CN112029910B

CN112029910B - SARS-CoV-2病毒核酸检测方法

Info

Publication number: CN112029910B
Application number: CN202011061357.2A
Authority: CN
Inventors: 吴国球; 邹明园
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2040-09-30
Also published as: CN112029910A

Abstract

SARS‑CoV‑2病毒核酸检测方法，具体为序列如SEQ ID NO.1所示的基因和序列如SEQ ID NO.2所示的基因作为检测靶标在制备检测SARS‑CoV‑2病毒产品中的应用。本发明所提供的等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的SARS‑CoV‑2病毒核酸检测方法准确率高、操作简单，所需时间短。与RT‑PCR不同，由于本发明是无酶信号扩增系统，故无需用到成本较高的DNA聚合酶，故能明显降低检测成本，可适用于大规模的筛查和即时检测。可满足未配备RT‑PCR仪器的基层医院进行快速检测。

Description

SARS-CoV-2病毒核酸检测方法

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种利用等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的SARS-CoV-2病毒核酸检测方法。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019，COVID-19)。SARS-CoV-2感染是一个严重的全球性公共卫生问题，已在全球范围内造成严重的经济损失，导致世界卫生组织(WHO)将SARS-CoV-2爆发定性为国际关注的紧急公共卫生事件。由于目前尚未有治疗新冠肺炎的特效药或疫苗，故对疑似病例的早期筛查、对感染SARS-CoV-2患者进行隔离治疗是控制疫情的关键。目前，诊断SARS-CoV-2感染的金标准是逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)。自SARS-CoV-2的完整基因组发布后，来自不同国家的公共卫生实验室，临床实验室和诊断公司开发了多种用于SARS-CoV-2检测的RT-PCR方法，靶向病毒基因组中的不同基因和基因组区域(Orf1ab，RdRp，N，E等)。

然而，RT-PCR方法在实际应用过程中暴露出许多缺点和不足，尤其是在突发公共卫生事件(例如此次SARS-CoV-2爆发)期间。RT-PCR方法的操作繁琐，且需要由受过培训的专业实验室技术人员在PCR仪器上完成。这很难满足现场检测的需求，对于资源有限的偏远地区或基层医院，必须将检测样品运输到具备RT-PCR检测条件的上级医院进行检测。这不仅费时又增加了病毒暴露的风险。此外，在COVID-19大流行期间，由于多种原因，用于SARS-CoV-2检测的RT-PCR产生很高的假阴性率(30～50％)，这仍然是一个不可忽视的问题。

催化发夹型DNA自组装反应(catalytic hairpin assembly，CHA)是一种等温无酶核酸信号放大系统。根据被检测的目的RNA片段设计两组具有发夹结构的互补单链DNA探针。当目的片段不存在时，两组单链DNA均以发夹结构存在。而当系统中存在目的RNA片段时，在目的RNA的催化作用下，两组发夹结构的单链DNA探针会依次打开发夹结构，并形成DNA双链。整个催化过程中并不消耗目的RNA片段，目的RNA片段促发两组单链DNA探针形成双链后，继续进入下一轮的反应，因此形成信号放大。最后，通过检测双链DNA探针便可实现目的RNA片段的检测。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种SARS-CoV-2病毒核酸检测方法，可快速、廉价、高灵敏度地检测SARS-CoV-2核酸。该方法既不需要RNA提取也不需要RT-PCR检测的仪器，因此可实现SARS-CoV-2的即时检验。

技术方案：序列如SEQ ID NO.1所示的基因和序列如SEQ ID NO.2所示的基因作为检测靶标在制备检测SARS-CoV-2病毒产品中的应用。

检测SEQ ID NO.1所示基因的探针，序列如SEQ ID NO.3所示的O-H1和SEQ IDNO.4所示的O-H2，H1的5’端修饰有地高辛，H2的5’端修饰有生物素。

检测SEQ ID NO.2所示基因的探针，序列如SEQ ID NO.5所示的N-H1和SEQ IDNO.6所示的N-H2，H1的5’端修饰有地高辛，H2的5’端修饰有生物素。

