KR20160009397A - 약제 내성 결핵균을 검출하는 방법 - Google Patents

약제 내성 결핵균을 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

정확도가 우수하고 간편하고 신속하게 약제 내성 결핵균을 검출하는 방법 및 이에 사용하는 조성물이 제공된다. 약제 내성 결핵균을 검출하는 방법 및 이에 사용하는 조성물을 이용하면 정확도가 우수하고 간편하고 신속하게 약제 내성 결핵을 진단 및 치료하는데 이용할 수 있다.

Description

약제 내성 결핵균을 검출하는 방법{Methods for detecting drug resistant Mycobacterium tuberculosis}
약제 내성 결핵균을 검출하는 방법과 이에 사용되는 약제 내성 결핵균 검출용 조성물에 관한 것이다.
매년 전 세계적으로 결핵으로 인해 사망하는 사람들의 수가 증가하고 있으며 또한 약물내성의 증가로 인해서 결핵의 유병률이 점점 증가하고 있다. 최근 문제가 되는 슈퍼 결핵은 결핵 치료용 항생제의 내성을 보이는 결핵균으로 결핵 환자가 항생제 복용을 불규칙적으로 하면 발생하게 된다. 이를 약제 내성 결핵균이라 칭하며 증상만으로는 일반 결핵과 약제 내성 결핵이 구분되지 않아 치료에 어려움을 겪고 있다.
스트렙토마이신(Streptomycin; SM)은 결핵 치료제로 효과가 있으나, 최근에는 이소니아지드(Isoniazid; INH), 리팜피신(Rifampicin; RMP), 에탐부톨(Ethambutol; EMB), 및 피라지나미드(Pyrazinamide) 등과 같이 결핵 항생제에 내성을 갖는 약제내성 결핵균이 보고되고 있다. 약제 내성을 갖는 결핵균을 배양하여 선별하기 위해서는 수주일이 소요되므로, 결핵 환자의 치료를 위해 신속하고 정확한 결핵균 선별 방법을 개발할 필요가 있다.
분자생물학적 기법이 발달되면서 암이나 유전성 질환을 유발하는 기작이나, 병원성 미생물들의 치료약에 대한 내성유발 기작에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 단일염기변이의 검출 방법으로 PCR-SSCP(Single Strand Conformation polymorphism)법, PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)법, PCR-SSP(sequence specific priming)법, LPHA(Line probe hybridization assay)법, DNA 다이렉트 시퀀싱 법 등 다양한 방법이 활용되고 있다. 그러나 이들 방법들은 임상 활용에 있어서 여러 가지 제한이 있는 실정이다. 즉, PCR-SSCP의 경우 민감도가 충분히 높지 못하고 (약 80% 가량 검출) 또 대상 유전자 절편의 크기가 200 폴리뉴클레오티드 이상인 경우 민감도가 더 낮아지는 문제점이 있다.
따라서, 약제 내성 결핵균의 유전자의 돌연변이 여부를 확인하여 간편하고 신속하며 우수한 민감도로 약제 내성 결핵균을 선별할 수 있는 방법이 요구된다.
약제 내성 결핵균을 검출하는 방법을 제공한다.
약제 내성 결핵균 검출용 조성물을 제공한다.
일 양상은 개체로부터 분리된 결핵균의 핵산을 제공하는 단계;
프라이머 세트를 사용하여 분리된 결핵균의 핵산을 증폭하는 단계로서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 제1 프라이머 세트, 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 제2 프라이머 세트, 및 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 제3 프라이머 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트인 단계;
증폭된 증폭 산물을 융해(melting)시켜 융해 곡선(melting curve)를 얻는 단계; 및
상기 융해 곡선으로부터 융해 온도를 확인하여 약제 내성 결핵균을 검출하는 단계를 포함하는 약제 내성 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)을 검출하는 방법이 제공된다.
상기 용어, "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 이중 가닥 DNA 또는 cDNA, 또는 단일 가닥 DNA 또는 RNA이며, 달리 기재되어 있지 않은 한, 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다.
