KR101752152B1

KR101752152B1 - 시프로플록사신 항생제에 대해 내성을 보이는 탄저균 검출을 위한 pna 프로브 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101752152B1
Application number: KR1020150133202A
Authority: KR
Inventors: 장제윤; 권순환
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2015-09-21
Filing date: 2015-09-21
Publication date: 2017-06-30
Also published as: KR20170034646A

Abstract

본 발명은 시프로플록사신 항생제에 대해 내성을 보이는 탄저균 검출을 위한 PNA 프로브 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명을 통해 PNA-매개 PCR 클램핑 방법을 적용하여 단일염기돌연변이 (point mutation)와 같은 유전자 이상으로 항생제 내성을 나타내는 탄저균 변이주에 대하여 신속하고 고감도로 검출 가능한 진단 시스템을 제공할 수 있으며, 이를 통해 약제내성 균주를 사용한 생물테러에 신속히 대응하여 대규모 피해발생을 예방 또는 최소화할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

시프로플록사신 항생제에 대해 내성을 보이는 탄저균 검출을 위한 PNA 프로브 및 이의 용도{PNA probe for detecting Bacillus anthracis having resistance against ciprofloxacin antibiotic and the uses thereof}

본 발명은 시프로플록사신 항생제에 대해 내성을 보이는 탄저균 검출을 위한 PNA 프로브 및 클램핑 프라이머 세트에 관한 것이다.

항생제 내성균은 신종 감염 질병류의 발병 위협과 함께 세계적으로 증가하고 있으며, 항생제 내성균의 빠른 확산은 세계 여러 나라의 큰 문제로 부상하고 있다. 우리나라는 2000년 의료분업 이전 항생제 오남용에 의한 항생제 내성율 세계 1위 국가라는 서울대병원의 발표 자료에 따르면 각종 세균 감염질환 치료상 큰 난관에 봉착해 있음은 물론 어떤 항생제로도 다스릴 수 없는 '슈퍼균' 출연 가능성이 어느 나라보다도 높다고 알려져 있다. 2002년 기준으로 우리나라 내성균의 항생제 저항성 추이를 살펴보면 장염 원인균인 장구균(Enterococcus faecium)은 암피실린(Ampicillin)에 97% 수준의 내성률을 보이고, 반코마이신(Vanconycin)에는 33% 수준의 내성율과 식중독균인 포도상구균(Staphylococcus aureus)은 메타실린(Metacillin)에 75%의 내성율을 보이는 것으로 알려져 있다. 항생제 내성율이 높아지면 임상분야에서 감염질환 치료가 무력화되며, 식품분야에서는 항생제 내성을 갖는 세균성 식중독 문제에 적절한 대처가 불가능하다.

2001년 9월 미국 세계무역센터 테러와 우편물에 탄저균을 이용한 생물테러가 발생한 이후 전세계적으로 테러에 대한 공포와 우려가 확산 되었으며 세계 각국에서 자국민 보호를 위한 대응 방안 마련에 고심하고 있다. 생물무기는 재래식 무기에 비해 경제적으로 저렴하고 쉽게 은닉하여 살포할 수 있으며, 살포가 이루어진 후 환자 발생에 있어 시간적으로 차이가 있으므로 초기에 감지하기가 어렵고, 극미량으로 치사량이 되며, 한번 오염되면 스스로 번식·확산하는 특성을 지니고 있다. 또한 생물무기는 폭로시 일정기간의 잠복기가 있어 즉각적으로 증상이 나타나지 않기 때문에 오염지역을 확인하기가 쉽지 않고 감염 사실을 확인했을 때는 이미 넓은 지역, 많은 사람들에게 전파시킨 후일 가능성이 높다. 이러한 생물무기의 특성과 북한 및 이라크를 둘러싼 국제정세, APEC, G20 및 G50과 같은 대규모 행사 개최 등으로 인하여 생물테러 발생 가능성과 우려가 증가하는 실정이므로 현재 우리나라는 생물테러 가능성이 높은 탄저, 두장, 보툴리눔 독소증, 페스트, 바이러스성 출혈열을 법정 전염병으로 지정하여 관리하고 있다.

나쁜일을 도모하는 개인, 그룹 또는 큰 집단이 충분히 위협적인 병원균들을 무기화할 수 있다는 관점에서 항생제 저항성을 지니는 박테리아로 만들거나 백신을 벗어나는 탄저병원균 또는 백신을 무용지물로 하는 바이러스에 대한 연구 가능성이 증대되고 있다. 또한 고위험병원체의 유전자 변이에 의한 약제내성에 관한 보고들도 꾸준히 이어지고 있어 약제내성 균주를 사용한 생물테러에 신속히 대응하기 위한 약제내성 유전자 변이 신속 검출 기술을 개발하고, 이를 이용하여 치료 약제 선택에 대한 신속한 정보를 제공함으로써 내성주에 의한 대규모 피해 발생을 예방 또는 최소화할 수 있다. 현재 탄저 치료는 시프로플록사신(ciprofloxacin), 독시사이클린(doxycycline), 페니실린 등과 같은 항생제 사용을 기반으로 하고 있으나, 질병의 기초 진단이 필수적이며 해당 약제에 대한 내성 획득이 문제시 될 수 있다. 자연상태에 존재하는 야생형 탄저균은 아직 시프로플록사신 및 독시사이클린에 대한 내성을 갖고 있다는 보고는 아직 발견되지 않았지만 시험관 내에서 내성균이 유도될 수 있다는 사실이 보고된 바 있으며 항생제 내성이 유도된 탄저균이 생물터러 등에 이용될 경우 심각한 위험성을 갖게 된다.