SARS-CoV-2病毒核酸检测方法，步骤为(1)咽拭子取样，并将拭子头浸入含3mL添加含有裂解盐的病毒保存液的取样管中；(2)分别取200μL上述的待测标本，分别加入到含有50nM O-H1和150nM O-H2的Orf1ab基因检测管，和含有50nM N-H1和150nM N-H2的N基因检测管中；充分混匀后，置于50℃水浴锅中，水浴反应30分钟；(3)水浴后，取150μL上述反应液分别滴加在免疫分析试纸条的加样孔中，1-2分钟后，将分析试纸条插入荧光检测仪，读取检测线和质控线的荧光值。

上述含有裂解盐的病毒保存液组成为137mM NaCl，5.4mM KCl，0.25mM Na₂HPO₄，0.44mM KH₂PO₄，1.3mM CaCl₂，1.0mM MgSO₄，4.2mM NaHCO₃。

有益效果：本发明所提供的等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的SARS-CoV-2病毒核酸检测方法准确率高、操作简单，所需时间短。与RT-PCR不同，由于本发明是无酶信号扩增系统，故无需用到成本较高的DNA聚合酶，故能明显降低检测成本，可适用于大规模的筛查和即时检测。可满足未配备RT-PCR仪器的基层医院进行快速检测。

附图说明

图1为等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的SARS-CoV-2病毒核酸检测方法的示意图。A表示催化发夹型DNA自组装反应的具体步骤；B表示免疫分析试纸条检测Dig和Bio双修饰的H1-H2杂交双链的原理。

图2本发明设计的探针检测的靶向区域位置及序列。

图3为非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证催化发夹型DNA自组装反应用于检测SARS-CoV-2的Orf1ab基因片段和N基因片段的可行性分析结果。泳道1～6分别为H1探针、H2探针、H1，H2探针混合物、H1，H2探针混合后退火处理产物、H1、H2探针与目的DNA片段混合物、H1、H2探针与非目的DNA片段混合物

图4为等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的SARS-CoV-2病毒核酸检测方法的灵敏度分析结果。本发明的最低检测浓度为50aM。

图5为等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的SARS-CoV-2病毒核酸检测方法的序列特异性分析结果。目的片段出现单碱基或双碱基突变后，检测的荧光值显著降低。SMTD表示单碱基突变，DMTD表示双碱基突变。

图6等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的SARS-CoV-2病毒核酸检测方法对临床标本的检测结果。SARS-CoV-2阳性患者的Orf1ab和N基因的检测线荧光值均在1000以上，而SARS-CoV-2阴性的健康人群的检测线的荧光值为0。

图7为本发明检测流程示意图。

具体实施方式

实施例1检测探针冻干粉的制备

本发明根据已公开的SARS-CoV-2序列进行多序列比对，筛选出Orf1ab基因和N基因中长度为21个碱基的保守序列作为检测靶标。序列分别如下：

分别根据Orf1ab基因和N基因的保守序列设计两组探针，分别记为O组和N组。O组以Orf1ab基因为靶标，设计对应的探针序列分别为O-H1和O-H2；N组以N基因为靶标，设计对应的探针序列分别为N-H1和N-H2。上述两组探针的H1的5’端均标记地高辛(digoxin，Dig)，而H2探针则的5’端则用生物素(Biotin，Bio)修饰。上述的探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成、纯化。相关序列见下表(表1)：

表1：本研究所用探针序列

将所制备的探针分别用TAE/Mg²⁺缓冲液溶解至100nM/L后，进行退火处理，让各探针保持发夹结构，退火温度为：从95℃以1℃/min的速度缓慢降温至25℃。退火处理后，分别取将H1探针和H2探针用TAE/Mg²⁺缓冲液稀释成50nM/L和150nM/L。分别取200μL稀释后的O-H1和200μL释后的O-H2混合于EP管中；同理制备N-H1和N-H2的混合液。将上述两组探针混合物至于真空冻干机做冻干处理。

实施例2等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的SARS-CoV-2病毒核酸检测方法灵敏度分析