용어, "폴리뉴클레오티드 서열"은 "핵산 서열", "프라이머", "올리고뉴클레오티드", 또는 "폴리뉴클레오티드"와 혼용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 당업계에 알려진 방법에 따라, 적절한 방법(예를 들면, 화학적 합성)에 의해 합성되고 제조될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드은 상업적으로 구입할 수 있다.
상기 방법은 개체로부터 분리된 결핵균의 핵산을 제공하는 단계를 포함한다.
상기 개체는 동물일 수 있다. 상기 동물은 개, 소, 말, 돼지, 마우스, 래트, 및 인간을 포함하는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물을 사람일 수 있다.
상기 분리된 결핵균의 핵산은 개체의 객담, 뇌척수액, 흉수, 폐 조직 또는 이들의 조합으로부터 분리된 핵산일 수 있다. 상기 핵산은 결핵균의 DNA일 수 있다. 상기 DNA는 예를 들면 게놈 DNA 또는 상보적 DNA(complementary DNA; cDNA)일 수 있다.
상기 방법은 개체로부터 핵산을 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 핵산을 분리하는 단계는 당업자에게 잘 알려진 방법으로 분리하는 것일 수 있다.
상기 방법은 프라이머 세트를 사용하여 분리된 핵산을 증폭하는 단계를 포함한다.
용어 "프라이머 세트"는 정방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer)의 쌍을 말하고, 용어 "프라이머(primer)"는 적합한 온도에서 적합한 버퍼 내에서 적합한 조건(예를 들면, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합 반응 효소)에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머는 5 폴리뉴클레오티드(이하, 'nt'라 함) 내지 50 nt, 10 nt 내지 45 nt, 15 nt 내지 40 nt, 15 nt 내지 35 nt, 또는 15 nt 내지 30 nt일 수 있다. 상기 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성할 수 있다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 제1 프라이머 세트, 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 제2 프라이머 세트, 및 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 제3 프라이머 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트일 수 있다.
상기 제1 프라이머 세트는 결핵균의 embB 유전자를 표적 서열로 하는 프라이머 세트일 수 있다. 상기 제2 프라이머 세트는 결핵균의 katG 유전자를 표적 서열로 하는 프라이머 세트일 수 있다. 상기 제3 프라이머 세트는 결핵균의 rpoB 유전자를 표적 서열로 하는 프라이머 세트일 수 있다. 상기 결핵균 embB 유전자, katG 유전자, 및 rpoB 유전자는 당업자에게 공지된 것일 수 있다.
상기 증폭은 분리된 결핵균의 DNA를 증폭하는 것일 수 있다. 용어 "증폭(amplification)"은 표적 핵산 서열 또는 그에 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것을 의미한다. 증폭 방법은 열순환(termal cycling)을 필요로 하는 것 또는 등온 (isothermal)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 증폭 방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction; PCR), 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification; NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplificaton; SDA), 또는 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification; RCA)일 수 있다. 상기 "PCR"은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법일 수 있다.
상기 증폭은 핵산 폴리머라제를 사용하여 증폭하는 것일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제일 수 있다. DNA 폴리머라제는 당업자에게 공지된 것일 수 있다.
상기 증폭된 증폭 산물은 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성(Single Nucleotide Polymorphism; SNP)를 포함할 수 있다. 상기 SNP은 핵산 서열에서 하나의 뉴클레오티드 서열의 차이를 보이는 변이를 말한다. 상기 SNP는 결핵균의 embB 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열 중 916번째 뉴클레오티드, 918번째 뉴클레오티드, 956번째 뉴클레오티드, 983번째 뉴클레오티드 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합의 SNP일 수 있다. 상기 SNP는 상기 SNP는 결핵균의 katG 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열 중 944번째 뉴클레오티드, 1007번째 뉴클레오티드, 1048번째 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합의 SNP일 수 있다. 상기 SNP는 상기 SNP는 결핵균의 rpoB 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열 중 1304번째 뉴클레오티드, 1333번째 뉴클레오티드, 1334번째 뉴클레오티드, 1349번째 뉴클레오티드, 1355번째 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합의 SNP일 수 있다.