최근 PNA(peptide nucleic acids)를 이용한 방법인 PNA-매개 PCR 클램핑 (PNA-mediated PCR clamping)이란 방법이 개발되었다. PNA는 Taq DNA 폴리머라제의 엑소뉴클라제(5→3)에 대한 내성을 갖고 DNA의 상보적인 사슬과 강하게 결합할 수 있으며 하나의 염기라도 일치하지 않으면 Tm이 크게 감소하기 때문에 클램프 프라이머(clamp primer)로 적합하다.

최근에는 야생형에 특이적으로 결합하는 PNA(peptide nucleic acid) 프로브를 이용하여 다량 존재하는 야생형의 증폭을 억제하는 방법으로 돌연변이를 선택적으로 검출하는 PNA 클램핑(clamping) 기술이 개발되었다. PNA는 핵산염기가 인산 결합이 아니라 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 처음 보고되었다(Nielsen et al., Science, 254:1497-1500, 1991). PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 겹가닥을 형성한다. 핵산 염기의 수가 같은 경우 PNA/DNA 겹가닥은 DNA/DNA 겹가닥보다, PNA/RNA 겹가닥은 DNA/RNA 겹가닥보다 안정하다. PNA의 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸) 글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이고, 이 경우 펩티드 핵산의 기본 골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본 골격과 달리 전기적으로 중성이다.

PNA에 존재하는 4개의 핵산염기(nucleobase)는 DNA의 핵산 염기와 비슷한 공간을 차지하고 핵산 염기 사이의 거리도 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. PNA는 또한 전기적으로 중성이기 때문에 PNA/DNA, PNA/RNA 겹가닥의 안정성은 염 농도에 영향을 받지 않는다. 이러한 성질 때문에 PNA는 상보적인 핵산 염기 서열을 천연 핵산보다 더 잘 인식할 수 있어서 진단 또는 다른 생물학적, 의학적 목적으로 응용된다.

PNA 클램핑 기술은 상기한 PNA의 장점을 이용하여 PNA 프로브가 완벽하게 결합되면 효소 등이 인지하지 못하여 증폭반응이 일어나지 않고, 점 돌연변이가 있는 경우에는 PNA 프로브가 완벽하게 결합하지 못하기 때문에 증폭반응이 일어나게 되는 원리를 이용하는 방법으로, 야생형에 비해 극소량 존재하는 돌연변이를 빠르고 정확하게 검출할 수 있어 많이 이용되고 있다.

한편, 한국등록특허 제0812795호에서는 '탄저균 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 탄저균의 검출방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 시프로플록사신 항생제에 대해 내성을 보이는 탄저균 검출을 위한 PNA 프로브 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 PNA-매개 PCR 클램핑 방법을 적용하여 단일염기돌연변이(point mutation)와 같은 유전자 이상으로 항생제 내성을 나타내는 고위험병원체 탄저균 변이주에 대하여 신속하고 고감도로 검출 가능한 진단 시스템을 개발하고자 하였다. 이를 위해 탄저균 변이주로부터 gyrA, gyrB 또는 parC 유전자의 특정 부위가 단일돌연변이가 발생하여 시프로플록사신 항생제 내성을 나타내는 것을 처음으로 밝혔으며, 이들 돌연변이가 있는 부위 특이적으로 PNA 프로브를 제조하였다. 상기 PNA 프로브와 본 발명을 통해 선별된 최적 프라이머를 이용하여 PNA 매개 클램핑 실시간 PCR을 수행한 결과를 분석한 결과, 야생주와 변이주에서 변이가 일어나지 않은 유전자에서는 PNA에 의한 블록킹(blocking)으로 더 이상 유전자의 합성이 일어나지 않으나, 변이된 유전자에서는 PNA의 해리현상에 의하여 유전자가 증폭하는 것을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에서 개발한 gyrA, gyrB 또는 parC 유전자 특이적 PNA 프로브 및 프라이머를 이용하여 항생제 내성 탄저균 변이주를 정확하게 진단할 수 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 60의 염기서열로 이루어진 GyrA(DNA gyrase A) 유전자의 254번째 염기서열에 사이토신(C)을 포함하거나 또는 265번째 염기서열에 구아닌(G)을 포함하거나 또는 266번째 염기서열에 아데닌(A)을 포함하거나; 또는 서열번호 61의 염기서열로 이루어진 GyrB(DNA gyrase B) 유전자의 1423번째 염기서열에 아데닌(A)을 포함하거나; 또는 서열번호 62의 염기서열로 이루어진 ParC(topoisomerase Ⅳ) 유전자의 242번째 염기서열에 사이토신(C)을 포함하거나 또는 253번째 염기서열에 구아닌(G)을 포함하는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 시프로플록사신(ciprofloxacin) 항생제에 대해 내성을 보이는 탄저균(Bacillus anthracis) 검출을 위한 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 GyrA(DNA gyrase A) 유전자, GyrB(DNA gyrase B) 유전자 또는 ParC(topoisomerase Ⅳ) 유전자 특이적 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브와 GyrA, GyrB 또는 ParC 유전자 특이적 클램핑 프라이머 세트를 포함하는 시프로플록사신(ciprofloxacin) 항생제 내성을 가지는 탄저균(Bacillus anthracis) 검출을 위한 PNA 매개 클램핑 실시간 PCR(real-time PCR)용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은

상기 GyrA(DNA gyrase A) 유전자, GyrB(DNA gyrase B) 유전자 또는 ParC(topoisomerase Ⅳ) 유전자 특이적 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브와 GyrA, GyrB 또는 ParC 유전자 특이적 클램핑 프라이머 세트를 이용하여 대상 탄저균(Bacillus anthracis)의 GyrA, GyrB 또는 ParC 유전자에 대해 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하는 단계; 및

(b) 상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭 결과를 분석하여 탄저균의 GyrA, GyrB 또는 ParC 유전자의 돌연변이 유무를 결정하는 단계를 포함하는 시프로플록사신(ciprofloxacin) 항생제에 대해 내성을 보이는 탄저균 검출 방법을 제공한다.