根据选定的检测序列(图2)合成单链DNA，用于分析该系统的检测灵敏度。以Orf1ab和N基的保守区为检测靶点，合成单链DNA，同时，根据靶向序列随机生成随机序列作为对照组。将合成的DNA片段分别用TAE/Mg²⁺缓冲液稀释成100μM/L，再分别用正常健康人群的咽拭子标本液进行梯度稀释(50nM～100fM)。分别取200μL梯度目的DNA溶液，加入到O基因和N基因探针冻干粉中，充分混匀后，至于50℃水浴锅中反应30分钟。反应结束后，取150μL反应液滴加在免疫分析试纸条(由南京东纳生物科技有限公司制备)加样孔中，1-2分钟后，荧光分析仪读取检测线(T-line)和质控线(C-line)的荧光值。结果如图4所示，以阴性对照荧光值的均值+3个标准差设置Cutoff值。根据Cutoff值可知，本发明的检测方法的灵敏度(即最低检测浓度)为50aM。

实施例3等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的SARS-CoV-2病毒核酸检测方法特异性分析

根据选定的检测序列(图2)合成单链DNA，并随机生成2个单碱基突变序列(记为SMTD1和SMTD2)，随机生成2个双碱基突变序列(记为DMTD1和DMTD2)，再根据靶向序列生成完成随机序列，记为non-target DNA。分别合成单链DNA，序列分别如表2所示。将各序列分别用TAE缓冲液稀释成50nM的待测溶液，取200μL上述待测液标本分别加入到Orf1ab和N基因检测探针冻干粉中，充分混匀后，至于50℃水浴锅中反应30分钟。反应结束后，取150μL反应液滴加在免疫分析试纸条(由南京东纳生物科技有限公司制备)加样孔中，1-2分钟后，荧光分析仪读取检测线(T-line)和质控线(C-line)的荧光值。结果如图5所示，本发明的检测方法具有高度的序列特异性，单碱基突变即可引起检测荧光值的明显下降，其荧光值与双突变和完全随机的对照序列相当。

表2序列特异性研究中使用的序列

表注：突变位点以下标线标记

实施例4等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的SARS-CoV-2病毒核酸检测方法用于临床样本检测

取3例经RT-PCR证实的SARS-CoV-2感染的患者的痰液标本，及3例经RT-PCR证实无SARS-CoV-2感染的痰液标本作为阴性对照。痰液标本经痰消化液消化后，分别取200μL加入到Orf1ab基因检测探针冻干粉中和N基因检测探针冻干粉中，充分混匀后，至于50℃水浴锅中反应30分钟。反应结束后，取150μL反应液滴加在免疫分析试纸条(由南京东纳生物科技有限公司制备)加样孔中，1-2分钟后，荧光分析仪读取检测线(T-line)和质控线(C-line)的荧光值。结果如图6所示，3例SARS-CoV-2阳性患者的痰标本的平均荧光值为1283.4±66.4(Orf1ab基因)和1051.9±73.5(N基因)，均在1000以上。而3例对照组的Orf1ab基因和N基因的检测值分别为12.6±3.7和9.1±2.8。SARS-CoV-2阳性的标本检测的Orf1ab基因和N基因荧光值较对照组均有统计学差异(P<0.001)。结果表明，本发明的等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的SARS-CoV-2病毒核酸检测方法可用于检测SARS-CoV-2。

序列表

<110> 东南大学

<120> SARS-CoV-2病毒核酸检测方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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<211> 43

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Claims

1.序列如SEQ ID NO.1所示的基因和序列如SEQ ID NO.2所示的基因作为检测靶标在制备检测SARS-CoV-2病毒产品中的应用。

2.检测SEQ ID NO.1所示基因的探针，其特征在于：序列如SEQ ID NO.3所示的O-H1和SEQ ID NO.4所示的O-H2，所述H1的5’端修饰有地高辛，所述H2的5’端修饰有生物素。

3.检测SEQ ID NO.2所示基因的探针，其特征在于：序列如SEQ ID NO.5所示的N-H1和SEQ ID NO.6所示的N-H2，所述H1的5’端修饰有地高辛，所述H2的5’端修饰有生物素。