상기 방법은 증폭된 증폭 산물을 융해(melting)시켜 융해 곡선(melting curve)를 얻는 단계를 포함한다.
용어 "융해(melting)"은 이중 가닥의 DNA를 단일 가닥의 DNA로 해리시키 것을 말한다. 융해는 이중 가닥의 DNA를 포함하는 시료를 가온하여 수행될 수 있다. 융해는 예를 들면 85℃ 내지 95℃에서 수행될 수 있다.
상기 증폭된 증폭 산물을 융해(melting)시켜 융해 곡선(melting curve)를 얻는 단계는 형광 염료를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 형광 염료는 예를 들면 SYBR Green®, SYTO®9, EvaGreen®, LC Green, LC Green Plus, ResoLight, 또는 이들의 조합일 수 있다.
융해 곡선은 사용된 염료의 종류에 따라 파장에 따른 형광 강도를 측정하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 510 nm에서의 형광 강도를 측정하여 융해 곡선을 얻을 수 있다.
상기 방법은 융해 곡선으로부터 융해 온도를 확인하여 약제 내성 결핵균을 검출하는 단계를 포함한다.
융해 온도(melting point; Tm)는 이중 나선 DNA 중 절반이 각각의 가닥으로 분리되는 온도, 즉 50%의 변성이 일어난 상태의 온도를 말한다. 융해 온도는 핵산의 DNA 종류, 폴리뉴클레오티드 서열, GC 함량, 폴리뉴클레오티드의 길이, 뉴클레오티드 변이의 존재 등에 따라 달라질 수 있다.
상기 약제는 에탐부톨(Ethambutol; EMB), 이소니아지드(Isoniazid; INH), 리팜피신(Rifampicin RMP), 또는 이들의 조합일 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 제1 프라이머 세트,
서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 제2 프라이머 세트, 및
서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 제3 프라이머 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트, 및
융해 분석용 염료를 포함하는 약제 내성 결핵균 검출용 조성물을 제공한다.
상기 프라이머 세트는 전술한 바와 같다.
상기 융해 분석용 염료는 형광 염료일 수 있다. 상기 형광 염료는 예를 들면 SYBR Green®, SYTO®9, EvaGreen®, LC Green, LC Green Plus, ResoLight 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 조성물은 핵산을 증폭하는데 필요한 성분을 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 핵산 폴리머라제, 그의 활성에 필요한 완충액, 보조인자 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제일 수 있다. DNA 폴리머라제는 당업자에게 공지된 것일 수 있다.
약제 내성 결핵균을 검출하는 방법 및 이에 사용하는 조성물을 이용하여 약제 내성 결핵균을 정확도가 우수하고, 간편하고 신속하게 약제 내성 결핵균을 검출할 수 있다. 약제 내성 결핵균을 검출하는 방법 및 이에 사용하는 조성물을 이용함으로써 정확도가 우수하고 간편하고 신속하게 약제 내성 결핵을 진단 및 치료하는데 이용할 수 있다.
도 1은 고해상 융해 곡선 분석 방법으로 rpoB 유전자의 돌연변이를 확인한 결과를 나타낸다. 도 1a는 온도에 따른 형광 강도를 나타내는 그래프이고, 도 2b는 측정된 형광 강도로부터 표준 결핵균에서 측정된 형광 강도를 뺀 값을 나타내는 그래프이다.
도 2 는 결핵 환자의 약제 내성 결핵균을 선별하기 위한 모식도이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 약제 내성균의 선별
약제 내성이 있는 결핵균에 감염된 것으로 예상되는 약 200명의 환자로부터 객담을 수득하였다. 이소니아지드, 리팜피신, 및 에탐부톨의 3가지 약제가 포함된 Loenstein-Jensen(L-J배지) 배지를 사용하여 결핵균의 약제 감수성 검사를 시행하였다.