본 발명을 통해 PNA-매개 PCR 클램핑 방법을 적용하여 단일염기돌연변이 (point mutation)와 같은 유전자 이상으로 항생제 내성을 나타내는 탄저균 변이주에 대하여 신속하고 고감도로 검출 가능한 진단 시스템을 제공할 수 있으며, 이를 통해 약제내성 균주를 사용한 생물테러에 신속히 대응하여 대규모 피해발생을 예방 또는 최소화할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 탄저균 gyrA 유전자의 변이 진단을 위해 탄저균 실험군(wild type DNA)과 대조군(mutant type DNA) 샘플을 대상으로 본 발명에서 선별된 PNA3/4, 프라이머(F/R)/프로브(P)를 이용하여 PNA 매개 실시간 PCR을 수행한 결과를 나타낸다. (A)는 F3/R1/P6~7, (B)는 F3/R3/P3, (C)는 F1/R3/P6, (D)는 F4/R1/P7 조합으로 5회 이상의 반복 실험 후 선별함.
도 2는 탄저균 gyrB 유전자의 변이 진단을 위해 탄저균 실험군(wild type DNA)과 대조군(mutant type DNA) 샘플을 대상으로 본 발명에서 선별된 PNA1, 프라이머(F/R)/프로브(P)를 이용하여 PNA 매개 실시간 PCR을 수행한 결과를 나타낸다. (A)는 F3/R2/P3, (B)는 F3/R3/P3, (C)는 NF/R3/P3, (D)는 NF/R2/P3, F3/R1/P3 조합으로 5회 이상의 반복 실험 후 선별함.
도 3은 탄저균 ParC 유전자의 변이 진단을 위해 탄저균 실험군(wild type DNA)과 대조군(mutant type DNA) 샘플을 대상으로 본 발명에서 선별된 PNA3, 프라이머(F/R)/프로브(P)를 이용하여 PNA 매개 실시간 PCR을 수행한 결과를 나타낸다. (A)는 F3/R2/P1, (B)는 F1/R1/P3, (C)는 F1/R3/P3, (D)는 F3/R1/P3 조합으로 5회 이상의 반복 실험 후 선별함.
도 4는 탄저균의 PNA 매개 클램핑 실시간 PCR로 확인한 스탠다드 커브를 나타낸다. (A)는 탄저의 gyrA 유전자, (B)는 탄저의 gyrB 유전자를 나타냄.
도 5는 탄저균의 PNA 매개 클램핑 실시간 PCR로 확인한 탄저의 parC 유전자의 스탠다드 커브를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 60의 염기서열로 이루어진 GyrA(DNA gyrase A) 유전자의 254번째 염기서열에 사이토신(C)을 포함하거나 또는 265번째 염기서열에 구아닌(G)을 포함하거나 또는 266번째 염기서열에 아데닌(A)을 포함하거나; 또는 서열번호 61의 염기서열로 이루어진 GyrB(DNA gyrase B) 유전자의 1423번째 염기서열에 아데닌(A)을 포함하거나; 또는 서열번호 62의 염기서열로 이루어진 ParC(topoisomerase Ⅳ) 유전자의 242번째 염기서열에 사이토신(C)을 포함하거나 또는 253번째 염기서열에 구아닌(G)을 포함하는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 시프로플록사신(ciprofloxacin) 항생제에 대해 내성을 보이는 탄저균(Bacillus anthracis) 검출을 위한 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 PNA 프로브에서, 상기 GyrA 유전자 특이적 PNA 프로브는 서열번호 60의 염기서열로 이루어진 GyrA(DNA gyrase A) 유전자의 254번째 염기서열에 사이토신(C)을 포함하거나 또는 265번째 염기서열에 구아닌(G)을 포함하거나 또는 266번째 염기서열에 아데닌(A)을 포함하는 15~25개 염기서열로 이루어질 수 있고, 바람직하게는 서열번호 50 또는 서열번호 51의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 PNA 프로브에서, 상기 GyrB 유전자 특이적 PNA 프로브는 서열번호 61의 염기서열로 이루어진 GyrB(DNA gyrase B) 유전자의 1423번째 염기서열에 아데닌(A)을 포함하는 15~25개 염기서열로 이루어질 수 있고, 바람직하게는 서열번호 55의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 PNA 프로브에서, 상기 ParC 유전자 특이적 PNA 프로브는 서열번호 62의 염기서열로 이루어진 ParC(topoisomerase Ⅳ) 유전자의 242번째 염기서열에 사이토신(C)을 포함하거나 또는 253번째 염기서열에 구아닌(G)을 포함하는 15~25개 염기서열로 이루어질 수 있고, 바람직하게는 서열번호 59의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 GyrA(DNA gyrase A), GyrB(DNA gyrase B) 또는 ParC(topoisomerase Ⅳ) 유전자 특이적 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브와 GyrA, GyrB 또는 ParC 유전자 특이적 클램핑 프라이머 세트를 포함하는 시프로플록사신(ciprofloxacin) 항생제 내성을 가지는 탄저균(Bacillus anthracis) 검출을 위한 PNA 매개 클램핑 실시간 PCR(real-time PCR)용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 PNA 매개 클램핑 실시간 PCR용 키트에서, 상기 GyrA 유전자 특이적 클램핑 프라이머 세트는 서열번호 47 및 서열번호 48의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트일 수 있고, 상기 GyrB 유전자 특이적 클램핑 프라이머 세트는 서열번호 52 및 서열번호 53의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트일 수 있고, 상기 ParC 유전자 특이적 클램핑 프라이머 세트는 서열번호 56 및 서열번호 57의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 GyrA, GyrB 또는 ParC 유전자 특이적 클램핑 프라이머 세트는 실시간 PCR 그래프, 형광의 발색 크기와 PCR 산물의 크기 등을 확인하여 최선의 조합을 선택했을 뿐, 상기 프라이머 세트로 한정되지는 않는다.

