.1，反向引物为SEQ ID NO.2，荧光探针为SEQ ID NO.5时，扩增曲线如图3所示，标准曲线如图5所示。
SEQ ID NO.13：
ctagaggtacaacccatttccaagtaggtgcatctggtgcaagtggtggtgttgtaggagatagtttcccatttcaaaatgttaaatcgcgtgccagtctattggcggaaaaaataatgcctagagtacctattactgctaccgaagctgatctatatgcaactgtaaatagacaacccaagttaccagcaggtgttaaaagtactccgtttacagaggcgcttgtgtctacgataaaccaaaagctttctaatgttagagaggtaacttatgcttcgctcaatctgccaggatcaagtggctatgttcatagaccatctgattctgttatttatagcagtataagacggtcacgtttacctagtgatagcgatagtgattatgaggatatacaaactgttgttaaggaatataatgaaagatatggtagatcagtcagtagaacacagtcatcaagtagtgaaagcgattttgaagatatagatactgttgttagggaatatagacaaaaatatggcaatgcaatggcaaaaggacgtagtagttcccctaaacctgatccattatatagtactgttaagaaaacaactaaaagtctatctactggtgtagacatagttacaaaacaatcagactattctctattacctgacgttaatactggcagttctattgtgtcacctctcaccagaaaaggagctactagacgacgacctagacgccctacaaatgatggtctacagagtccaaatcctcctctccgtaatccacttcctcaacatgatgattattctcctccacaagtacacagacctccaccacttcctcctaaaccagtccaaaattcgccacaacttccccctagaccagtaggtcaattactacctcctcctatagatcaaccagataaaggatttagtaagtttgtatcacctagacggtgtagaagagcaagctctggagtcatatgtggtatgatacaatcaaaaccaaacgatgatacctattcacttcttcaacgatcaaaaattgaaccagaatatgtggaggttggtaatggtatacccaagaacaatgttcctgtaataggtaataaacatagtaaaaaatatacatcgacgatgtcaaaaatatcaacaaaatttgataaatctacggcatttggagcagcaatgttactaactggtcagcaggccattagccaacagactagatcaactacgttgagtagaaaagatcagatgagtaaggaagaaaagatattcgaagcagttacaatgagtctatcaactataggttcaacgttgacgtctgcaggtatgacgggtggtccaaaactaatgattgcaggaatggctataacggctataactggtataatagatacgataaaagatatatattacatgttttcaggacaggagaggccagtagatcctgttattaaattatttaataagtacactggcttaatgtccgataataataaaatgggtgtaagaaaatgtttgacacccggtgacgacacacttatttatatcgcatacagaaacgataccagttttaaacagaatacggatgcgatggctttgtatttcttagatgttatcgattcagagatcctatatctaaacacatcaaatttagttctagagtatcaactaaaggtggcttgccccataggaacattaagatctgtagatgtggacataactgcgtatacaatattatatgatacagcggataatattaagaaatacaagtttatcagaatggcaacgctactatccaaacatccagttattagattgacatgtggtttagcagcaacattggtgattaaaccgtacgaggtacccatcagtgatatgcaactactaaaaatggcgacgcctggtgaaccagaatccactaaatctataccatccgatgtctgtgataggtatcctctaaagaaattctatcttttagctggtggttgtccctatgatacatctcaa。
当靶基因浓度为10pg，1pg，0.1pg，0.01pg，0.001pg，反应体系配比如表2所示，PCR扩增程序为：95℃，10min，1个循环；95℃，30s；60℃，1min，40个循环，当正向引物为SEQ IDNO.3，反向引物为SEQ ID NO.4，荧光探针为SEQ ID NO.6时，扩增曲线如图4所示，标准曲线如图6所示。
表1
组分 用量
AceQqPCRProbeMasterMix 10μL
正向引物(10μM) 0.4μL
反向引物(10μM) 0.4μL
荧光探针(10μM) 0.4μL
ddH2O 7.8μL
模板 1μL
结果：由图4和图5可知所设计的两对引物和探针均能较好地检测出猴痘B21R靶位，扩增曲线良好，由图6和图7可知在模板浓度为0.001pg到100pg的范围内，标准曲线线性(三重复，R2>0.99,和扩增效率(100％-102％之间)良好；同时骆驼痘的基因(模板浓度高至10pg)不能被检测出，说明所用扩增引物和探针体系有良好的特异性。
实施例3
多重荧光PCR检测。
引物的扩增靶点分别为猴痘病毒的B21R基因、J2R基因(SEQ ID NO.14)和内参基因(人RNaseP基因)，引物、荧光探针、含靶基因片段的质粒均按DNA序列经化学合成获得，反应体系配比如表2所示，PCR扩增程序为：95℃，10min，一个循环；95℃，30s；60℃，1min，40个循环，PCR扩增和检测均在ABI 7500Real-Time PCR仪(赛默飞)上进行。
SEQ ID NO.14：