구체적으로, 3 L 당 포타슘 포스페이트 4.5 g, 마그네슘 설페이트 0.45 g, 마그네슘 시트레이트 1.125 g, 아스파라긴 6.75 g, 증류수 1125 ml, 글리세린 22.5 ml, 2%(w/v) 말라카이트 그린 37.5 ml, 에그(Egg) 1875 ml를 섞고, 이소니아지드(Sigma) 0.2 ㎍/ml, 리팜피신(Sigma) 40 ㎍/ml, 또는 에탐부톨(Sigma) 2.0 ㎍/ml이 포함되도록 배지를 제조하였다.
항생제가 포함되지 않은 L-J배지에서 배양한 균주를 골고루 긁어서 모은 후, 50 ㎕의 증류수와 비드(Glass beads acid washed, Cat. No. 59202, Sigma-Aldrich, USA)가 첨가된 튜브에 넣고 균주가 잘 풀리도록 충분히 볼텍싱하였다. 증류수를 조금씩 넣어가며 맥파랜드(McFarland) 번호 1 (1%(w/v) BaCl2 0.05 ml, 1%(w/v) H2SO4 4.95 ml)과 비교하여 탁도를 맞추고 증류수로 10배 희석하였다. 희석된 균액은 20 ㎕를 이소니아지드, 리팜피신 또는 에탐부톨이 포함된 약제 배지에 골고루 바른 후, 37℃? 배양기에서 3 내지 4주 동안 배양하였다. 약제 감수성 확인은 약제가 함유되지 않은 대조군과 각 약제 배지에서 자란 균 집락 수를 비교하여 실험군의 균 집락수가 대조군보다 1% 이상의 균이 발육하면 내성으로 판정하였다.
이소니아지드가 포함된 배지에서 자란 균은 28개로 전체 시료 중 14%에 해당하고, 리팜피신이 포함된 배지에서 자란 균은 27개로 전체 시료 중 13%에 해당하였다. 에탐부톨이 포함된 배지에서 자란 균은 30개로 전체 시료 중 15%에 해당하였다. 이소니아지드, 리팜피신, 및 에탐부톨에 대하여 약제 감수성이 나타나지 않은 결핵균은 115개로 전체 시료 중 57%였고, 이러한 균주는 약제 내성이 없는 결핵균이거나 기타 항생제에 내성을 갖는 결핵균으로 예상되었다.
실시예 2. 약제 내성 결핵균의 고해상 융해 곡선 분석
실시예 1에서 약제 내성이 있는 결핵균으로 판정된 균주로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 구체적으로, 원심 분리용 튜브에 증류수 1 ml를 넣고, 약제 내성 결핵균을 넣고, 균이 잘 풀리도록 1분 동안 볼텍싱하고, 100℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 1600x g에서 3분 동안 원심분리하고, 상층액 2 ㎕를 수득하여 핵산 증폭의 주형으로 사용하였다.
선별된 각각의 약제 내성 결핵균의 유전자 증폭을 위하여 embB 유전자, katG 유전자, 또는 rpoB 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 세트를 사용하여 고해상 융해 곡선(high-resolution melting curve) 분석을 수행하였다. embB 유전자 증폭용 프라이머 세트, katG 유전자 증폭용 프라이머 세트 또는 rpoB 유전자 증폭용 프라이머 세트를 하기에 나타내었다.
embB 정?향 프라이머: 5'-cgncatgcgccggna-3' (서열번호 1)
embB 역방향 프라이머: 5'-cagacnggcgtcnctg-3' (서열번호 2)
katG-1 정방향 프라이머: 5'-ggtnatcgcgtncttac-3' (서열번호 3)
katG-1 역방향 프라이머: 5'-tcgggntcgtngacct-3' (서열번호 4)
rpoB-5 정방향 프라이머: 5'-tgcncgtcgcngacct-3' (서열번호 5)
rpoB-5 역방향 프라이머: 5'-cncgatcaagnagt-3' (서열번호 6)
상기에서 수득한 결핵균의 DNA 2 ㎕, 2X PCR 완충액(PhileKorea Co.) 10 ㎕, 고해상 융해 염료(PhileKorea Co.) 2 ㎕, 정?향 프라이머 10 pmol, 역방향 프라이머 10 pmol 및 증류수의 조성으로, 총 20 ㎕가 되게 PCR 반응액을 만들었다. illumina ECO HRM(Illumina USA) 장비를 사용하여 95℃에서 30초, 65℃에서 15초를 1 사이클로 하여 총 45 사이클을 반복하여 PCR 증폭한 다음, 95℃에서 15초, 55℃에서 15초, 95℃에서 15초 동안 인큐베이션시켜 융해 곡선 분석을 수행하였다. PCR 반응시 형광 색소로 SYBR Green(Life Technology)을 사용하였다.