또한, 본 발명은

(a) 상기 GyrA(DNA gyrase A) 유전자, GyrB(DNA gyrase B) 유전자 또는 ParC(topoisomerase Ⅳ) 유전자 특이적 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브와 GyrA, GyrB 또는 ParC 유전자 특이적 클램핑 프라이머 세트를 이용하여 대상 탄저균(Bacillus anthracis)의 GyrA, GyrB 또는 ParC 유전자에 대해 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하는 단계; 및

본 발명의 상기 방법은 PNA 매개 클램핑 실시간 PCR을 통해, PNA (클램핑) 프로브를 이용하여 야생형과의 증폭 사이클 차이만으로 항생제에 대해 내성을 보이는 탄저균을 검출할 수 있고, 다량의 야생형의 증폭을 완전하게 저해하여 변이형의 검출 민감도를 향상시킴으로써 극소량 섞여있는 돌연변이를 높은 민감도로 신속 정확하게 검출할 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 탄저균에서의 대상 유전자 선별

탄저균(Bacillus anthracis) 게놈 프로젝트(genome project)에 의한 NCBI 데이터베이스의 유전자의 염기서열 정렬로 비교 분석하였다. 탄저균에서의 항생제 타켓 유전자인 시프로플록사신(ciprofloxacin) 항생제 타켓 박테리아 타입 Ⅱ 효소(DNA gyrase(GyrA와 GyrB), 토포이소머라제 Ⅳ(ParC와 ParE))을 확인하여 염기서열을 분석하였다. 시프로플록사신 저항성은 효소 활성 자리 주변의 아미노산 서열의 변화에 의한 것으로 QRDR(quinolone resistance-determining region)의 유전자의 염기서열을 확인하고 일반균과 항생제 내성을 지닌 유전자의 염기서열 변이를 확인하였다.

탄저균에서 QRDR의 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 확인하고 기 보고된 논문의 항생제 내성 변이주의 염기서열을 비교하면, GyrA의 유전자 254번째 염기서열이 C (사이토신)이 T (티민)으로, 265번째의 염기서열이 G (구아닌)가 A (아데닌)로, 266번째 염기서열 A이 C로 변화되었으며, gyrB 유전자의 1423번째 염기서열이 A가 G로, ParC 유전자의 242번째의 염기서열이 C에서 A/T로, 253번째의 염기서열이 G에서 A로 변화된 것을 확인하였으며 GyrA 유전자의 단일염기서열 돌연변이/복합염기서열 돌연변이 및 GyrB와 ParC 유전자의 돌연변이를 포함하는 것이 확인되었다.

탄저균 약재 내성 변이주의 GyrA/GyrB와 ParC의 염기서열 변이

	gyrA		gyrB		parC
	Nucleotide	Amino acid	Nucleotide	Amino acid	Nucleotide	Amino acid
1	C254→T	S85→L	-	-	-	-
2	G265→A	E89→K	-	-
3	C254→T	S85→L	-	-	C242→T	S81→F
4	C254→T	S85→L	-	-	C242→A	S81→Y
5	C254→T	S85→L	-	-	G253→A	E85→K
6	C254→T	S85→L	A1423→G	T475→A	-	-
7	C254→T G265→A	S85→L E89→K	-	-	C242→T	S81→F
8	C254→T A266→C	S85→L E89→A	-	-	C242→T	S81→F

위의 표 1을 정리하면 탄저균의 단일염기서열 변이를 하나에서 세 개를 포함하는 8개의 돌연변이 조합이 되는 것을 확인하였다. 위에서 확인된 유전자들에 대하여 NCBI 유전자 데이터베이스를 이용하여 탄저균의 GyrA/GyrB와 ParC 유전자의 염기서열 및 아미노산의 서열을 확인하고 정렬 분석으로 각 타입별 유전자의 염기서열을 확인하고 기 보고된 대상 유전자의 염기서열 및 단백질 서열을 비교 분석하였다.

선별된 유전자는 실험군과 변형된 염기서열을 지닌 대조군 올리고핵산을 합성하여 대장균(E. coil) 균주에 클로닝하여 PCR 주형으로 사용하였다. 또한 실험군 유전자의 염기서열은 각 유전자의 염기서열 변이를 모두 포함하여 설계하였으며 그 변이와 합성된 유전자를 플라스미드에 클로닝하여 아래 표 2과 같이 제작하였다.