atgaggtccgtattatactcgtatatattgtttctctcatgtataataataaacggaagagatatagcaccacatgcaccatccaatggaaaatgtaaagacaacgaatacagaagccgtaatctatgttgtctatcgtgtcctccgggaacttacgcttccagattatgtgatagcaagactaatacacaatgtacaccgtgtggttcggatacctttacatctcacaataatcatttacaggcttgtctaagttgtaacggaagatgtgatagtaatcaggtagagacgcgatcgtgtaacacgactcacaatagaatctgtgaatgctctccaggatattattgtcttctcaaaggagcatcagggtgtagaacatgtatttctaaaacaaagtgtggaataggatacggagtatccggatacacgtctaccggagacgtcatctgttctccgtgtggtcccggaacatattctcacaccgtctcttccacagataaatgcgaacccgtcgtaaccagcaatacatttaactatatcgatgtggaaattaacctgtatccagtcaacgacacatcgtgtactcggacgaccactaccggtctcagcgaatccatctcaacgtcggaactaactattaccatgaatcataaagattgtgatccagtctttcgtgcagaatacttctctgtccttaataatgtagcaacttcaggattctttacaggagaaaatagatatcagaatacttcaaagatatgtactctgaatttcgagattaaatgtaacaacaaagattcatcttccaaacagttaacgaaaacaaagaatgatactatcatgccgcattcagagacggtaactctagtgggcgactgtctatctagcgtcgacatctacatactatatagtaataccaatactcaagactacgaaaatgatacaatctcttatcatatgggtaatgttctcgatgtcaatagccatatgcccgctagttgcgatatacataaactgatcactaattcccagaatcccacccacttatag。
正向引物①为SEQ ID NO.1，反向引物①为SEQ ID NO.2，荧光探针①为SEQ IDNO.5，正向引物②为SEQ ID NO.7，反向引物②为SEQ ID NO.8，荧光探针②为SEQ ID NO.9(5’端带有FAM荧光基团，3’端带有BHQ1猝灭基团)，正向引物③为SEQ ID NO.10，反向引物③为SEQ ID NO.11，荧光探针③为SEQ IDNO.12(5’端带有CY5荧光基团，3’端带有BHQ2猝灭基团)时，多重PCR扩增曲线如图7所示。
SEQ ID NO.7：GGAAAATGTAAAGACAACGAATACAG。
SEQ ID NO.8：GCTATCACATAATCTGGAAGCGTA。
SEQ ID NO.9：AAGCCGTAATCTATGTTGTCTATCGTGTCC。
SEQ ID NO.10：AGATTTGGACCTGCGAGCG。
SEQ ID NO.11：GAGCGGCTGTCTCCACAAGT。
SEQ ID NO.12：TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG。
正向引物①为SEQ ID NO.3，反向引物①为SEQ ID NO.4，荧光探针①为SEQ IDNO.5，正向引物②为SEQ ID NO.7，反向引物②为SEQ ID NO.8，荧光探针②为SEQ ID NO.9(5’端带有FAM荧光基团，3’端带有BHQ1猝灭基团)，正向引物③为SEQ ID NO.10，反向引物③为SEQ ID NO.11，荧光探针③为SEQ IDNO.12(5’端带有CY5荧光基团，3’端带有BHQ2猝灭基团)时，多重PCR扩增曲线如图8所示。
正向引物为SEQ ID NO.1，反向引物为SEQ ID NO.2，荧光探针为SEQ ID NO.5，含骆驼痘B21R基因的片段为模板(SEQ ID NO.15)，扩增曲线如图9所示。
SEQ ID NO.15：
aaaaaagatttaagaatagacagtgttattcctagaggtacaactcatttccaagtaggtgcatctggatcaagtggtggtgttgtaggcatagttccccatttcaaaatgttaaatcacgggccagtctattggcagaaaaaataatgcctagagtacctactactgctaccgaagagcagctatatgcaactataaatatacaaacaaagttgcctgcgggtgttaaaagtactccgtttacagaggcgcttgtgtctacgataaaccaaaagctttctagtgttaaagaggtaacttatgcttcgctcaatctgccaggatcaagtggctatgttcatagacaatctgattctgttatttacagcactataagacggacacgtttacctagtgatagcaatagtgattttgaggatatacaaactgttgttaaggaatataatgaaagatatggtagacgagttagtagaacacagtcatcaagtagtgattttgaagatatagatgaagttgttgcagaatatagacaaaaatatggcaacgctatgacaaaaggacgtggttctcctaaaccggatccgttatatagtactgttaagaaaacacctaaaagtatagtatccggagtagacatagtttcaaaacaaacagactattctctattacccggtgttaatactggtagttctatcgtaacacctctcaccagaagaggagctactagacgacctaaacgcccatctacgcctccacgcgaagatctaccaccacttcctccgaatcctcctcgtcgacaacttcctcgtggcggtgatcattctccaccacaagttcctcaacgtgattattctccaccacgtagacatcctccaccacttcctcctaaaccagttccagctattccacctagagatggtcaaccagataataaaggatttagtaagtttgtatcccctagacggtgtagaagatcaacctctggagtcgtatgtggtatgatacaatcaagaccaaacgatgatacatattcacttcttcaacgaccaaaaattgaaccagaatatgcggaggtcggtaatggcttacccaagaacaatgttcctgtgataggtaataaacatagtaaaaaatatacatcgtcgatgtcaaaaatatcaacaaaatttgataaatctatggcatttggaacagcaatgttactaactggtcaacaggctattaaccaacaggttagatcaactgagttgattaaaaaagatcaaatgagcaaggacgaaaagatattcgaagcagttacaatgactctatcaactatagttcaacgttgacaactgcaggtatgatagctccaccactaatgattgctggaataggtatatcgcttatatcaggtataatagatacggcaaaagatatatattacctatttttaggacaggagaagccagtagatccagttattaagttttttaacacatacgctggattagtatccgatagtagtaaaatgggcgtaaggaaatgtttgacgcctggagaagacacacttatttacatcgcatacaaaaacgattccagttttaaacagaatacggaggcaatggctttgtatttcttagatgttatcgactcagagatcctatatctaaacacatcaaatttagttctagagtatcaactaaaggtggcttgtcccataggaacattaagatctgtagatgtagacataactgcgtatacaatattatatgatacagcggataatattaaaaaatacaagtttatcagaatggcaacgctactatccaaacatccagttattagattgacatgtggtttagcagcaacattggtaattaaaccctacgaggtacccatcagtgatatgcaactactaaaaatggcgacgcctggtgaaccagaatccactaaatctataccatctgatgtctgtgataggtatcctctaaagaaattctatcttttggctggtggt。
正向引物为SEQ ID NO.3，反向引物为SEQ ID NO.4，荧光探针为SEQ ID NO.6，含骆驼痘B21R基因的片段为模板(SEQ ID NO.15)，扩增曲线如图10所示。
表2
组分 用量
AceQqPCRProbeMasterMix 10μL
正向引物①(10μM) 0.4μL
反向引物①(10μM) 0.4μL
荧光探针①(10μM) 0.4μL
正向引物②(10μM) 0.4μL
反向引物②(10μM) 0.4μL
荧光探针②(10μM) 0.4μL
正向引物③(10μM) 0.4μL
反向引物③(10μM) 0.4μL
荧光探针③(10μM) 0.4μL
ddH2O 5.4μL
模板 1μL
结果：由图7和图8可知两个猴痘病毒的靶点B21R和J2R的扩增曲线良好，均被检出，但骆驼痘的基因片段不能被检出(图9和图10)，所有内参基因也能被正常扩增，说明本发明的多重PCR检测猴痘病毒的方法兼具敏感性和专一性，比起原有方法不易产生脱靶效应，特异性也进一步增强。
综上所述，本发明创造性地设计了两对引物及相应荧光探针，能够特异性检测猴痘病毒DNA中的新靶基因B21R，该靶位具有保守性和特异性；此外，建立了双重荧光PCR法，能够进一步提高猴痘病毒检测的特异性和准确性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种用于猴痘病毒检测的引物及荧光探针，其特征在于，所述引物的核酸序列包括SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.4所示的序列；所述荧光探针的核酸序列包括SEQ ID NO.5-SEQ IDNO.6所示的序列。
2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的5’端含有荧光基团，3’端含有猝灭基团；
优选地，所述荧光基团包括VIC、FAM、或CY5中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述猝灭基团包括BHQ1和/或BHQ2。
3.权利要求1或2所述的用于猴痘病毒检测的引物及荧光探针在制备用于猴痘病毒检测的产品中的应用。
4.一种用于猴痘病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的用于猴痘病毒检测的引物及探针。
5.权利要求1或2所述的用于猴痘病毒检测的引物及探针在猴痘病毒检测中的应用。
6.一种非疾病诊断和/或治疗为目的的用于猴痘病毒检测的方法，其特征在于，所述方法包括：
以待测样本的核酸为模板，利用权利要求1或2所述的用于猴痘病毒检测的引物及荧光探针进行荧光PCR扩增，根据荧光PCR扩增结果进行判断。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括痘泡液、痘痂、病灶的拭子、咽拭子、全血或血清任意一种或至少两种的组合。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述引物的扩增靶点包括猴痘病毒基因和内参基因。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述猴痘病毒基因包括B21R、J2R，所述内参基因包括人RNaseP基因。
10.根据权利要求6-9任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光PCR扩增的扩增程序为：
(1)93-95℃，3-10min；(2)93-95℃，10-50s；(3)50-70℃，0.5-3min；20-50个循环。
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