그 결과, 27개의 rpoB 유전자 변이를 관찰하였고, 28개의 katG유전자 변이 30개의 embB 유전자의 변이를 확인할 수 있었다. 그 중 rpoB 유전자의 돌연변이가 있는 결핵균과 정상 결핵균의 융해 곡선 분석의 결과를 도 1a 도 1b에 나타내었다.
도 1a에 나타난 바와 같이, 융해 온도에 따라 증폭 산물이 구별됨을 확인하였다. 도 1b에 나타난 바와 같이, rpoB 유전자의 돌연변이가 있는 결핵균과 정상 결핵균의 융해 곡선 분석의 결과로 두 유전자 사이에 변이가 있는 부분은 정상 유전자에 비하여 융해 패턴의 차이를 확인하였다. 따라서, 융해 곡선 분석 방법을 이용하여 약제 내성 결핵균을 선별할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 약제 내성 결핵균의 염기 서열 분석
실시예 2의 융해 곡선 분석에서 약제 내성 결핵균으로 판정된 균주의 게놈 DNA를 다이렉트 시퀀싱하여 돌연변이된 유전자 염기서열을 확인하였다.
다이렉트 시퀀싱은 실시예 2에 기재된 프라이머 세트를 이용하였다.
DNA의 염기서열은 ABI primsTM377 Automated DNA Sequencer(Applied Biosystesm, USA)를 사용하여 결정하였으며, 각종 시약 제조 및 실험 절차는 Automated DNA Sequencing Chemistry Guide에 따랐다. GenBank의 결핵 표준 균주(Mycobacterium tuberculosis) 염기서열과 비교하여 변이 부위를 비교하였다.
다이렉트 시퀀싱으로 확인된 유전자 변이를 표 1 내지 표 3에 기재하였다.
embB 유전자의 돌연변이 위치 확인
변이 분리된 균주의 수
뉴클레오티드의 치환 아미노산 잔기의 치환
A→G (916) Met→Val (306) 25
A→G (956) Tyr→Cys (319) 1
A→C (916), A→G (983) Met→Leu (306), Asp→Gly (328) 1
G→A (918), A→G (983) Tyr→Ser (319), Asp→Gly (328) 30
총합 30
katG 유전자의 돌연변이 위치 확인
변이 분리된 균주의 수
뉴클레오티드의 치환 아미노산 잔기의 치환
G→C (944) Ser→Thr (315) 15
G→A (944) Ser→Asn (315) 3
T→C (1007) Leu→Pro (336) 1
G→T (1048) Ala→Ser (350) 1
G→T (1389) Arg→ Leu(463) 8
총합 28
rpoB 유전자의 돌연변이 위치확인
변이 분리된 균주의 수
뉴클레오티드의 치환 아미노산 잔기의 치환
A→T (1304) Asp→Val (516) 3
C→T (1333) His→Tyr (526) 5
CA→AG (1333-1334) His→Ser (526) 1
CA→TG (1333-1334) His→Cys (526) 1
C→G (1349) Ser→Trp (531) 5
C→T (1349) Ser→Leu (531) 11
T→C (1355) Leu→Pro (533) 1
총합 27
표 1 내지 표 3에 나타난 바와 같이, 각각의 유전자 돌연변이 확인 결과 embB 유전자의 경우 A→G (916)로 변이되는 경우가 27건으로 전체의 90%가량이 되었다. embB 유전자의 경우 한 유전자에서 2개의 돌연변이도 검출되었다. katG 유전자의 경우 G→A 또는 C (315)로 변이되는 핫 스팟(hot spot) 위치가 존재하였고 G→T (463) 유전자 변이도 높은 빈도로 검출되었다. rpoB 유전자의 경우 C→G 또는 T (1349) 유전자 변이가 가장 높은 빈도로 검출되었으나, C→T (1333) 변이 이외에 다양한 위치에서 돌연변이가 검출되었다.