본 발명의 GyrA, GyrB 또는 ParC 유전자의 변형된 염기서열을 지닌 플라스미드 및 야생형 염기서열을 지닌 플라스미드 리스트

LMO 명칭	형성 plasmid 명칭	삽입 유전자 (크기 bp)	Mutation 위치
E-BA-gyrAW	pGEM-BA-gyrAW	gyrAW (nt1-660) (660bp)	wild type
E-BA-gyrAM	pGEM-BA-gyrAM	gyrAM (nt1-660) (660bp)	C254T G265A A266C
E-BA-gyrBW	pGEM-BA-gyrBW	gyrBW (nt1081-1740) (660bp)	wild type
E-BA-gyrBM	pGEM-BA-gyrBM	gyrBM (nt1081-1740) (600bp)	A1423G
E-BA-parCW	pGEM-BA-parCW	parCW (nt1-660) (660bp)	wild type
E-BA-parCM	pGEM-BA-parCM	parCM (nt1-660) (660bp)	C242T G253A

실시예 2. 실시간 PCR( Real - time PCR) 조건 최적화

각 세균의 선별된 유전자별 특이 프라이머와 프로브를 3셋트 정도를 디자인하여 각 셋트별 반응 농도, 반응 온도, 반응 시간, 합성 곡선 등을 확인하여 실시간 PCR 조건을 최적화하였다. 타겟 유전자에서 진단에 사용할 부위를 포함하는 프라이머를 디자인하고 conventional PCR을 통한 유전자를 합성하고 확인하고자 하였다. 각 유전자별 디자인한 프라이머의 염기서열은 표 3에 나타내었다. 정방향/역방향 프라이머 조합에 따라 유전자 합성 크기가 약 150-600bp의 크기로 다양하게 증폭될 수 있도록 하였으며, conventional PCR로 이 다양한 크기의 PCR 산물을 합성할 수 있는 동일한 조건을 선별하고자 하였다. 각 프라이머의 조합 및 그에 따른 PCR 합성 유전자의 크기는 아래 표 3 및 표 4에 나타내었다.

탄저균의 내성 변이주 진단을 위한 유전자별 프라이머 염기서열

구 분	명 칭	서열(서열번호)	크 기 (mer)	GC (%)
GyrA Forward	F1	cctgtgcatcgtagggtttt(1)	20	50.0
	F2	aaaacctgtgcatcgtaggg(2)	20	50.0
	F3	agccatgaaatgcgtacctc(3)	20	50.0
	F4	cgtgcattaccagatgttcg(4)	20	50.0
GyrA Reverse	R1	aatcttgcgccatacgtacc(5)	20	50.0
	R2	ccaaagttaccatgcccatc(6)	20	50.0
	R3	catgcccatcaacaagcata(7)	20	45.0
	R4	gctgccgctgaatctccatc(8)	20	60.0
GyrB Forward	F1	cgtcacttccaagcgatttt(9)	20	45.0
	F2	ggtgactctgccggtggatc(10)	18	65.0
	F3	gaaaaggcaagattagataa(11)	20	30.0
	F4	cgtgcattaccagatgttcg(12)	20	50.0
GyrB Reverse	R1	caaaatctccgccaatgttc(13)	20	45.0
	R2	gaatatgcgcaccatctacg(14)	20	50.0
	R3	catgttcaataatttgacgc(15)	20	35.0
ParC Forward	F1	cgttccgtaagtcggctaaa(16)	20	50.0
	F2	gtaactatcacccgcacggt(17)	20	50.0
	F3	gacgtattttatattctatg(18)	20	25.0
ParC Reverse	R1	gtgataatcgggcttccgta(19)	20	50.0
	R2	tccccgtcaacactaccatt(20)	20	50.0
	R3	ttattaccatgcatctcaac(21)	20	35.0

프라이머가 주형에 결합하는 온도를 결정하기 위하여 탄저균의 GyrA/GyrB, ParC 유전자를 이용하여 50-60℃의 gradient PCR 수행하였을 때, 50-60℃의 온도와 동일한 반응 시간에서 PCR 합성이 원활히 이루어지는 것을 확인하였으며, PCR 합성은 산물은 2% 아가로스 겔을 이용한 전기영동으로 확인하였다.

위의 실험 결과 conventional PCR은 어닐링 온도가 50-60℃에서 각 유전자의 PCR 반응이 원활히 이루어지는 것을 확인하였으며, 55℃에서 대조군과 실험군 유전자를 이용하여 conventional PCR 반응을 수행하여 대조군과 실험군의 PCR 산물을 비교하였을 때 대조군에서는 단일 밴드로 확인되었던 것이 실험군에서는 단일 이상의 밴드가 확인되는 프라이머 세트가 확인되었다. 이런 비특이적 PCR 합성 밴드가 확인되는 프라이머 세트는 실시간 PCR의 후보군에서 제외하였다. 따라서 선별된 conventional PCR의 조건은 다음 표 5와 같다.

선별된 conventional PCR의 조건과 상기 표 4의 프라이머 조합에 CYBR Taq-polymerase를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 위의 프라이머의 조합을 기준으로 각 유전자에서 프로브 위치를 선정하여 하기 표 6과 같이 3~7개를 디자인하였으며 실시간 PCR 기기를 고려하여 형광으로는 FAM, HEX, Cy5를 선택하였다.

탄저균 진단에 사용되는 프로브 염기서열

서열번호	구분	명 칭	서열(서열번호)	크 기 (mer)	GC (%)
1	GyrA	P-01	FAM cagcacgtattgttggtgaa BHQ1(22)	20	50.0
2		P-02	FAM accctcatggtgattcagc BHQ1(23)	20	55.0
3		P-03	FAM cctgtgcatcgtagggtttt BHQ1(24)	20	50.0
4		P-04	FAM ggtacgtatggcgcaagatt BHQ2(25)	20	60.0
5		P-05	FAM agctgaatcaccatgagggt BHQ1(26)	20	50.0
6		P-06	FAM ttcaccaacaatacgtgctg BHQ1(27)	20	45.0
7		P-07	FAM aaaaccctacgatgcacagg BHQ1(28)	30	50.0
8	GyrB	P-01	HEX tctaacgatgaagtgcgtacaa BHQ1(29)	22	45.0
9		P-02	HEX gtacgaacattggcggagat BHQ1(30)	20	50.0
10		P-03	HEX ctgcaattggtacgaacatt BHQ1(31)	20	40.0
11		P-04	HEX gagaaagctcgttatcataa BHQ1(32)	20	35.0
12		P-05	HEX catcgttagataagatttta BHQ1(33)	20	25.0
13	ParC	P-01	Cy5 ggtacgtttaagtcaaactt BHQ2(34)	20	35.0
14		P-02	Cy5 gtaactatcacccgcacggt BHQ2(35)	20	55.0
15		P-03	Cy5 accgtgcgggtgatagttac BHQ2(36)	20	55.0

각 유전자의 프라이머 조합과 위치에 따른 프로브를 조합하여 conventional PCR에서 확인된 어닐링 온도인 50℃와 55℃에서 각각 실시간 PCR을 수행하였다. 각각의 유전자의 실험군과 대조군이 되는 주형 DNA는 농도를 측정하고, 다시 실시간 PCR 반응을 통하여 실험군과 대조군의 Cp값으로 보정 후에 실험에 사용하였다.

어닐링 온도인 50℃와 55℃에서 각각 실시간 PCR을 수행하여 50℃에서는 유전자의 합성이 진행되지만 프로브가 유전자 주형에 결합하였다가 endo-nuclease에 의한 가수분해로 나타내는 형광 값을 보이지 않았다. 55℃의 경우 유전자 합성과 형광 값을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 실시간 PCR의 프라이머 및 프로브 어닐링 온도는 55℃로 결정하였다.

실시예 3. PNA 매개 클램핑 실시간 PCR 을 이용하기 위한 PNA 의 설계

본 실험은 위에서 결정한 실시간 PCR 조건을 이용하여 대조군 DNA와 유전자 변이 DNA를 구분할 수 있는 PNA를 디자인하여 대조군에서는 유전자 주형에 PNA가 완전한 상보결합으로 클램핑이 작용하여 더 이상 PCR 합성이 진행되지 않으며, 변이주의 경우 PNA가 유전자 주형에 결합하였다가 하나의 염기서열이라도 일치하지 않으면 Tm이 크게 감소하여 유전자 주형에서 떨어져 PCR 합성이 진행되는 성질을 이용하여 유전자의 염기서열 변이를 확인하고자 하였다.

탄저균의 타겟 유전자에서 염기서열 변이를 포함하여 PNA를 디자인하였으며 주)PANAGENE을 통하여 합성하였다. 일반적인 PNA는 약 18mer 이내의 길이로 합성하는데 이때 변이를 포함하는 염기서열이 PNA의 중앙에 놓이도록 디자인하는 것을 추천한다. 그러나 탄저균의 돌연변이는 GyrA와 ParC의 경우 10bp 간격을 두고 염기열의 변이가 존재하기 때문에 PNA를 하나로 디자인하면 변이가 중앙에 놓이지 않기에 두 가지 형태로 디자인하였다. 하나는 변이를 모두 포함하는 단일의 PNA로 돌연변이 염기서열을 모두 포함하는 형태로 디자인하고, 두 번째는 두개의 PNA로 각각 하나의 돌연변이를 포함하는 정방향 및 역방향 형태로 디자인하였다. 두 번째의 PNA는 PCR 반응 시에 두 개의 PNA를 혼합한다. 또한 동일한 염기서열의 PNA도 정방향 및 역방향 형태로 합성하여 반응에 보다 최적화된 PNA를 선별하고자 하였다. 합성된 PNA는 아래의 표 7과 같다.

탄저균 유전자 변이 진단에 사용되는 PNA 염기서열

구 분	명 칭	서열	구분	크 기 (mer)	GC (%)
GyrA	BA-gyrA-PNA-01	attcagctgtttatgaaa(37)	sense	18	27.8
	BA-gyrA-PNA-02	tttcataaacagctgaat(38)	anti-sense	18	27.8
	BA-gyrA-PNA-03	catggtgattcagctgt(39)	sense	17	47.1
	BA-gyrA-PNA-04	gtaccatcgtttcataa(40)	anti-sense	17	35.3
GyrB	BA-gyrB-PNA-01	gtgcgtacaattattac(41)	sense	17	35.2
GyrB	BA-gyrB-PNA-02	gtaataattgtacgcac(42)	anti-sense	17	35.2
ParC	BA-ParC-PNA-01	cgcacggtgattcctctg(43)	sense	18	61.1
	BA-ParC-PNA-02	tatatgaagcgatggtac(44)	anti-sense	18	38.9
	BA-ParC-PNA-03	gattcctctgtatatgaagc(45)	sense	20	40.0
	BA-ParC-PNA-04	gcttcatatacagaggaatc(46)	anti-sense	20	40.0

실시예 4. PNA 매개 클램핑 실시간 PCR 의 최적 조건

PNA는 반응액에 50pmole을 기본적으로 첨가하여 반응하였다. 그러나 탄저균의 GyrA 유전자의 PNA 03/04와 ParC 유전자의 01/02의 경우에는 하나의 유전자에서 각각의 돌연변이 염기서열이 포함되도록 디자인된 경우이므로 각각의 PNA를 50pmole로 첨가하여 100pmole로 사용하였다. 본 실험의 Taq-polymerase의 경우에는 바이오니아사의 AccuPower Plus DualStar qPCR PreMix를 사용하였다. 그 외 반응 온도에 따른 시간은 아직 적정 프라이머가 결정되지 않았으므로 최대 600bp의 유전자의 합성에도 충분한 시간(약 20초)을 선정하고, 추후 적정 프라이머 및 프로브가 결정된 후 합성 시간을 변경하고자 하였다.