따라서, 유전자 변이가 있는 핫 스팟 위치만을 확인하는 기존의 프로브 검출 방법은 민감도에 한계가 있으나, 고해상 융해 곡선 분석 방법을 이용하면 여러 유전자 변이를 동시에 확인하여 핫 스팟 이외의 돌연변이까지 유전자 변이를 확인할 수 있고, 간편하고 신속하게 약제 내성 결핵균을 진단하는데 이용할 수 있음을 확인하였다.
<110> YOO, Jongha HWANG, Won-sang <120> Methods for detecting drug resistant Mycobacterium tuberculosis <130> PN093670 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for embB gene <400> 1 cgncatgcgc cggna 15 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for embB gene <400> 2 cagacnggcg tcnctg 16 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for katG gene <400> 3 ggtnatcgcg tncttac 17 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for katG gene <400> 4 tcgggntcgt ngacct 16 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for rpoB gene <400> 5 tgcncgtcgc ngacct 16 <210> 6 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for rpoB gene <400> 6 cncgatcaag nagt 14

Claims (9)

  1. 개체로부터 분리된 결핵균의 핵산을 제공하는 단계;
    프라이머 세트를 사용하여 분리된 결핵균의 핵산을 증폭하는 단계로서,
    상기 프라이머 세트는
    서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 제1 프라이머 세트,
    서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 제2 프라이머 세트, 및
    서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 제3 프라이머 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트인 단계;
    증폭된 증폭 산물을 융해(melting)시켜 융해 곡선(melting curve)를 얻는 단계; 및
    상기 융해 곡선으로부터 융해 온도를 확인하여 약제 내성 결핵균을 검출하는 단계를 포함하는 약제 내성 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)을 검출하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 증폭 산물은 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성(Single Nucleotide Polymorphism; SNP)를 포함하는 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 SNP는 결핵균의 embB 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열 중 916번째 뉴클레오티드, 918번째 뉴클레오티드, 956번째 뉴클레오티드, 983번째 뉴클레오티드 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합의 SNP인 것인 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 SNP는 결핵균의 katG 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열 중 944번째 뉴클레오티드, 1007번째 뉴클레오티드, 1048번째 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합의 SNP인 것인 방법.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 SNP는 결핵균의 rpoB 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열 중 1304번째 뉴클레오티드, 1333번째 뉴클레오티드, 1334번째 뉴클레오티드, 1349번째 뉴클레오티드, 1355번째 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합의 SNP인 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 약제는 에탐부톨(Ethambutol; EMB), 이소니아지드(Isoniazid; INH), 리팜피신(Rifampicin; RMP), 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 개체로부터 결핵균의 핵산을 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  8. 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 제1 프라이머 세트,
    서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 제2 프라이머 세트, 및
    서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 제3 프라이머 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트, 및
    융해 분석용 염료를 포함하는 약제 내성 결핵균 검출용 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 약제는 에탐부톨(Ethambutol; EMB), 이소니아지드(Isoniazid; INH), 리팜피신(Rifampicin; RMP), 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN106811530A (zh) * 2017-02-27 2017-06-09 苏州百源基因技术有限公司 基于hrm技术检测结核分枝杆菌耐药性的试剂盒及引物
KR20180023394A (ko) * 2016-08-25 2018-03-07 솔젠트 (주) 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균 동시 검출용 진단키트
KR102123621B1 (ko) * 2019-01-30 2020-06-16 주식회사 창 헬스케어 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해온도 측정을 이용한 비결핵균, 결핵균, 및 다제내성결핵균의 검출방법

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