프라이머 및 프로브의 농도는 최종 10pmole을 유지하였으며, 각각의 DNA는 플라즈미드 분리 후에 농도를 측정하여 10ng/ul로 희석하여 사용하였다. PNA 첨가한 실시간 PCR의 반응온도는 유전자 주형의 결합 온도인 70℃에 맞추어 수행하였으며, 프라이머와 유전자 주형의 결합온도 역시 55℃에서 시작하였다. PNA를 섞어준 실시간 PCR의 혼합 조건은 하기 표 8과 같다.

PNA를 이용한 실시간 PCR의 혼합 조건

template DNA (10ng)	1 ul
Primer (10pmole) forward	1 ul
reverse	1 ul
Probe (10pmole)	1 ul
PNA (10pmole)	5/10 or 0 ul
2×DualStar qPCR PreMix	10 ul
DW	ul
total volume	20 ul

대조군 유전자에 PNA를 첨가한 반응과 첨가하지 않은 반응을 비교하였을 때 PNA가 첨가되어 클램프로의 역할을 수행하는 반응값(Cp값)이 첨가되지 않은 반응값에 비해 높은 것이 확인되었으며 그래프 상으로도 오른쪽으로 쉬프트(shift)되는 것이 확인되었다. 또한 PNA의 결합온도를 68℃로 변경하였을 때에도 반응값의 차이가 70℃에 비해 크지 않은 것을 확인하였으며 처음 반응값(Cp)이 3~5 사이클 정도 늦게 도출되는 것을 확인하였다. 프라이머의 유전자 주형에 결합하는 온도는 55℃가 낮다는 자문에 따라 60℃로 변경하여 PCR 반응을 수행하였으나 반응의 결과값이 떨어지는 것을 확인하여 원래의 결합온도가 최적의 조건임을 확인할 수 있었다. 따라서 다음에 진행되는 모든 PNA 매개 클램핑 실시간 PCR 경우 PNA의 결합온도는 70℃로 프라이머의 유전자 주형과의 결합온도는 55℃를 기본 조건으로 다음 표 9와 같이 진행하였다.

일반화된 PNA 매개 클램핑 실시간 PCR 조건을 사용하여 유전자 변이를 선별하기 위한 최적의 PNA(directive/competitive PNA), 프라이머 및 프로브를 선별하기 아래 표 10, 표 11 및 표 12과 같은 조합으로 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.

실시예 5. 탄저균의 QRDR 관련 유전자 구분을 위해 PNA 매개 클램핑 실시간 PCR에 이용될 최적의 프라이머 , 프로브 및 PNA 의 선별

탄저균의 gyrA 유전자의 프라이머와 프로브의 조합이 91개로 PNA를 포함하면 273개의 경우의 수가 도출되었다. 273개의 조합 중에서 PNA에 대한 결과를 분석하면 단일 디자인의 PNA1(forward) 및 PNA2(reverse)가 포함된 반응에서 돌연변이 유전자의 반응값이 일반적인 유전자의 반응값보다 높은 것으로 보아 PNA가 유전자 주형에 결합하여 클램프의 역할을 수행하지 못하는 것으로 확인되었다. PNA3/4가 포함된 반응값의 차이는 프라이머와 프로브에 따라 다르지만 돌연변이주의 반응값이 더 낮으므로 반응에서 클램프 역할로 적정한 PNA는 PNA3/4로 선별하였다. 또한 프라이머와 프로브의 조합은 F3/R1/P6~7〉F3/R3/P3〉F1/R3/P6〉F4/R1/P7의 순으로 반응값의 차이가 구별되는 것을 확인되어 선별하였다(도 1).

또한, 탄저균의 gyrB 유전자의 프라이머와 프로브의 조합이 46개로 PNA를 포함하면 92개의 경우의 수가 도출되었다. 92개의 조합 중에서 PNA에 대한 결과를 분석하면 PNA1(forward) 및 PNA2(reverse)를 비교하면 PNA1과 PNA2에서 돌연변이 유전자의 반응값이 일반적인 유전자의 반응값이 낮은 것이 확인되었으나 PNA1의 경우 돌연변이 염기서열과 일반 염기서열의 반응값의 차이가 더 높으므로 PNA1이 PNA2보다 안정적으로 클램프 역할을 하는 것으로 확인되어 PNA1을 선별하였다. 또한 프라이머와 프로브의 조합은 F3/R2/P3〉F3/R3/P3〉NF/R3/P3〉NF/R2/P3, F3/R1/P3의 순으로 반응값의 차이가 구별되는 것을 확인되어 선별하였다(도 2).

또한, 탄저균의 ParC 유전자의 프라이머와 프로브의 조합이 21개로 3개의 PNA를 포함하면 63개의 경우의 수가 도출되었다. 63개의 조합 중에서 PNA에 대한 결과를 분석하면 PNA1/2, PNA3(forward) 및 PNA4(reverse)가 포함된 반응에서 PNA3이 포함된 반응값의 차이는 프라이머와 프로브에 따라 다르지만 돌연변이주의 반응값이 더 낮으므로 반응에서 클램프 역할로 적정한 PNA는 PNA3으로 선별하였다. 또한 프라이머와 프로브의 조합은 F3/R2/P1〉F1/R1/P3〉F1/R3/P3〉F3/R1/P3의 순으로 반응값의 차이가 구별되는 것을 확인되어 선별하였다(도 3).

따라서, 탄저균의 QRDR 관련 유전자 구분을 위한 프라이머, 프로브 및 PNA의 조합과 최종 PNA 매개 클램핑 실시간 PCR 조건을 정리하면 아래의 표 13과 같다.

탄저균의 내성 변이주 진단을 위해 선별된 유전자별 프라이머/프로브/PNA 염기서열

연번	구 분	명 칭	서열(서열번호)	크 기 (mer)	GC (%)
1	BA- GyrA	F3	agccatgaaatgcgtacctc(47)	20	50.0
2		R1	aatcttgcgccatacgtacc(48)	20	50.0
3		P-06	FAM ttcaccaacaatacgtgctg BHQ1(49)	20	50.0
4		PNA-03	catggtgattcagctgt(s)(50)	17	47.1
5		PNA-04	gtaccatcgtttcataa(anti-s)(51)	17	35.3
6	BA- GyrB	F3	gaaaaggcaagattagataa(52)	20	50.0
7		R2	gaatatgcgcaccatctacg(53)	20	50.0
8		P-03	HEX ctgcaattggtacgaacatt BHQ1(54)	20	40.0
9		PNA-01	gtgcgtacaattattac(55)	17	35.2
10	BA- ParC	F3	gacgtattttatattctatg(56)	20	25.0
11		R2	tccccgtcaacactaccatt(57)	20	50.0
12		P-01	Cy5 ggtacgtttaagtcaaactt BHQ2(58)	20	35.0
13		PNA-03	gattcctctgtatatgaagc(s)(59)	20	40.0

탄저균의 내성 변이주 진단을 위한 PCR의 혼합물 조성

template DNA (10ng)	1 ul
Primer (10pmole) forward	1 ul
reverse	1 ul
Probe (10pmole)	1 ul
PNA (10pmole)	1 or 0 ul
2×DualStar qPCR PreMix	10 ul
DW	ul
total volume	20 ul

실시예 6. 본 발명에서 개발한 PNA 매개 클램핑 실시간 PCR( PNA - mediated clamping real - time PCR ) 최적 조건을 활용한 약제내성 고위험 병원체 탄저균의 선별

PNA 매개 클램핑 실시간 PCR법을 이용한 탄저균의 약제내성 유전자 변이 검출 시스템 구축을 위하여 본 발명에서 선별된 항생제 관련 유전자의 프라이머, 프로브 및 PNA로 PNA 매개 클램핑 실시간 PCR를 이용하여 실제 탄저균을 이용한 약제 내성 탄저균의 검출 여부를 확인하고자 하였으나 국내에 변이 탄저균의 부재와 형질전환을 이용한 고위험병원체의 약재내성 변이주의 생성은 국제적인 협약 및 제한사항으로 인하여 수행하지 못하였다.

따라서, 본 발명의 탄저균의 유전자별 실험군(wild type DNA)과 대조군(mutant type DNA) DNA를 표 2에 기재된 변형된 염기서열을 지닌 플라스미드 및 야생형 염기서열을 지닌 플라스미드를 주형으로 사용하여 실제화된 PNA 매개 클램핑 실시간 PCR법의 검출 한계 및 민감도를 확인하기 위하여 각 유전자의 스탠다드 커브 및 카피 수를 계산하였다. 탄저균의 유전자별 실험군과 대조군 DNA 용액을 10ng으로 농도를 맞추고 이것을 단계별 희석하여 검출 가능 농도를 확인하였다(단계별 희석은 1:10).

유전자를 희석하여 PNA 매개 클램핑 실시간 PCR법을 45회로 수행하면 돌연변이를 포함하는 유전자의 반응값이 진행되고 돌연변이를 포함하지 않은 유전자는 PNA의 클램프 역할에 의하여 돌연변이를 포함하는 유전자에 비해 약 10회 후에 반응 값이 나타나게 된다(도 4 및 도 5). 따라서 유전자의 농도가 높을 경우 반응값이 낮은 사이클에서 나타나므로 돌연변이를 포함하지 않은 야생형의 유전자의 반응값도 빠르게 나타나게 된다. 탄저균의 gyrA, gyrB 및 parC 유전자의 야생형 및 돌연변이주의 PNA 매개 클램핑 실시간 PCR법에 의한 변이의 검출 최소 농도는 약 0.000001ng 정도로, 이 농도에서 돌연변이 유전자에서는 반응이 일어나지만 대조군에서는 반응이 일어나지 않으므로 서로 비교하기 편리한 이점이 있다. 그러나 전체 반응 사이클 수가 감소하게 되면 감별 한계에 도달하므로 고려하여야 한다.

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Claims

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서열번호 50 또는 서열번호 51의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 GyrA(DNA gyrase A) 유전자 특이적 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브와 서열번호 47 및 서열번호 48의 염기서열로 이루어진 GyrA 유전자 특이적 클램핑 프라이머 세트를 포함하는 시프로플록사신(ciprofloxacin) 항생제 내성을 가지는 탄저균(Bacillus anthracis) 검출을 위한 PNA 매개 클램핑 실시간 PCR(real-time PCR)용 키트.
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(a) 서열번호 50 또는 서열번호 51의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 GyrA(DNA gyrase A) 유전자 특이적 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브와 서열번호 47 및 서열번호 48의 염기서열로 이루어진 GyrA 유전자 특이적 클램핑 프라이머 세트를 이용하여 대상 탄저균(Bacillus anthracis)의 GyrA 유전자에 대해 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하는 단계; 및
(b) 상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭 결과를 분석하여 탄저균의 GyrA 유전자의 돌연변이 유무를 결정하는 단계를 포함하는 시프로플록사신(ciprofloxacin) 항생제에 대해 내성을 보이는 탄저균 검출 방법.
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